分子生物学检查7版课件

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学检查,南方医院实验诊断学教研室,温淑娟,分子生物学检查,1,1,基因诊断,2,流式细胞术及其临床应用,3 染色体检测,1 基因诊断,2,1 基因诊断,一、基因诊断在实验诊断中的位置,二、基因诊断在临床诊断中的必要性,三、基因诊断的原理、途径,四、基因诊断在临床医学中的应用,1 基因诊断一、基因诊断在实验诊断中的位置,3,临床医学实验诊断技术的发展,细胞形态学技术,(细胞形态和/或数量),生化检验技术,(生物化学代谢产物和酶),免疫学诊断技术,(识别特定蛋白质分子的差异),分子诊断技术,(DNA/RNA和蛋白质),临床医学实验诊断技术的发展细胞形态学技术,4,基因诊断的检测对象和其在诊断中的位置,转录 翻译 分泌和表达,DNA,核膜mRNA 蛋白 细胞膜功 临床,能性产物 表现,核酸诊断 生化诊断 血清学诊断 临床诊断,（基因诊断） （酶法测定） （血清蛋白）,基因诊断可以更早、更本质地反映生理、病理状况,基因诊断的检测对象和其在诊断中的位置基因诊断可以更早、更本质,5,基因诊断的实验诊断对象,先天遗传性疾患,后天基因突变引起的疾病,外源基因侵入致病,基因诊断的实验诊断对象先天遗传性疾患,6,基因诊断的原理,运用现代分子生物学和分子遗传学方法检查基因的结构及其表达功能是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。,基因诊断的途径,基因突变的检测,基因连锁分析,基因表达分析,基因诊断的优点,病因诊断，针对性强；快速；灵敏；特异性高,基因诊断的必要性,-不可替代,基因诊断的原理,7,基因诊断的常用技术,一、,聚合酶链式反应,二、DNA测序,三、核酸分子杂交技术,四、单链构象多态性分析,五、单核苷酸多态性分析,六、连接酶链式反应,七、基因芯片技术,基因诊断的常用技术一、聚合酶链式反应,8,聚合酶链式反应（PCR),PCR？,PCR的原理,PCR的技术特点,反转录PCR,荧光PCR,PCR在临床医学中的应用,聚合酶链式反应（PCR)PCR？反转录PCRPCR在临床医学,9,PCR,(Polymerase Chain Reaction),聚合酶链式反应,是模拟DNA体内,复制过程，在DNA聚,合酶作用下，进行,特定DNA片段的体外,复制。,PCR(Polymerase Chain Reaction,10,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、,复性,变性、,复性,PCR扩增原理引物延伸延伸5533变性、复性变性、复,11,PCR的技术特点,特异性强(几乎没有方法学的假阳性),灵敏度高,简便快速,对样品要求低,PCR的局限性,PCR的技术特点特异性强(几乎没有方法学的假阳性),12,RT-PCR(,反转录-,PCR)（reverse transcription-PCR）,模板选用的是RNA通过逆转录酶聚合而成的cDNA,模板cDNA是一条单链，在反义引物的引导下合成第二链模板DNA，此时才开始常规的PCR扩增,在RT-PCR中，模板量及所抽提的RNA极其重要,可进行一步RT-PCR或两步RT-PCR(巢式或半巢式）,RT-PCR(反转录-PCR)（reverse trans,13,病原体,DNA,RNA,PCR,裂解抽提,扩,增,产,物,检,测,核酸纯化,PCR检测流程,RT-PCR,凝胶电泳,酶切分析,杂交,核酸序列分析,PCR扩增及产物分析,病原体DNARNAPCR裂解抽提扩核酸纯化PCR检测流程RT,14,PCR产物电泳图,p,1 2 3 4 Marker,270 bp,PCR产物电泳图p 1 2,15,荧光PCR,荧光PCR,16,Oligo 1: Fluorescein,Oligo 2: LC Red 640,Excitation,Emission,Transfer,荧光共振能量传递（FRET Probe）,Oligo 1: FluoresceinOligo 2: L,17,R,Q,5,3,5,3,5,3,5,3,Excitation,R,Q,Q,R,Q,R,Excitation,双标记探针（Taqman Probe）,RQ53535353ExcitationRQ,18,FQ-PCR反应原理,特异性荧光双标记探针,Taq酶,53外切酶活性,FQ-PCR反应原理特异性荧光双标记探针,19,荧光PCR仪,荧光PCR仪,20,FQ-PCR实时动力学曲线,FQ-PCR实时动力学曲线,21,分子生物学检查7版课件,22,FQ-PCR的技术特点,封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性,可定量检测，扩展了临床应用空间,光谱技术进一步提高了灵敏度可检测单拷贝基因,荧光探针杂交，进一步提高了特异性,扩增与自动分析一体化，检测更加简便快速,FQ-PCR的技术特点封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致,23,PCR在临床医学中的应用,早期诊断,病情评估和预后判断,抗病毒药物疗效的观察、指导,新药验证,输血源的筛选,母婴传播的控制与观察,遗传疾病的诊断,肿瘤的诊断,PCR在临床医学中的应用早期诊断,24,核酸分子杂交技术,核酸分子杂交？