禽流感血清学诊断课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验五,禽流感的血清学诊断,（血凝与血凝抑制试验）,实验五禽流感的血清学诊断（血凝与血凝抑制试验）,实验课内容,1,2,3,4,5,6,7,禽流感概述,病原分离,实验原理,器材与试剂,病原分离,接种鸡胚,HA-HI,实验课内容1234567禽流感概述病原分离实验原理器材与试剂,禽流感病毒（,AIV）,感染禽后可引起各种综合征，从无临诊症状感染到呼吸道疾病和产蛋下降，到死亡率接近100%的严重全身性疾病。,迄今为止，,高致病性,AIV,都是,H5,和,H7,血清亚型,，而所有其它亚型毒株对禽类均为低致病性（,MP）。,病禽和带毒禽是主要传染源。鸭、鹅等和野生水禽在本病传播中起重要作用，候鸟也可能起一定作用。感染途径为呼吸道和消化道。本病虽无明显季节性，但常常以冬春季多发。,流行病学,禽流感病毒（AIV）感染禽后可引起各种综合征，从无临诊症状感,低致病性禽流感（,MPAI）,MPAI,病毒在野禽中大多数不产生临诊症状。,鸡和火鸡的表现为呼吸、消化、泌尿和繁殖器官的异常。,高致病性禽流感（,HPAI）,急性败血性，呼吸困难、腹泻、高热、神经症状。,发病率和死亡率很高（50,90%,），有的鸡群可达100%。,临床症状,低致病性禽流感（MPAI） 临床症状,因宿主种类和免疫状态、病毒致病性等不同而有很大差异。,MPAI,病理变化主要在呼吸道，尤其是窦的损害，以卡他、纤维性、脓性或纤维脓性炎症为特征。,HPAI,在内脏器官和皮肤有各种水肿、出血和坏死，最急性型可能无大体病理变化。,病理变化,因宿主种类和免疫状态、病毒致病性等不同而有很大差异。病理变化,有些病毒具有凝集某种,(,些,),动物红细胞的能力，利用这种特性设计的试验称血球凝集,(HA),试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制,(HI),试验，具有特异性。通过,HA-HI,试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。,实验原理,有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，利用这种特性设计,掌握,HA,和,HI,试验的基本操作技术，了解其实用价值。,目的与要求,掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。目的与要求,96,孔“,V”,形微量反应板,100 uL,加样器，枪头。,2.,生理盐水，,0.5%,鸡红细胞悬液，禽流感病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），禽流感阳性血清，被检鸡血清。,器材与试剂,96孔“V”形微量反应板,100 uL加样器，枪头。 器材与,在感染初期或发病急性期从死禽或活禽采取。,死禽采集气管、肺、肝、肾、脾、泄殖腔等组织样品,。组织样品先用肉汤培养基或,PBS,制成,1020,（,W/V,）的悬液，,1000 r,离心,10 min,，取上清液作为试验样品。,为防止细菌污染，应加入以下抗生素,：,青霉素,2 000,g,，链霉素,2000g,，卡那霉素,1000 g,（每毫升培养液中所含）。样品离心后也可用细菌过滤器过滤除菌。,病毒分离,在感染初期或发病急性期从死禽或活禽采取。病毒分离,病毒分离,活禽用大小不等的灭菌棉拭子涂擦喉头、气管或泄殖腔，然后将带有分泌物的棉拭子放入每毫升含有,1000,g,青霉、,2000,g,链霉素,pH7.27.6,的肉汤中，无肉汤时可用,Hanks,液或,25%50%,的甘油盐水。小珍禽用拭子取样易造成损伤可取而代之以采集新鲜粪便。,将棉拭子充分捻动、拧干后除去拭子，样品液经,1000 r,离心,10 min,，取上清液作为接种材料。,病毒分离活禽用大小不等的灭菌棉拭子涂擦喉头、气管或泄殖腔，然,常用,9,10,日龄的鸡胚，每份病料至少注入,5,个鸡胚，接种于绒毛尿囊膜或尿囊内，操作方法如下。,1,照蛋，划出气室位置，在鸡胚胎面观看胚胎活动，选择无大血管处标一记号。,2,在气室顶部和标记处用碘酊和酒精消毒，并各钻一小孔。,3,用较干的碘酊棉球涂布小孔,。,接种鸡胚,常用910日龄的鸡胚，每份病料至少注入5个鸡胚，接种于绒毛,4,用,1,毫升注射器吸取上述处理过的材料，插入小孔内约,3mm,，缓缓注入,0.1,0.2,毫升，拔出针头。,5,用融化石腊封口，在蛋壳上标明日期。,6,置,37,温箱培养，每天照蛋二次，至全部或大部分鸡胚发生死亡为止（,24,小时内死亡的胚弃之）。,7,将死胚收藏于,4,冰箱内，气室向上，,6,24,小时获尿囊液。,接种鸡胚,4用1毫升注射器吸取上述处理过的材料，插入小孔内约3mm，,1.,在,96,孔微量反应板上进行，自左至右各孔加,50 L,生理盐水。,2.,于左侧第,1,孔加,50 L,病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸,50 L,至第,2,孔，依次倍比稀释至第,11,孔，吸弃,50 L,；第,12,孔为红细胞对照。,3.,自右至左依次向各孔加入,0.5%,鸡红细胞悬液,50 L,，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。