大学教程DNA生物合成课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第八章 核酸的生物合成,本章重点介绍遗传中心法则和,DNA,、,RNA,的生物合成，对基因工程作一般介绍。,DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson & Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“,中心法则,”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。,第八章 核酸的生物合成 DNA是绝大,1,中心法则(Central dogma),蛋白质,翻译,转录,逆转录,复制,复制,DNA,RNA,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA,复制,把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过,转录,传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板,复制,出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为,逆转录,这是中心法则的补充。,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,中心法则(Central dogma) 蛋白质翻译转录逆转,2,目 录,第四节,基因工程及分子生物学技术简介,第一节,DNA的生物合成,第二节,RNA的生物合成,第三节,核酸合成的抑制剂,目 录第四节 基因工程及分子生物学技术简,3,第一节 DNA的生物合成,一、,DNA的复制,（,DNA指导下的DNA合成,）,三、,DNA突变,四、,DNA的损伤与修复,二、,逆转录作用,（,RNA,指导下的,DNA,的合成）,第一节 DNA的生物合成一、DNA的复制三、DNA突变四,4,第一节,DNA,的生物合成,复制：,遗传信息从亲代DNA传递到子代DNA分子上。,2/62,第一节 DNA的生物合成复制：遗传信息从亲代DNA传递到子,5,一、 DNA半保留复制,(Semiconservative Replication),定义：,子代DNA双链中的一条链来自 母链，另一条链重新合成。,母链,子链,3/62,一、 DNA半保留复制定义：子代DNA双链中的一条链来自,6,(,深蓝,:,15,N,),(,粉红,:,14,N,),DNA半保留复制的证据,培养于普通培养液,继续培养于,普通培养液,含,15,N-DNA,的细菌,普通DNA,重DNA,第一代,中等密度DNA,第二代,普通DNA,中等密度DNA,4/62,(深蓝: 15N)(粉红: 14N)DNA半保留复制的证据培,7,半保留复制的意义：,遗传稳定性的分子机制。,但是：,遗传稳定性是相对的，生物界存在普遍的,变异现象,基因表达,：包括转录和翻译,6/62,半保留复制的意义：但是：遗传稳定性是相对的，生物界存在普遍的,8,二、 DNA复制的酶学,1. 底物：,dATP，dGTP，dCTP，dTTP，总称为,dNTP,2. DNA聚合酶,，DNA-pol,3. 模板,（template）：解开成单链的DNA母链,4. 引物,（primer）：RNA引物,5. 其他酶和蛋白质因子,7/62,二、 DNA复制的酶学1. 底物：dATP，dGTP，dCT,9,一）复制的化学反应,5,3,3,5,磷酸二酯键的生成,3,5,N,1,OH,3,5,+d,N,2,TP,N,1,N,2,-OH,3,5,+PPi,8/62,DNA pol,一）复制的化学反应5335磷酸二酯键的生成35N,10,二）,DNA聚合酶,（DNA polymerase, DNA-pol）,即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）,真核生物有多种：,DNA-pol,、,、,、,、,原核生物有3种：,DNA-pol,、,、,9/62,二） DNA聚合酶（DNA polymerase, DNA-,11,表13-1,大肠杆菌中DNA聚合酶某些性质,DNA-pol,性质, ,酶分子/细胞 400 40 20,活性（nt/min） 1000 50,100000,5,3,聚合功能,有 有 有,5,3,外切酶活性 有 有,无,3,5,外切酶活性 有 有 有,主要功能 校读 ,修复,不清,复制,填补缺口,10/62,表13-1 大肠杆菌中DNA聚合酶某些性质10/,12,The model of DNA-pol III,form the catalytic core,Links two cores,Leading strand synthesis,Lagging strand synthesis,act as a clamp,11/62,The model of,13,小片段,大片段,（,Klenow fragment,）,5,3,聚合功能，,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,DNA pol I,12/62,E,J,P,N,M,L,H,I,O,R,Q,G,C,D,B,F,A,K,小片段 大片段5 3 聚合,14,真核细胞中DNA聚合酶,种类： DNA-pol,、,DNA-pol,：合成随后链,DNA pol,：合成先导链,DNA-pol,：校对，修复和填补缺口,DNA-pol,:,线粒体DNA复制,DNA-pol,：功能不清,13/62,真核细胞中DNA聚合酶种类： DNA-pol 、,15,质粒,与,线粒体,DNA是细胞核染色体外的遗传物质。