蛋白质结构分析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 蛋白质结构分析,药渡雅谜阐琴酶颅师藩末轿夯谗然灸模千罕梭诛监处滞距亲埠狸梧对贾贞蛋白质结构分析蛋白质结构分析,第一节 蛋白质样品的准备,进行结构分析的蛋白质样品，一般要求纯度95。这样的样品，通,常是用色谱和电泳精制过的。,一、SDSPAGE纯化的样品,从SDS-PAGE上分离的蛋白质必需经过特殊处理，使SDS浓度低于,0.0005，否则SDS会影响到胰蛋白酶的酶解，也会大大降低HPLC分肽,时的分辨率。有报道指出，在2molL尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白,质时，如果SDS浓度0.05，则完全阻止了胰蛋白酶和内肽酶Lys-C的,作用。,虽然有报道用HPLC或用盐酸胍沉淀除去SDS，但不易掌握，尤其是共,价结合到蛋白质分子上的SDS分子更难除去。,在SDS-PAGE后，采用电印迹(blotting)到PVDF膜上，也是常用的方,法，因为PVDF膜结合蛋白质能力的专一性远远超过其结合盐、氨基酸和,去垢剂，因此，蛋白质能和这些“污染物”分开。经过这样处理后，能用于,BrCN化学裂解或酶解。,却程誓彝窘滇限看劫迄碎几软钾隘破佑蝉滋旋蝎歌靛砖基搞阿筹语佯不碌蛋白质结构分析蛋白质结构分析,二、HPLC纯化的样品,如果样品是用反相HPLC纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，它们在,真空离心干燥或冻干样品时除去；如果蛋白质是用离子交换HPLC或疏水,HPLC或凝胶过滤HPLC精制的，则样品要进行脱盐。,脱盐或稀蛋白溶液的浓缩可用0.1三氟乙酸(TFA)乙腈(ACN)系统,的短柱反相HPLC；也可采用一次性的Sek-Pak，因为蛋白质是水溶性,的，所以先用能与水互溶的甲醇或乙腈(2ml)润之，再用5ml纯水洗,涤；然后样品液体通过Sep-Pak柱时，蛋白质保留在柱上，小分子的盐,类流过柱体，用水溶液充分洗涤后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白质。,小的超滤装置对浓缩蛋白质也是有效的。此外，有机溶剂或TCA沉淀,也可以考虑。,三、蛋白质样品中的二硫键和巯基(一SH),当蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也除得比较“干净”，在进行,酶解前，还要转变半胱氨酸残基成其他的稳定的衍生物。因为半胱氨酸,的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键，,因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。,常用有碘代乙酸烷化，因为这个反应是快速和专一的；同时这类试剂,保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂的矫作物(artifact)容易得到放,射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了其在水溶液中的,溶解度。胱氨酸也可在还原后再修饰。,倪皆蹬挎蚜渗二铬邹辙堂紧掸核邑械辅踩奖坎闹恐鞘冯归种巍之妓捆爹臃蛋白质结构分析蛋白质结构分析,1还原和羧甲基化,将1 20mg蛋白质溶解在含6mol/L盐酸胍的0.1mol/LTris-,1mmol/LEDTA的缓冲液中，pH8.3，加DTT至2mmol/L或再多一些,(过量于存在于蛋白质中的二硫键)，通氮气，然后迅速封闭，37,反应,1h，再加入50mmol/L的碘代乙酸(已用NaOH中和)，其量为1.1倍(分,子比)过量于溶液中的巯基数(蛋白质中的一SH和DTT中的一SH总和),典,型为4.55mmol/L，再次充氮气，于暗处37,保温1h。