,血凝（,HA,）试验,1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50 L生理,96,孔板孔号,1,2,3,4 5 6 7 8 9,10,11,对照,生 理盐水,50,50,50,.,50,50,50,病 毒,50,50,50,.,50,50,红细胞,50,50,50,.,50,50,50,病毒稀释倍数,1,：,2,1,：,4,1,：,8,.,1:1024,1:2048,结果判定,#,#,#,#,#,#,#,+,+,弃去,50L,以,100%,凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价,血凝（,HA,）试验,96孔板孔号 1234 5 6 7 8,4.,结果判定：,从静置后,10 min,开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为,100%,凝集（,#,），不凝集者（,-,）红细胞沉于孔底呈点状。,以,100%,凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。例如表中，该禽流感病毒液的血凝价为,1:128,，则,l:128,为,1,个血凝单位，,1:64,、,l:32,分别为,2,、,4,个血凝单位，或将,128/4=32,，即,1:32,稀释的病毒液为,4,个血凝单位。,血凝（,HA,）试验,4.结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红,1.,根据,HA,试验结果，确定病毒的血凝价，配制出,4,个血凝单位的病毒液。,2.,在,96,孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第,1,孔至第,11,孔各加,50 uL,生理盐水。,3.,第,1,孔加被检鸡血清,50 uL,，吹吸混合均匀，吸,50 uL,至第,2,孔，依此倍比稀释至第,10,孔，吸弃,50 uL,，稀释度分别为：,1:2,、,1:4,、,1:8 ,；第,12,孔加禽流感阳性血清,50 uL,，作为血清对照。,血凝抑制（,HI,）试验,1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位,4.,自第,1,孔至,12,孔各加,50 uL 4,个血凝单位的禽流感病毒液，其中第,11,孔为,4,单位禽流感病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用,10min,。,5.,自第,l,孔至,12,孔各加,0.5%,鸡红细胞悬液,50 uL,，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果。,血凝抑制（,HI,）试验,4. 自第1孔至12孔各加50 uL 4个血凝单位的禽流感病,血凝抑制（,HI,）试验,孔号,1,2,3,4 5 6 7 8 9,10,病毒对照,血清,对照,血清稀释倍数,1,：,2,1,：,4,1,：,8,.,1,：,1024,生理盐水,50,50,50,.,50,50,50,血清,50,50,50,.,50,50,4,单位病毒,50,50,50,.,50,150,振荡,1,分钟，室温,10,分钟,弃,50L,红细胞悬液,50,50,50,50,.,50,50,振荡,1,分钟，室温,10,分钟,结果判定,#,# #,#,#,以,100%,抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的滴度，即血清效价,血凝抑制（HI）试验孔号 1234 5 6,6.,结果判定：待病毒对照孔（第,11,孔）出现红细胞,100%,凝集（,#,），而 血清对照孔（第,12,孔）为完全不凝集（,-,）时，即可进行结果观察。,以,100%,抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即,HI,效价。凡被已知禽流感阳性血清抑制血凝者，该病毒为禽流感病毒。,例如表中血清的,HI,效价为,1:64,，用以,2,为底的负对数,(-log2),表示，即,6log2,。,判定标准,：,HI,效价小于或等于,3lg,2,判定,HI,试验阴性；,HI,效价等于,4lg,2,为可疑，需重复试验；,HI,效价大于或等于,5lg,2,为阳性,血凝抑制（,HI,）试验,6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞1,禽流感灭活疫苗免疫效果判断：,HI,抗体效价,4log2(1:16),为免疫合格。,禽流感弱毒疫苗免疫效果判断：鸡群免疫抗体转阳率,50%,判定合格。,正常合格为从高浓度到低浓度（从前到后）红细胞沉积依次减少，如,1-4,孔出现不完全沉积，即凝集现象，即无抗体或抗体水平较低，不合格；反之，,5-10,孔出现沉淀，则抗体水平较高，合格,。,农业部,2007,年发文,禽流感灭活疫苗免疫效果判断：HI抗体效价 4log2(1:,1,HA,和,HI,试验的基本原理是什么？,2,如何判定,HA,和,HI,试验的结果？,3,临床上,HI,和,HA,试验各自的作用是什么？,思考题：,思考题：,THE END,THE END,