能进行自我复制。,质粒,是基因工程的常用载体,线粒体DNA,(mtDNA),全长16kb，有37个基因，编码与ATP合成有关的酶和蛋白质。,特点：,1. 母系遗传,2. DNA损伤后不易修复,3. 遗传密码与通用遗传密码有差别,14/62,UGA,（终止密码子）：,Trp,AGA/AGG,（Arg）：,终止密码子,AUA,（Ile）：,Met（起始密码子）,质粒与线粒体DNA是细胞核染色体外的遗传物质。能进,16,DNA-pol 的 5,3聚合作用,3,5,5,3,3,5,DNA-pol,15/62,5,3,OH,P,DNA-pol 的 53聚合作用35533,17,3,5外切,5,3外切,5,3,内切酶,（or限制性内切酶）,5,3,3,5外切,5,3外切,外切酶与内切酶作用图解,16/62,35外切5 3外切53内切酶5335,18,DNA-pol,I,5,3,外切酶活性的功能：,切除引物，切除突变片段,DNA-pol,I,3,5,外切酶活性的功能：,校读（,proofread,）功能,5,3,A,G,5,3,17/62,DNA-pol I 5 3外切酶活性的功能：切除引物，,19,DNA复制的保真性(fidelity),1.严格遵守碱基配对规律,2. DNA-pol在复制过程中对碱基的选择性,3. 复制出错时有即时的校读功能,A,T,G,C,DNA pol III在催化磷酸二酯键形成之前完成对碱基的选择；对,反式嘌呤核苷酸,的亲和力较顺式的大。,18/62,DNA复制的保真性(fidelity)1.严格遵守碱基配对规,20,三）复制中解链和DNA分子的拓扑学变化,解链酶类：,1. 解螺旋酶,(helicase) DnaB,2.拓扑异构酶,（topoisomerase I、II）,解旋酶，,3.单链DNA结合蛋白,(single stranded DNA-binding protein,SSB),19/62,三）复制中解链和DNA分子的拓扑学变化解链酶类：1. 解螺旋,21,1.解链（螺旋)酶 (helicase),解螺旋酶,作用,：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链。,ATP,20/62,1.解链（螺旋)酶 (helicase)解螺旋酶作用：断裂互,22,2. 拓扑异构酶,（topoisomerase,Topo）,拓扑(topology)与拓扑异构,DNA正超螺旋与负超螺旋,负超螺旋,正超螺旋,DNA双螺旋,拓扑异构酶,21/62,2. 拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）拓扑,23,切割DNA,双链，,此时,不需ATP,；尔后由,ATP,供能，使DNA分子成,负超螺旋,再连接切口。,不需ATP，切割双链DNA中的,一链,，使DNA松弛后, 连接切口。,Topo,:,Topo,:,临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱，鬼臼乙叉甙等）是通过,抑制Topo酶活性,而杀死肿瘤细胞的。,22/62,Topo酶：,切割DNA链，使其松弛后再连接。,切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA,24,3. 单链DNA结合蛋白,（,s,ingle,s,tranded,b,inding protein，SSB）,作用,：,防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解。,23/62,3. 单链DNA结合蛋白（single stranded b,25,四、引物酶,(,Primase,)和引发体,5,5,催化,RNA引物,合成的酶叫,引物酶,，它是一种特殊的RNA聚合酶。,DNA合成需在,RNA,引物,的基础上进行。,RNA引物,5,3,5,3,24/62,四、引物酶(Primase)和引发体 55催化RNA引物,26,DnaA,引发体,（,primosome,）：包括,解螺旋酶 、DnaC、引物酶（ DnaG ）及DNA复制的起始区域。,5,3,3,5,引物酶,DnaC,引发体,解螺旋酶,25/62,DnaA引发体（primosome）：包括解螺旋酶 、Dna,27,五、 DNA连接酶(,DNA ligase,),功能：,催化DNA双链的,3羟基,和相邻的,5磷酸基团,形成,磷酸二酯键,，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。,DNA连接酶,ATP,ATP,26/62,五、 DNA连接酶(DNA ligase)功能：,28,参与DNA复制的主要成员,主要成员,主要作用,DnaA 识别复制起始位点,解螺旋酶,解开DNA双链,SSB,维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,TOPO 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA-pol DNA复制,DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,27/62,参与DNA复制的主要成员主要成,29,三、,DNA生物合成过程,1.,复制的起始,2.链的延长,3.复制的终止,28/62,三、DNA生物合成过程1.复制的起始2.链的延长3.