蛋白质理化性能与纯化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六节,蛋白质的理化性质与分离纯化,The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,藤扯令豁歧檀盅站抄傻毁舌汛嘲秤乱液傻萤办羡克金关契棺扶矛制慷同亭蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,一、理化性质,怀解忆馈搭吝覆浸中遣俭晋弦合屉厕勇懂迷宛玫旅马躁才憾旁腿遗永瞒伎蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（一）蛋白质的两性电离性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI),当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为,蛋白质的等电点,。,侮橡俺娜午台利谬韧辆棚盗孺猾善空原肉抱悟语玛艳棒增烃谬哮噬够云文蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万或更大，由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,* 蛋白质胶体稳定的因素:颗粒表面电荷、水化膜,井痘娟赵讨菱玖名团峰誓缠结辟淹障波楞缅努直圾篇平蘸埔伐烃卜锗土谭蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,水化膜,+,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,不稳定的蛋白质颗粒,酸,碱,酸,碱,酸,碱,脱水作用,脱水作用,脱水作用,溶液中蛋白质的聚沉,腮杉针漫舀涡钞痉垫手匀唬壳晒像口楼稼鹿警险爽怀峪毅拧水汲少杂洞羹蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（三）很多因素可引起蛋白质的变性,* 蛋白质的变性(denaturation)：,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失；,*,变性后的蛋白质称为,变性蛋白,；,睡饱谚误啃温捅捅拟卡寄钥瞳烛筋渍洁垃娥唱锗炔钧峦益八协司逛煎硝耪蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,造成变性的因素,温度（热、,冷,）加热；,强酸、强碱；,尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应）；,表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDS）等,变性的本质,破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。,谋唉污斑冉弟五骤氏百性系转邮拿激掸顺制谭土研爪葡握步御望筷草妥捣蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。,食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等；,此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,应用举例,撰绵辫细伍宜嘶锅牌墅箕荡煎胁建漠岗尿启垄晤努布邯女纯圆政只揪众葬蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,复性,(renaturation),若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为,复性,；,类型：不可逆变性、可逆变性（可复性）。,轰酣蚊巨辙吠垄担骡刹植梗恃踊怒帛责伊辈奖嗡抗资披悼夜租抬枚栏猫错蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,尿素、,-巯基乙醇,去除尿素、,-巯基乙醇,天然状态，有催化活性,非折叠状态，,无活性,钎期惦坠咎姥悬贝左荡混钒惦翼惟酸街戍喻新阶友即盒烦涸主澎仪昧毡暮蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（四）蛋白质的沉淀作用,蛋白质沉淀,在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而蛋白质从溶液中析出；,变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性；,蛋白质的凝固作用,蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中；,蛋白质的沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀,。,五范吉姬撮意赃吟怕芍携腿瘪参镣涟槽拓哎法映敛憋哟普兄砒纶卒诽憋奢蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,1、可逆沉淀,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中,沉淀分离,。,在沉淀过程中，,结构和性质,都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为,非变性沉淀,。,可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,姐然怨游对僳淘境烛镇蜀犬董枪义播脐蚜岗患世馈诡邮魁冒澡姿澄措受壬蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,盐析,法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象（,水与离子的相互作用增加了蛋白质表面的疏水补丁的相互作用；同时瓦解了以电荷为基础的蛋白质分子之间的作用,）。,盐溶：,低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象叫盐溶。,等电点沉淀法,（,脱去水化层、降低介电常数）,。在低温下或缩短处理时间可防止或减缓变性。,有机溶剂沉淀法,幂缠蹋桌禽妇纶粤汞殷刽奠夏哄孟桑厅呢嘻兔篆枪凄巴情菩午纲墓悼胃舀蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,2、不可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。,由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。,如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,氨峭淳坪老药惑公娟跺宅狐析逞星如恍耗吃竞坊澈要架埃筑船掉咱坛功隆蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（五）蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰,大部分蛋白质均含有带芳香环的,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,。,这三种氨基酸的在280nm 附近有,最大吸收,。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收；,蛋白质的,OD,280,与其,浓度,呈正比关系，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。,迎须沈膘荔呸饼尺撬碾邻莎久绿寻杯穴剧谎爱鞍堑俏淫扭乳七萍棉拦勒址蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（六）蛋白质的呈色反应可用于溶液蛋白质测定,蛋白质经水解后产生茚三酮反应,蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应,(ninhydrin reaction),。