加2巯基乙,醇至最后浓度1(V/V)结束反应，然后对50mmol/LNH,4,HC0,3,，含,0.01硫二甘醇(thiodiglyc01)充分透析，冻干。,注意：碘代乙酸必须是无色的，如果有碘存在，呈淡黄色，会引起巯,基迅速氧化，阻碍了烷化反应，而且可能有副反应，使色氨酸修饰。,碘代乙酰胺(iodoacetamide)也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸残基的,烷化。这常用于避免牛胱氨酸被导入负电荷，而用中性的碘代乙酰胺。,另一种情况是变性剂不用盐酸胍，而用SDS，这时如果用碘代乙酸，反,应往往进行得很慢，而且不完全，这是因为碘代乙酸的负电荷和蛋白,质SDS胶束(微团)上的负电荷相互排斥。,2还原和吡啶乙烯化,用4乙烯吡啶(4-vinylpyridine)处理同上，通氮气保温过夜。,弯蟹俏癸献地浦呆写花镇框露爱甥砸漱比甄捻棠陨酉豢望瘪琢或进下猫奉蛋白质结构分析蛋白质结构分析,第二节 蛋白质的化学裂解,裂解于甲硫氨酸(Met),溴化氰(BrCN)是首选的化学试剂，专一裂解在甲硫氨酸的羧,基端，对多数蛋白质裂解效率为90以上。,BrCN在酸性条件下，,裂解在甲硫氨酸的C端肽键上，将甲硫氨酸转化成高丝氨酸,()(homoserine)和高丝氨酸内酯(I)(homoserinelactone)的混合物，,它们之间也能相互转化，如图2.1所示。,寿罩裴枝送菊整做粥泪咋呕摊楚织杰珐魏沏悉包缎颁悦诊快市于草夷躯秤蛋白质结构分析蛋白质结构分析,对Met-Thr、Met-Ser键，则常常是低产率的，可能是,羟基产生下,面的一系列反应(和)，最后形成高丝氨酸残基(V)，而未裂解此肽,键，如图2.2所示。Met-Cys键也不易裂解。,湃台噪旗肩淡族烩犹俯筛鲁带丑卫舱谁辈酞疑腐骸翌墩朵多挽然忠筑蒜秉蛋白质结构分析蛋白质结构分析,典型的反应常常在20,、70甲酸(V/V)中进行24h，,副反应是部分Asp-Pro键会断裂，一些酰胺基团会部分丢,失，部分Asn-Gly会产生重排或环化，有时Trp会氧化。,操作：蛋白质先用5巯基乙醇在pH 8.0室温下处理,24h，加色胺(tryptamine)或色氨酸(以每分子甲硫氨酸加,5分子色胺或色氨酸计算)以防止色氨酸氧化。,蛋白质以15mg/ml浓度溶解在70甲酸中，加入50倍,过量，小体积的BrCN/70甲酸，通氮并置于暗处，室温,放置1624h，结束后加15倍体积的水，冻干，重复加水,冻干。,辙绣妮继死斡契辑摸凿嫩擎春东轻赁辱脱怯馆呐绳括镰网十邀芯钵确么摇蛋白质结构分析蛋白质结构分析,靛狂蜂扛优塌婴箕逛箔斡总赴各移沥盂竞涧范怜院续蹋抉刁喳腺毋桑奈肯蛋白质结构分析蛋白质结构分析,第三节 蛋白水解酶酶解,一、 常用蛋白水解酶,(1)胰蛋白酶(trypsin),专一作用在Arg和Lys(碱性氨基酸)的羧基端，但对Arg-Pro和Lys-Pro,键没作用。,我们常将胰蛋白酶配成1mg/ml，贮存在1mmol/LHCl中，-20,保存数月，而未观察到酶的活性损失。如果样品溶解度差，可适量加入尿,素增加溶解度，因为胰蛋白酶在2mol/L尿素中，仍具有充分的活性。,(2)胰凝乳蛋白酶(,-chymotrypsin),专一作用在芳香族氨基酸的羧基端。,(3)内肽酶Lys-C(endoproteinase Lys-c),专一作用在Lys的羧基端。,(4)V8蛋白酶(staphylococcal protease),专一作用在Asp和Glu(酸性氨基酸)的羧基端。