复制的,30,S,G,1,M,G,2,蛋白质合成期,DNA合成期,哺乳动物的细胞周期,29/62,SG1MG2蛋白质合成期DNA合成期哺乳动物的细胞周期29/,31,复制的起始,(一),DNA解成单链,由特定蛋白质识别复制起始位点（,ori,），在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，,形成复制叉,。,30/62,倒Y,复制的起始(一)DNA解成单链 由特定蛋白质识别复制起始位,32,E.coli复制起始点,oriC,跨度为245bp，有3组,串联重复序列,和2对,反向重复序列,。,GAT,T,N,T,TTAT,T,T,GAT,C,T,N,TTNT,A,T,T,GAT,C,T,C,TTATT,AG,串联,重复序列,反向,重复序列,T,T,TGGATAA,.,TTATCCA,CA,AATAGGT-T,TGTG,G,AT,T,A,T,T,AT,A,CACA,A,-,TA,-,GTGT,31/62,回文结构,AGCT,TCGA,E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，有3组串联重,33,(二),引发体的生成,解螺旋酶解开双链后引物酶进入形成,引发体,。,5,3,3,5,引物酶,DnaC,引发体,解螺旋酶,32/62,(二)引发体的生成 解螺旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体,34,（三）,RNA引物的,合成,33/62,5,5,RNA引物,5,3,5,3,（三） RNA引物的合成33/62 55RNA引物53,35,小节,参与复制起始的成员,名称,功能,DnaA蛋白 辨认起始点,解螺旋酶（,DnaB，Rep,）解开DNA双链,DnaC 协助,解螺旋酶,引物酶（,DnaG,） 催化RNA引物生成,SSB 稳定解开的单链,拓扑异构酶 理顺DNA链,OriC E.coli复制起始点,34/62,小节参与复制起始的成员名称功能DnaA蛋白,36,引物合成后，由DNA pol,（在真核细胞为DNA聚合酶,和,)催化，按碱基配对原则，将dNTP逐一添加到引物,3,末端，,形成,磷酸二酯键，,使新合成的链不断延长。,复制的延长,3AAGACCTATT5,5,TTCTGGATAA,3,35/62,引物合成后，由DNA pol（在真核细胞为DNA,37,dATP,+,DNA pol,36/62,dATP+DNA pol36/62,38,领头链,（leading strand）,随从链,（lagging strand）,冈崎片段,(Okazaki fragment),37/62,领头链（leading strand）随从链（laggi,39,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,解旋酶,DNA聚合酶III,解链酶,RNA引物,引物体,DNA聚合酶I,SSB,3,3,5,前导链,随后链,3,5,复制的起始,DNA链的合成与延长,DNA链合成的终止,5,RNA引物,3,3,DNA连接酶,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的移动方向解旋酶,40,复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型,聚合酶III全酶,引物,聚合酶III全酶,引物,引物体,引物体,解链酶,解链酶,复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶III全酶引物,41,DNA的复制过程：,DNA的复制过程：,42,1.半不连续性：,DNA复制过程中，一条链是,连续复制，另一条链是不连续复制的现象。,有关复制延长的,几个重要概念,4. 冈崎片段（Okazaki fragment）：,不连续复制的片段,3. 随从链:,链的延长方向(5,3,)与解链方向相反，为不连续复制。,2.领头链:,链的延长方向(5,3,)与解链方向相同, 为连续复制。,38/62,1.半不连续性：DNA复制过程中，一条链是连续复制，另一条链,43,5. 双向复制,ori,ori,6. 复制子(replicon),ori,ori,真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段。,以起始点为中心，向两个方向进行复制。,39/62,5. 双向复制oriori6. 复制子(replicon)o,44,滚环复制,是某些病毒，质粒、线粒体DNA的特殊复制形式。,40/62,滚环复制 是某些病毒，质粒、线粒体DNA的特殊复制形式。40,45,复制的终止,原核生物复制终止,真核生物复制终止,41/62,复制的终止原核生物复制终止 41/62,46,1、原核生物DNA为环状，双向复制的汇合点就是复制终止点。,原核生物复制终止,2. 领头链上的RNA引物被RNA酶水解后，由DNA pol I 催化，由新合成链提供-OH补齐。,终点,起点,RNA酶,DNA pol I,连接酶,42/62,1、原核生物DNA为环状，双向复制的汇合点就是复制终止点。原,47,3、冈崎片段引物的消除和连接。,RNA引物,RNA酶,DNA pol I,DNA连接酶,43/62,3、冈崎片段引物的消除和连接。RNA引物RNA酶DNA po,48,真核生物的端粒,(,telomere,),和端粒酶,(,telomerase,),真核生物DNA末端结构是端粒，在端粒酶的作用下形成 。,（TTAGGG）n,44/62,端粒酶：,由RNA与蛋白质组成，具逆转录酶活性，以自身RNA为模板合成DNA。