,常用的,核酸分子杂交技术及应用,核酸分子杂交技术核酸分子杂交？,25,常用的,核酸分子杂交技术及应用,Southern印迹杂交-DNA印迹,Northern印迹杂交-研究RNA的方法,斑点杂交-狭缝杂交。,DNA、RNA均可检测,原位杂交-检测,DNA或RNA同时还可对其进,行细胞及基因组内定位,常用的核酸分子杂交技术及应用 Southern印迹杂交-,26,分子生物学检查7版课件,27,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism)SNP,指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。,SNP在人类基因组中广泛存在。是人类可遗传的变异中最常见的一种。,基因芯片技术逐步应用于SNP检测，使大规模进行SNP检测成为可能。,单核苷酸多态性（single nucleotide pol,28,SNP的意义和应用,疾病连锁分析和未知致病基因的定位,疾病的关联分析,复杂疾病或过程的基因定位,法医学应用,SNP的意义和应用疾病连锁分析和未知致病基因的定位,29,疾病发生的分子遗传机制的阐明环境因子,易感基因的检出,药物基因组学研究,器官移植配型和物种进化的研究,疾病发生的分子遗传机制的阐明环境因子,30,基因芯片,Gene Chip,原理,：是将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。,基因芯片Gene Chip 原理：是,31,分子生物学检查7版课件,32,基因芯片技术的应用,优生方面：避免许多遗传病的发生,疾病诊断方面：,器官移植、组织移植、细胞移植方面的基因配型,病原体诊断,基因芯片技术的应用优生方面：避免许多遗传病的发生,33,2 流式细胞术及其临床应用,流式细胞术,流式细胞仪组成及其工作原理,流式细胞术的临床应用,2 流式细胞术及其临床应用流式细胞术,34,流式细胞技术,流式细胞技术是在流体状态下观察细胞状态的一种技术,能够对细胞或微球的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测,分类收集细胞,流式细胞技术流式细胞技术是在流体状态下观察细胞状态的一种技术,35,流式细胞仪,流动室和液流系统,激光源和光学系统,光电管和检测系统,计算机和分析系统,细胞分离纯化系统(有细胞分选功能时),流式细胞仪流动室和液流系统,36,流式细胞技术工作示意图,流式细胞技术工作示意图,37,流式细胞仪,流式细胞仪,38,分子生物学检查7版课件,39,分子生物学检查7版课件,40,流式细胞术的临床应用,免疫学,：免疫活性细胞的分型与纯化、淋巴细胞亚群与疾病关系的分析、免疫缺陷病的诊断、器官移植后的免疫学监测,血液学,：白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一,肿瘤学,：鉴别良恶性肿瘤，预测预后，评估化疗药疗效,分子生物学:,可在单细胞水平进行基因的表达、调控及功能研究。,流式细胞术的临床应用免疫学：免疫活性细胞的分型与纯化、淋巴细,41,3,染色体检查,染色体检查在临床医学上的意义,1、判定男女,3染色体检查 染色体检查在临床医学上的意义,42,分子生物学检查7版课件,43,3,染色体检查,染色体检查在临床医学上的意义,1、判定男女,2、诊断遗传病,3、优生优育,4、有助于白血病的诊断和分型,3染色体检查 染色体检查在临床医学上的意义,44,正 常 女 性 核 型 图,正 常 女 性 核 型 图,45,染色体检查的基本步骤,取材：主要采取外周血白细胞、皮肤组织、绒毛组织、羊水细胞、骨髓,细胞培养：加入丝裂原获分裂细胞，制成染色体标本,显微镜下进行初步的染色体观察和分析照相并进行核型分析,讨论分析结果并作出诊断报告,染色体检查的基本步骤取材：主要采取外周血白细胞、皮肤组织、绒,46,染 色 体 图 象 分 析 系 统,染 色 体 图 象 分 析 系 统,47,人类染色体数目或结构畸变导致的遗,传性疾病称染色体病。,共同的临床特征,：,先天性多发畸形、智力低下、生长发育迟缓和皮肤纹理改变。性染色体异常的患着还将出现内、外生殖器异常或畸形。,人类染色体数目或结构畸变导致的遗,48,先 天 愚 型 核 型 图,先 天 愚 型 核 型 图,49,先 天 愚 型 患 者,先 天 愚 型 患 者,50,Turner综合征核型图,Turner综合征核型图,51,Turner综合征患者,Turner综合征患者,52,4P三体综合征,4P三体综合征,53,4 P三体综合征,4 P三体综合征,54,谢谢,谢谢,55,