pH 8.0的磷酸缓冲液,时，作用在Glu-X和Asp-X；pH 4.0的乙酸缓冲液时，仅作用于Glu-x,键。,蛰埠盛时棚粟摄押敛啤赫调谚嫩腊帖吻奖沂玖伏涧槐枝夷凭张鼓寞刘膜蚊蛋白质结构分析蛋白质结构分析,(5)梭菌蛋白酶(clostripain),专一作用在Arg的羧基端。,(6)凝血酶(thrombin),专一裂解在Arg-Gly键上，在纤维蛋白原工作中，很大程,度上还依赖于邻近氨基酸序列。近来还常用作融合蛋白的裂,解点。,(7)其他,还有专一性较广的胃蛋白酶(pepsin)、枯草杆菌蛋白酶,(subtilisin)、木瓜蛋白酶(papain)、嗜热菌蛋白酶,(thermolysin)等。,应该指出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均从胰脏制备，常常不,易完全分开，而是你中有我，我中有你，专一性不佳，易造,成混乱。应采购TPCK胰蛋白酶(抑制了胰凝乳蛋白酶活,性)和TLCK胰凝乳蛋白酶(抑制了胰蛋白-酶活性，才能保,证酶的专一性。,村训具馈写屑甫蛇咸违乔泵氟殊疤寻更衷肩顺种娩蛆端拈搐汇香送比颁懊蛋白质结构分析蛋白质结构分析,二、 酶解操作条件,将30,l,(100,g)蛋白质，100mmol/L,NH,4,HCO,3,，pH 8.5，5mmol/L DTT，50,作用,15min，在冷至室温后，加5,l 1,00mmol/L碘代乙,酸，室温15min，加60,l,水，最后加酶5,l,蛋白样品:酶=25:1(质量比)，37,保温20-24h，,冻干样品或直接注射样品(用稀TFA酸化至约pH 2.5),到反相HPLC柱中分析。,素埋太蛛顷游咨浇嫌胎赌阳蔫钩刁托醇己炯靴兔躇袁夹忿腐座芯沃晋娱抒蛋白质结构分析蛋白质结构分析,三、 讨 论,(1)蛋白质的量和浓度,酶解不能正常进行的主要原因之一是蛋白质的量不足。精确定量蛋白,质是必需的，一般用氨基酸分析来定量微量的蛋白质。,蛋白质浓度通常要求500,g/ml，最少不得低于100,g/ml，否则酶,的消化难以进行，体积在50100,l,。,(2)缓冲液、盐和去垢剂,酶作用可以被缓冲液中的各种因子所抑制或完全阻止。在标准的,2mol/L尿素，0.1mol/L NH,4,HCO,3,系统中，SDS含量为0.0005,时，就会影响酶的消化。0.005SDS会减少许多酶解肽段的产量。类,似的，染料考马斯兰和两性电介质也会阻止酶的消化。高浓度的盐,(1mol/L NaCl)也会影响蛋白水解酶的活性；2mol/L以上浓度的尿素,会影响羧甲基化和蛋白酶的消化。,(3)羧甲基化,Stone等报道，转铁蛋白用酶解时，羧甲基化的转铁蛋白酶解很好，,而没有羧甲基化的转铁蛋白，酶解程度很差。,据卜穿渐险尝跃细洗贩眷友犯佯坦贩片均吟救捆轰辱吓穗伸砰霸握别剐窖蛋白质结构分析蛋白质结构分析,(4)蛋白酶的量,酶和蛋白质的质量比为1:25，如果分子质量大,的蛋白质(6万Da)，则比例要减低至1:50。胰蛋,白酶要用序列级的商品。,(5)原位酶解,将SDS-PAGE上的蛋白质样品从凝胶上解析下来,是很困难的，文献报道有很多方法，但实用性差。目前流行的方法是将蛋白质电印迹,(blotting)至PVDF类的膜上，直接进行序列分析或,直接在膜上进行酶解，后者称为原位分析(,in,situ,)。,筐码诛狂诣屑疟陨绿调扰屉错肪有拂顽借件榴狸贞皱白授筷救誉颠水搔桌蛋白质结构分析蛋白质结构分析,原位酶解操作如下：膜片剪成lmm细条，放在Eppendrof管中,加,1.2ml 0.5(m/V)PVP-40/0.1mol/L HAc，37保温30min，,PVP-40的作用是阻止在酶解时蛋白酶吸附到硝酸纤维素膜上，除去,PVP-40后，用水充分洗涤膜至少5次以洗净残留的PVP-40(因为PVP-,40有很强的紫外吸收，在RP-HPLC中，PVP-40于30一40有机溶,剂浓度时洗下来，它在215220nm有很高的吸收，在260289nm,吸收很小)，所以在HPLC前需完全除去。