检验诊断试剂(免疫)课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶免疫测定（EIA）,分类,是否对结合的酶标志物进行分离,酶标志物、抗原、抗体、酶免疫复合物,是否使用固相支持物,异相酶免疫测定,均相酶免疫测定,酶免疫测定,固相相酶免疫测定,液相酶免疫测定,酶标志物、抗原、抗体、酶免疫复合物,酶免疫测定（EIA）分类是否对结合的酶标志物进行分离酶标志物,1,固相酶免疫测定,ELISA(酶联免疫吸附试验),固相酶免疫测定ELISA(酶联免疫吸附试验),2,酶标志物、抗原、抗体、酶免疫复合物,酶标志物、抗原、抗体、酶免疫复合物,3,酶标志物酶标记抗体或抗原,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）,酶标记物,通过化学反应或免,疫学反应，让酶与,抗体或抗原形成的,结合物,酶标志物酶标记抗体或抗原 酶免疫技术的核心组成部分 酶结,4,酶标记抗体或抗原,制备方法,过碘酸钠法（直接法）,常用于HRP标记抗体或抗原,戊二醛交联法,酶标记抗体或抗原 制备方法过碘酸钠法（直接法）戊二醛交联法,5,1.辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶）,亚铁血红素（辅基）,主酶与酶活性无关,辅基是酶的活性中心(,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,),ELISA常用酶,2.碱性磷酸酶（AP）,1.辣根过氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶）ELISA常用酶,6,辣根过氧化物酶HRP上的糖羟基可以被高碘酸钠（NaPIO4）激活生成醛基，这些醛基能通过Schiff碱与蛋白中的氨基偶联，紧接着还原Schiff碱形成稳定的偶联产物。,这种HRP偶联标记方法已经被广泛认可，但是也存在一定的缺陷，特别是去除过量高碘酸钠（NaPIO4）的过程较为繁琐。需要注意的是，被高碘酸钠（NaPIO4）激活的HRP很不稳定，其酶活力会在几天内丢失,辣根过氧化物酶HRP上的糖羟基可以被高碘酸钠（NaPIO4）,7,检验诊断试剂(免疫)课件,8,检验诊断试剂(免疫)课件,9,评价,评价,10,检验诊断试剂(免疫)课件,11,检验诊断试剂(免疫)课件,12,检验诊断试剂(免疫)课件,13,检验诊断试剂(免疫)课件,14,检验诊断试剂(免疫)课件,15,均相酶免疫测定,homogenous enzyme immunoassay,用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定,酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。,原理,均相酶免疫测定 homogenous enzyme imm,16,均相酶免疫测定,最具代表性的两种技术,酶放大免疫测定技术EMIT,enzyme-mutiplied immunoassay technique,克隆酶供体免疫分析,CEDIA,cloned enzyme donor immunoassay,均相酶免疫测定 最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMI,17,检验诊断试剂(免疫)课件,18,检验诊断试剂(免疫)课件,19,利用重组DNA技术制备-半乳糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体（enzyme acceptor,EA），小片段称为酶供体（enzyme donor,ED），两个片段本身均不具酶活性，但结合在一起就具有酶活性，利用这一特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定(CEDIA)。,CEDIA的反应模式为,竞争法,。,克隆酶供体免疫测定,（cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA）,利用重组DNA技术制备-半乳糖苷酶的两个片段：大,20,一、,基本原理,：标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不能再与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原与EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量呈正比。,一、基本原理：标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性抗体竞争结,21,检验诊断试剂(免疫)课件,22,检验诊断试剂(免疫)课件,23,检验诊断试剂(免疫)课件,24,：健康人O型血或绵羊静脉血，应2w内固化,：健康人O型血或绵羊静脉血，应2w内固化,25,检验诊断试剂(免疫)课件,26,检验诊断试剂(免疫)课件,27,检验诊断试剂(免疫)课件,28,检验诊断试剂(免疫)课件,29,检验诊断试剂(免疫)课件,30,检验诊断试剂(免疫)课件,31,检验诊断试剂(免疫)课件,32,检验诊断试剂(免疫)课件,33,检验诊断试剂(免疫)课件,34,检验诊断试剂(免疫)课件,35,检验诊断试剂(免疫)课件,36,检验诊断试剂(免疫)课件,37,检验诊断试剂(免疫)课件,38,检验诊断试剂(免疫)课件,39,检验诊断试剂(免疫)课件,40,检验诊断试剂(免疫)课件,41,检验诊断试剂(免疫)课件,42,检验诊断试剂(免疫)课件,43,检验诊断试剂(免疫)课件,44,检验诊断试剂(免疫)课件,45,检验诊断试剂(免疫)课件,46,检验诊断试剂(免疫)课件,47,检验诊断试剂(免疫)课件,48,检验诊断试剂(免疫)课件,49,检验诊断试剂(免疫)课件,50,检验诊断试剂(免疫)课件,51,1.概述：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。,（,斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛,。 ）,斑点免疫渗滤试验,2.原理：以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。,3.试剂和操作,渗滤装置,是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由,塑料小盒,、,吸水垫料,和点加了抗原或抗体的,硝酸纤维素膜片,三部分组成,塑料小盒可以是多种,形状,的，盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。如此即制备成一渗滤装置（图19-1）。塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。,1.概述：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗,52,图19-1 DIGFA渗滤装置及操作示意图,A：操作示意图B:装置分解图,斑点免疫渗滤试验,53,斑点免疫层析试验,1.原理：斑点免疫层析试验（DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般,2.试剂和操作,免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条（图19-2），试剂条上端（A）和下端（B）分别粘贴吸水材料，免疫金复合物干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维素膜条。硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgG。,斑点免疫层析试验 1.原理：斑点免疫层析试验（DICA）简称,54,免疫金银染色,1.原理：金免疫技术测定的产物上的金颗粒可将银离子还原成银颗粒，在金颗粒表面形成一色泽更深的黑色层，因而增强了金免疫技术的敏感性（图19-3）。,（IGSS）,免疫金银染色 1.原理：金免疫技术测定的产物上的金颗粒可将银,55,