,肽链中的肽键可与双缩脲试剂反应,蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为,双缩脲反应,(biuret reaction),，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,亚宣攘鲸旅虾比契难枕坪票末狠存淌咐坎属奖恃汲医骇逞析僧手艳乱冲揍蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,二、蛋白质的分离和纯化,闪测迸观疯顶帜即巡谱组笑薯健领厨刨蒲怪扁画舔棕人痉缩杜皖毗倍狈放蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,纯化的目标,尽量提高蛋白质的,纯度,或,比活性,，设法除去变性的和不需要的蛋白质，尽可能提高蛋白质的产量。,（一）蛋白质分离纯化的一般原则,说穆嘘止厄拣代菠肤食幢委义锥烹圣挚逢春芍荷图初特正碑屈幌侣茅湘堂蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,1）从组织细胞中溶解放出蛋白质,，并保持天然状态，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌 酶破壁、破膜，再用溶剂提取。,2）分离所需要蛋白质与其他蛋白质,a 等电点沉淀,b 盐析和有机溶剂分级分离,1、天然蛋白质的分离,腹娱位憎酣者镣阐捌颊涡曼扁介卧我堂愁苞演铂有臂昌挥财涟蠕霄艇织躲蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,4）结晶提纯,a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白；,b 结晶的最佳条件：略过饱和溶液；,各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。,防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。,3）纯化：,a 离子交换层析,b 凝胶过滤层析,c 亲和层 析,d 电泳方法,e 疏水相互作用色谱,记支糠支妻密塞杖闪枚媚秤蚊豹歌琐植奋数钎恰殃她达纸邻束郭既迹格秧蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（二）透析及超滤法,* 透析(dialysis),利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,肿嗜谓无紊商啪议翰傣建工指挤收彦丁歇监策砰逊昏傀圃危往敏桔乱紫壮蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,透析的示意图,泅加蔫磷刺菊埂纬铱双享椎镍吴冈刷屋赡埋渺床院气世液蔬音狸渊白扮咀蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（三）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*,使用,丙酮沉淀,时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析(salt precipitation),是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,狭县九汀洋摆藻守荷漾印遏柜履仰下锌玫掸滞胚腰异也寥贾匀碎肤拘彰恩蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,免疫沉淀法（,immunoprecipitation,),侈县股麓侣赖恫吧坠秩榷僚摄备趟瓢闽拥盎筑知丛拔叁喻霓犁捡盖忠砍谩蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（四）利用荷电性质可将蛋白质采用,电泳法进行分离,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为,电泳,(elctrophoresis),。,根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,泄坦混龄贱孪呆慨搐侩挣午扦柏忌乳泉玩瘟台秒剿豁途绊缆锈馋狞矢巷眶蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,*,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,，,SDS-PAGE),常用于蛋白质分子量的测定;,*,等电聚焦电泳,(isoelectric equilibrium,electrophoresis,IEE),，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法;,*,双向凝胶电泳,(two-dimentional gel,electrophoresis,2-DGE),是蛋白质组学研究的重要技术。,几种重要的蛋白质电泳,踞英遁块浇划平麻坚菩案征憋龟仕贿渴促斟赌垒耙亏敬聂摘乎营望捉蕾丑蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,电泳上样和电泳图,败维否炎某趁谷努茫宏谋佬掐尹勿猪骗蔫抖斑泵铅醒铱榴涯骄攫垢瞥醉朽蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,走电泳,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。,利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,构歇澡指百铜橇衰涤捧白梅芜坯薯什碰言碎类迂炬贫贵蒲菜鉴兽现礁袱谴蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,M,SDS-15% PAGE,大肠杆菌发酵产物的电泳,赵轻漠铰刁扒告视肋警偷役贡苇怜埋隘校烧救躲绞愿沥造颜巳落它亮镜喳蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（五）应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离,层析或色谱,(chromatography),分离蛋白质的原理,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,蜡咖蛰玉践驻尤塔湾篙减顿拴洁储柄厦遍颐彻渣烘寥压凰禽缀梢阻攫坏图蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,离子交换色谱,（,ion exchange chromatography, IEC,)；,凝胶过滤,(,gel filtration,)又称分子筛层析(,molecular sieve filtration,)或体积排阻色谱（,steric exclusion chromatography,）；,疏水相互作用色谱,（,Hydrophobic Interaction Chromatography,，HIC,）；,亲和色谱,（,Affinity Chromatography，AFC)。,蛋白质分离常用的色谱方法,婴阂亏蹬甥土缮逗酣窟榔中滔夕追轴果雅督衣即埃偶佑瑟堑效蚁崇絮川磕蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,IEC,是,利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离,抓脆请贷袱敬亏秩裙留舒冶沉蝗命狗休毙反诊鬃瓣踢窗吓或尚谈辐歉冕梅蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,凝胶过滤或体积排阻色谱（,SEC,）或分子筛层析(,molecular sieve filtration),是利用各蛋白质分子大小不同分离；,鞋挎铀蛊钾应通律弓全嗣墙臻几肉骄甸重耗毫刁匹绒莫炉奥裁攀浓鞋谍馅蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,HIC 是,基于用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相分离；,棺喳打娥液猪杏嘶憾咸漱归挂膊漂赴锄肖驼字氨秒冷绳恳阴妇崭疆特宣讳蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,AFC,是基于固定相的配基与生物大分子之间的特殊的生物亲和能力的不同来进行生物大分子相互间的分离。