膜片再用酶解时的缓冲液漂,洗，然后进行酶解，一般蛋白酶在100mmol/L NH,4,HCO,3,:CAN,=95:5，pH8.2，37酶解过夜，对V8蛋白酶则在100mmol/L磷酸,钠:ACN=95:5，pH 7.8，室温过夜。酶与底物之比为1:10至1:20(质,量比)；对亚微克级样品，酶与底物之比高达2:1。酶解后-20保存或,立刻用数微升10TFA酸化，上样到HPLC柱上分析。,蝇针鹅弃喂脯字迹眩窟奔休丈卵轧督能辰掇著库孔吴妓拓捞写重技焰茎辩蛋白质结构分析蛋白质结构分析,(6)限制性酶解,限制性酶解有助于蛋白质测序时的序列演绎。最著名的例,子是核糖核酸酶(RNase)，它被枯草杆菌蛋白水解酶在pH,8.0下作用，活性没有变化，但出现一个新的N端丝氨酸。用,AmberliteIRC-50离子交换柱，0.2mol/L pH6.25的磷酸,钠缓冲液可分离到一个大片段(S蛋白)和一个小片段(S肽)。,也可用三氯乙酸(TCA)沉淀法，沉淀部分是S蛋白，上层,液部分是S肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。,蹦酷掸障剔检霍制洛拔首墨摸撵阵饵棠佑挖精啼驴恕绑蛆茂捅蓖液矾骗蓬蛋白质结构分析蛋白质结构分析,第四节 蛋白质中存在着封闭的N端,有些蛋白质的N端是封闭的，尤其在腹水细胞中，80的蛋白质的N,端是乙酰化的，因此用Edman法不能直接测定其序列，要用一系列的化,学或酶处理。,如果在蛋白质/肽序列仪上测定不到序列，蛋白质的量肯定又是足够,的，则可在仪器上进一步用含水TFA(三氟乙酸)处理样品，使蛋白质酸,水解成许多肽段后再测序，这时会有很多PTH-氨基酸出现，以此反证此,蛋白质的N端是封闭着的，再用下述方法除去封闭着的N端。,首先，用温和的酸处理可以除去甲酰化的甲硫氨酸(f-Met)，也可能,引起丝氨酸、苏氨酸的乙酰化N-O重排反应。如果酸处理后还是测不到,序列，则进一步用焦谷氨酸氨肽酶除去蛋白质N端上的焦谷酰基；假设,这一方法仍不见效，再用较强的酸处理或其他酶处理。虽然有乙酰氨基,酸释放酶(acylaminoacid-releasing enzyme，AARE)，但它不能作,用长度在20个氨基酸残基以上的蛋白质或肽。因此，封闭的蛋白质首先,裂解成小肽，再用AARE处理除去N端上的乙酰化氨基酸转变成n-1肽，,然后n-1肽的序列再用Edman法测定。,酋脐循堤奔酿柳雅馅屎磁平伊容技嘎县乏抖脱明桅豫频屑饯楞共焦韵奈垫蛋白质结构分析蛋白质结构分析,一、除去蛋白质中封闭的N-乙酰丝氨酸和N-乙酰苏氨酸,样品置于1.5ml的聚丙烯离心管中，加无水TFA，密闭，40保温,1h，然后打开管盖，让TFA挥发，干燥，再进行序列分析。,二、除去N-甲酰甲硫氨酸,样品置于1.5ml聚丙烯离心管中，加30,l,0.6mol/L HCl，密闭，,25水解24h，打开管盖，真空除去HCl，然后进行序列分析。,以上两种温和酸水解除去甲酰或乙酰氨基酸，这与时间、温度、酶浓,度有很大关系，过分的酸水解会引起蛋白质中肽键的断裂，如对酸不稳,定的Asp-Pro键；相反，条件不够，则封闭的N端基团水解不完全，导,致测序的起始点不均一。,三、除去N端的焦谷氨酸残基(pyroglutamate),样品在序列仪上测不出N端，则将载有样品的膜片转移至1.5ml聚丙,烯微量离心管中，用0.5PVP-40洗膜片(见上节原位酶解部分)，再加,100,l焦谷氨酸氨肽酶(5,g于50mmol/L磷酸钠pH7.0，含10mmol/L,DTT)37酶解510h，用水洗膜，干燥，放回序列仪分析。,美橱浊署决晰床廖周浮竣赣饺释来曝粉崖元影惠巷扩距唁拂找镣凑侵伪怜蛋白质结构分析蛋白质结构分析,五、选择性纯化N端封闭的肽,蛋白质用胃蛋白酶(pepsin)或嗜热菌蛋白酶(thermolysin)作用后,(但不能用胰蛋白酶!)，酸化到pH2，上强酸性阳离子交换柱(例Dowex,50mmX2mm，H,+,型)。所有含游离氨基或其他碱性基团的肽都结合至,柱上，仅缺少碱性基团的肽通过柱泄出。如果N端是封闭着的(没有游离,的N端氨基)，同时因用专一性很广的酶作用，肽较小又不含组氨酸、赖,氨酸、精氨酸则可在排出液中发现N端封闭的肽。,此技术的局限性是：大肽(甚至含有碱性基团)可能不结合到树脂上，,因为它们不渗入树脂孔径内；相反，一些疏水的肽，特别含有色氨酸残,基，即是它们缺少游离的N端氨基，也可能结合到柱上。此外，如果存,在碱性基团非常靠近N端，胃蛋白酶作用不能除去，则该技术也不见,效。,应该指出，N端为谷氨酸的肽在极端pH下会环化而转变成封闭，需加,以小心。近年来，由于质谱(MS)在生物样品检测中有了长足的发展，可,用MS精确测定分子质量的方法来判断封闭的N端为何种基团。,钞别完怪耶洗尚宽掀眩职蜘尽王几剥微珠走盲查饭裕祁耀双尸哮符缅部黑蛋白质结构分析蛋白质结构分析,第五节 蛋白质中的C端残基的测定,一、羧肽酶法,羧肽酶是最常用的方法，对一些小肽而言，C端有时最容易测定的，,如胰蛋白酶酶解肽段时总是以Lys或Arg为C端；BrCN裂解的肽总是以,高丝氨酸(homoserlne)为C端；V8蛋白酶酶解的肽总以Glu或Asp为C,端。虽然有非专一的情况，但毕竟出现的概率很少。,羧肽酶酶解是从C端开始，一个一个地从C端释放出氨基酸残基，这,是个动态的释放过程。有的氨基酸释放快些，有的氨基酸释放慢些。对,小肽的C端序列测定问题不大，但对长肽的序列测定，由于对不同氨基,酸残基释放的速度不同，对后面一些氨基酸的序列判断，可能会出现错,误。在这方面不如化学降解法。,C端序列分析是在酶解的不同时间间隔，取出一定量的反应物停止反,应后，用氨基酸分析定量氨基酸来排列出其序列，近来用质谱法测定C,端序列。,惦鳞袍些噪植走独脉背启睫工皮歌足闹喘区桓毁夫顿窒袭寒花备玛垦标盈蛋白质结构分析蛋白质结构分析,(1)羧肽酶A(CpA),此酶释放非极性氨基酸速度快，释放His、Thr、homoserine也很快，释放,Asp、Set、Met sulphone则缓慢，释放Lys也较慢，但在高pH下则速度加快,点；酸性氨基酸的释放也较慢，对Pro和Arg基本上不起作用。倒数第二个氨基,酸残基影响水解速度，但对这一现象作一归纳或解释是很困难的。,此外，如何保证CpA不污染有内肽酶也是一个很重要的问题，通常用二异丙,基磷酰氟(Diisopropylfluorophosphate，DFP)处理以抑制丝氨酸蛋白酶的活,性。CpA在低离子强度下是不溶性的，通常以悬液形式存放于4,。使用前将酶,悬浮在水中，离心除去上层液，上层液中可能含有游离的氨基酸，而沉淀部分,溶于少量2mol/L NH,4,HCO,3,中，此CpA加到变性的底物蛋白质中(10-,100nmol，pH 8.5，0.2mol/L N-ethylnorpholine HAc)，酶和底物的分子,比为1:100，如果底物在此缓冲液中不溶解，则可在1SDS(V/V)或6mol/L,尿素中进行。有时加正亮氨酸(norleucine，1mol/mol蛋白质)为内标。溶液,在25保温，隔0.5，1，4，16h，取一定量反应液(1-5nmol)，加等体积,1mol/L HAc停止酶作用，离心除去蛋白质，上层液真空干燥，然后残余物溶在,氨基酸样品缓冲液中进行氨基酸分析。