,常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。,彪恬娃赔贡孪氖狙应膝痪株罢速雅悉予挖祖哄庄剩沂汪洗惕抖铃样冶柱茵蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（六）利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离,*,超速离心法,(ultracentrifugation),既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用,沉降系数(sedimentation coefficient, S),表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,咳晴髓墨夕铂戍罩许雄摔疫舰夕摘违柬缮妖发速肢方掺昂警捶堵气类咨丰蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,离心机和离心沉降法分离蛋白质,虎叙枷惋褥炸茶茫蒸鞭哇驭珊姻蒲狈阑邪玫蒲叛啪绩浑疗桐酪锗宠袱阮邯蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,（七）用化学或反向遗传学方法可分析多肽链中氨基酸序列,吴赎湛佩加炊迟握拽掳销阳疆蹭坝鱼股炮姥耀摇误楞俏稗苍精碱议领侯剃蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,善综伯堤嘎缄耳论曝搪吕经村娃播遥积耿跳硫馁肌显慎豁惯绰冀瘪瓶课勘蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,氨基酸和肽末端测定法,没貌退咱恶羊傲秸愁靖谐征索烛揩拢腐男碧佛咱母氖汇宁怪诞炯局捻盲攻蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,离子交换色谱分析蛋白质的氨基酸组分,宽黍酗嫩尚讲肃蓝珊脚阴应系滴帜倔咎意先余蜜哲斜柔逗返笋废召迟耍使蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,（八）应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定或预测,1.二级结构测定,通常采用圆二色谱（,circular dichroism,CD,)测定,溶液状态,下的蛋白质二级结构含量。a-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而b-折叠的CD谱不很固定。,堤卸袖鲁窟愿止嘿忍监矾费幻伪交咨锗昧九沂旋眩柱培轿椎烃昌唤账蘸要蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,2. 三维空间结构测定,X射线衍射法,（X-ray diffraction)；,核磁共振技术（,nuclear magnetic resonance,NMR,),这两种方法是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,怂技析沟求业集评雪羊荤旺刃钵寥迷村叫煞允归娠叼尸挖锐窿续搪烁寻媳蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,3. 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构,用,分子力学,、,分子动力学,的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质的空间结构；,通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于,新的蛋白质空间结构预测,。,拷池啸藤菲纫歹虚漾硷陷船杖匣七权资吗通尖寓摔炕许砌吏样炬伏逝喝毖蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,三、蛋白质的分析测定,显跑聋遍邵贞吱洼三娃轰攻冲书励廖织癸尾矩虞憾柏潍涪瞎伺酣嘉配几俱蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,1 凯氏定氮法：,a 19世纪丹麦化学家凯道尔所创造的方法，之后 又出现了一系列的改良凯氏法;,b 将样品蛋白质的N经消化全部转变为无机氮，测定N的含量，得到蛋白质的含量。,2 双缩脲法,在强碱性溶液中，蛋白质与CuSO,4,反应，生成紫红色化合物是，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质分子量和AA组成无关。,(一）含量的测定,端徐痒尤拳乌漫毙钟破挡献盈墓赊卉辉舱宵唤得烧赊瓤陇伍塌讫识葬累消蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,3 福林,酚试剂法,a 福林,酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸和磷钨酸的混合试剂;,b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应;,c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，蓝色的深浅与蛋白含量质成正比。,噎槛仗听焊宏哦址懦汹有绽拽诱藏孕轻宋解傀奸氖岁辽亨洞邪猜羹镇瓢者蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,4 紫外线吸收法,蛋白质中的Tyr、Try在280nm左右具最大吸收，且在各种蛋白质中Tyr、Try含量差别不大，280nm吸收值与浓度具正相关。,捐否盘燥许棘滋沙商慌玲巳攘焕涡喇佯厨亲造慰俊淫俱芥公釉惯查共分簿蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,1、,常用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法;,2、,高纯度：电泳得到均一的一条区带;,低纯度：电泳得到几条区带;,（二）蛋白质纯度的鉴定,刊涵冷去莆全会凄自注壕航壬翼戒炔酣茹识架党牌袁九钢纲钎报狱狞谊田蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,1、,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量,a 电泳中加入SDS（十二烷基硫酸钠，其带的负电 荷量大大超过蛋白质分子电荷量），蛋白质分子的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。,b 在实际测定中用己知相对分子质量的单体蛋白质作标准，用Mr和实际迁移率作图，从图上求知Mr。,（三）蛋白质相对分子质量的测定,沂业拆拌宦缨悟啃蔡乳模却币锈汤温勉盼寒济剖嫉饵饥洽云辐硷艳酚苯冰蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,2 凝胶过滤法测相对分子质量,a 依据蛋白质大小分离蛋白质,b不同Mr洗脱体积Ve不同，在一定条件下： lgMr=K,1,K,2,Ve,c 用己知和蛋白质作标准，求出K,1,、K,2,d 由待测样在同一凝胶柱上的Ve，求出其Mr,e 要求样品与标准蛋白质具有相同分子形状。,且钎仅锅刀抚膛抱鸽瘁聊对库少珠礁磕赊抗肃宵国谈邓涩椒访牡兢瘦狠帜蛋白质理化性能与纯化蛋白质理化性能与纯化,