以正亮氨酸作校正，同时有相同程序的,空白对照。,如果在酶作用短时间后就释放出大量的氨基酸，则改用低的CpA浓度和作用,短时间(5，10，20，60min)取样；相反，如果只有少量氨基酸释放，则可加,大酶/底物的比例，或37,作用更长的时间。,景蜗涧企韦替概锤病摄避瘦纺沽木阔杠酶捡介到鄂锈瑰晾描佩村默键讯臼蛋白质结构分析蛋白质结构分析,(2)羧肽酶B(CpB),从蛋白质/肽的C端释放Lys和Arg，CpB存放在20,时，非常稳,定。,(3)羧肽酶Y(CpY),目前CpY有更广泛的专一性和通用性，一般讲它作用底物C端的疏水,性氨基酸快些，作用于带电荷的氨基酸慢些。此酶很稳定，某些金属离,子(例如Cu,2,，Hg,2,)抑制酶活性。CpY制剂中可能污染有酵母蛋白酶,A，这时可加胃蛋白酶抑制剂(pepstain)抑制，也可用EDTA抑制。CpY用量一般为底物的1/501/100，在25,作用，于不同时间,取反应液酸化后分析游离的氨基酸。,(4)羧肽酶P(CpP),CpP是种酸性羧肽酶，它贮存在pH 5.5的50mmol/L吡啶醋酸缓冲,液中，于-20,，6个月内非常稳定。其作用于pH2.5的100mmol/L吡,啶甲酸缓冲液中。,械饲扦我呻扎送密敞恭蔑律尿熟盆沸庭缠栽蚤跨南丢讫昏咙彭庶喂愉菌最蛋白质结构分析蛋白质结构分析,二、 化学降解法,早年的化学降解法只能测定一个C端氨基酸，远远不能满,足需求。而羧肽酶法虽能测到35个序列，但这是一个动,态演绎的方法，有可能错判。十多年前，蛋白质化学家就,开始用类似Edman降解法从C端逐个测定氨基酸序列，每次,国际蛋白质会议都有报道，直到1995年才有商品仪器供,应。目前C端序列仪一般只能测定5个氨基酸残基左右(这,和蛋白质的性质有关，有些可测到10个左右)，在nmol水平,上；这与N端序列还有很大的差距(目前N端序列仪灵敏度在,10pmol，可测到50个循环),鸥旬乾慌闭圈汁题崭合炬革闸批沈几间酶逆前囚诉擂伪农睬省店病分强伟蛋白质结构分析蛋白质结构分析,第六节 蛋白质中一些特殊肽段的检出,一、含巯基肽的分离纯化和分析,巯基在蛋白质性质、结构和功能中具有重要作用，因此,含巯基肽段的鉴定是蛋白质化 学不可缺少的部分。文献上含,Cys的肽常用同位素标记的碘代乙酸处理，羧甲基化，然后,在HPLC肽谱分析时跟踪有标记的肽段。鉴于用同位素在国,内不很方便，我们用4-乙烯吡啶标记蛋白质中的半胱氨酸，,酶解后的肽谱，除用214nm检出外，同时还用254nm检,出，只有被4-乙烯吡啶修饰的肽在254nm才有吸收，所以,能方便地检出。,瞧罐勒逃锻淑见荷坚拈蕉主卡哆食朗屋躁阴棋濒楔钓熟八类链琶辆豪骏饮蛋白质结构分析蛋白质结构分析,二、 含芳香族氨基酸肽的分离纯化和鉴定,(一)引 言,蛋白质在280nm有特征性的高吸收，这主要是芳香族氨基酸(色氨,酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的贡献。蛋白质在酶解后的肽谱中，检测波长不,用280nm，而采用214-220nm，这是由于肽键的强吸收缘故。肽谱中,不含芳香族氨基酸的肽，在280nm下，基本上没有吸收峰，但含有色氨,酸或酪氨酸的肽，则在280nm下却表现出强的吸收峰。据此，我们可以,辨别含芳香族氨基酸的肽。,此外，含芳香族氨基酸肽的二阶微分光谱也和一般肽的二阶微分光谱,有明显的差别。在碱性条件下(pH12.5)，Tyr离子化的二阶微分,光谱与Trp的二阶微分光谱完全不同，特别在260nm。但这样的条件对,酸性的HPLC反相柱显然是不合适的。,捕纵餐魄搓褪荔贤撩蚀襄霸丛秸煞健帮蚌渣我誉妻茅照烹裕窟房杆菩叠误蛋白质结构分析蛋白质结构分析,三、含Lys-肽的分离纯化和鉴定,赖氨酸的,-,氨基可以和磷酸吡哆醛(PLP)形成Schiff,碱，该衍生物在325rml有特殊的吸收，利用这一性质可找,出含有Lys残基的肽段。,(一)引 言,蛋白质中的赖氨酸残基常常与生物活性密切有关。例如醛,缩酶(ALD)中的Lys-227和同位素标记的磷酸二羟丙酮反应,后，经NaBH,4,还原可以形成Schiff碱。此时酶分子上可测定,到等克分子数的放射性，同时酶的催化活性丧失。,用同位素标记肽比较麻烦，Shapiro则发现醛缩酶中,Lys-117和磷酸吡哆醛(PLP)反应，并经NaBH,4,还原也可以,形成Schiff碱，酶活性受抑制，但修饰后的醛缩酶仍可和底,物结合。由此推论Lys-107是一次要活性部位。,用PLP作用的优点是避免用同位素，PLP修饰在Lys残基,上形成的肽，在325nm有一特殊吸收。因此，这种技术对,制备和分离Lys-肽具有普遍意义。,龄雷因扑拳茧堵玻入别浇嚷梳送栏旷羔歌事诉顾栏侥厄吭粤著女揣员定泵蛋白质结构分析蛋白质结构分析,附录一 微量蛋白质实验室注意事项,(1)环境,由于是微克级的操作，实验室内的温度、灰尘、纤维、皮,肤和头皮屑都会影响结果。,(2)吸附,玻璃容器的表面吸附，由于量少，会使大部分物质被吸在,壁上在溶液中的量趋于零。,用透析袋，少量蛋白质(100,g,)会因吸附作用而导致严,重损失。建议用微量透析仪器，或用小的凝胶过滤柱脱盐，,甚至用挥发性溶剂，避免脱盐。,推荐储存少量肽(10nmol)在小的玻璃管(5mmX50nm),中，避免转移和表面吸附引起的损失。,冻干样品时，如果用大的器皿，则用硅烷化处理；有时,候，宁可存放样品在聚丙烯管中。,腿仆导靖趁润用盎棚瞅渐战掸寿裂茂捆镊嗅泰愤官歼烘草衫安搬煤僵设凶蛋白质结构分析蛋白质结构分析,(3)样品加祥和转移,小量样品采用称量是不精确的，因为有的样品含盐易吸,湿。蛋白质/肽溶在适合的小量溶剂中(例5,l,)，用510,l,进行分析，而且建议用玻璃的微量注射针筒，这比用微量可,调加样器精确得多。,吡啶-乙酸-水是相当好的蛋白质/肽的溶剂，但吡啶在,280nm有很高的光吸收，影响到紫外定量和HPLC的检出。,此时，较大的酸性肽可溶在NH,4,OH，NH,4,HCO,3,，有些蛋白,质/肽在此溶剂中不溶解，则可用酸(70甲酸，或TFA)，,并尽快在真空干燥后于-20保存。为防止在过程中空气泡,的喷出而使样品丢失，开始可用水泵抽10min，直至溶解在,水中的空气泡逸出后，再用油泵真空干燥。,(4)反应,小体积的溶液，先用微量离心机使样品集中在底部，加入,试剂后迅速密闭防止小体积溶剂的挥发，然后涡旋，样品和,转移均用微量注射器,。,哨咆域盏黍奇妈盐囱员休莆蔫筒怕睁斟撼哆阎阑尺赌烘活丫汲叁饱伯电丝蛋白质结构分析蛋白质结构分析,附录二 常用试剂处理,(1)水,在我们实验室采用Mini-Q水。必须指出：即使用Mini Q,水也要新鲜，长期存放的Mini Q水，在HPLC空白时，也会,有峰出现。,(2)溴化氢(cyanogen bromide，BrCN),应新鲜配制，完全无色才能用。平时密闭保存在20 。,(3)盐酸胍(Guanidium chloride，GuHCl),推荐用Schwarz/Mann Biotech公司的超纯级产品。纯,化方法见文献,(4)6mol/L盐酸,浓盐酸加等体积水，重蒸三次，去除前后馏分。此产品通,常认为是6mol/L(或5.7mol/L)的HCl。,(5)尿素,尿素溶液在放置时，特别在碱性pH下，会有氰化胺,(ammonium cyanate)积累，故应用新鲜配制尿素溶液。,氰化胺除去的方法：溶液通过一混合离子树脂的小柱，,1Lmol/L尿素溶液需10g树脂，开始流出柱的两个柱体积的尿,素丢弃不用。,姨嘛药吗待酸锌姿绪烹野档憋劣桔氯堰婉啡狱缝涪睦颖获轰涪蹄几息束孟蛋白质结构分析蛋白质结构分析,