,真核生物的端粒(telomere)和端粒酶(telomera,49,U,U,A,A,3,5,A,C,CAACC,C,GGGTTGGGT,3,5,3,C CAACC,GGGTTGGGT,TGG,U,U,A,A,3,5,3,5,3,A,C,C ACCUU,GGGTTGGGT,TGG,A,A,3,5,3,5,3,A,C,C,A,Binding,Elongation,Translocation,Telomerase,45/62,爬行模型：,Inchworm（尺蠖）model,UUAA35AC CAACCCGGGTTGGGT35,50,C ACCUU,GGGTTGGGT,TGGAA,A,A,3,5,3,5,3,A,C,C,A,Elongation,C,ACCUU,GGGTTGGGT,TGGAA,3,5,3,5,Primer,synthesis,C,CCAACCCA,ACCUU,GGGTTGGGT,TGGAA,3,5,3,5,Primase,DNA polymerase,C,CCAACCCA,GGGTTGGGT,TGGAA,3,5,3,5,DNA,replication,Primer,removal,46/62,C ACCUU,51,真核和原核DNA细胞复制比较,端粒酶使,线形DNA分子的末端保持不变,新合成链提供-OH补齐,复制终止,真核和原核DNA细胞复制比较端粒酶使线形DNA分子的末端保持,52,四、 DNA损伤（突变）与修复,DNA分子一级结构的改变,称为DNA损伤(DNA damage)或突变（mutation）。,大多数突变属此类，原因不明,由理化及生物因素诱发,DNA的损伤（突变）的概念,自发突变：,诱发突变：,47/62,遗传重组,不属突变的范畴。,四、 DNA损伤（突变）与修复 DNA分子一级结构的改变,53,一）基因突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础,（二）只有基因型改变的突变,（三）致死性的突变,（四）突变是某些疾病的发病基础,同义突变,某些非编码区的突变,DNA多态性：,个体间DNA序列的差异,48/62,如遗传性疾病，高血压，肿瘤，糖尿病等等。,一）基因突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）只有,54,O,N,H,N,O,C,H,3,R,P,O,N,H,N,O,C,H,3,R,O,N,H,N,O,C,H,3,R,P,N,H,N,O,R,O,C,H,3,UV,二）引发突变的因素,物理因素,紫外线(产生胸腺嘧啶二聚体，,）,TT,49/62,环丁基环,ONHNOCH3RPONHNOCH3RONHNOCH3RPN,55,化学因素,烷化剂,：(如氮芥类)，使鸟嘌呤的 N,7,烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点,亚硝酸盐,：使碱基氧化脱氨基,C,U,A,I,G,X,碱基类似物,如5-溴尿嘧啶(,5-BU),与,T,类似，但5-BU可与,G,配对,羟胺类：,C,被羟胺化后与,A,配对,50/62, A,5-BU,G,5-BU,化学因素烷化剂：(如氮芥类)，使鸟嘌呤的 N7烷基化后脱落,56,C,O,HN,C,CH,CH,N,O,U,C,O,N,C,CH,CH,N,NH,2,C,A,N,NH,2,N,N,N,N,O,HN,N,N,I,N,OH,N,N,N,H,H,2,N,G,N,OH,N,N,N,H,HO,X,51/62,COHNCCHCHNOUCONCCHCHNNH2CANNH2,57,三、突变的类型,1. 点突变,（point mutation）,也称错配,（mismatch）,DNA链上碱基的置换,CTC,Glu,C,A,C,Val,HbA,肽链,HbA,基因,HbS,基因,HbS,肽链,A,T,G,C,52/62,三、突变的类型1. 点突变（point mutation）D,58,2. 缺失、插入和,框移突变,（frame shift）,5. UCA,C,GACAUAUG.3,5.UCA,G,CGACAUAUG.3,丝,精,组,蛋,丝,丙,苏,酪,5. UCAGACAUAUG.3,丝,天,异亮,插入,缺失,正常,框移突变,是最严重的突变,！,人,之,初，性本善，性相近，习相远,人初性，本善性，相近习，相远,53/62,2. 缺失、插入和框移突变（frame shift）5.,59,3. 重排,(rearrangement),与,重组,(recombination),DNA分子发生较大片段的交换,1,2,Hb,基因家族,AB,CD,AB,DC,AB,CD,EF,GH,AB,GH,EF,CD,1,2,2,1,Hb Anti-Lepore,2,Hb Lepore,2,54/62,3. 重排(rearrangement)与重组(recomb,60,四）DNA损伤的修复,光复活酶,（,可见光,）,T-T,1. 光修复,TT,55/62,四）DNA损伤的修复光复活酶（可见光）T-T1. 光修复TT,61,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于,损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体2、光复合酶,62,2.切除修复,：由3种,酶,共同参与完成。,UvrC切除,DNA pol I,DNA连接酶,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,UvrA，UvrB识别并结合,56/62,XP,XP,DNA pol,2.切除修复：由3种酶共同参与完成。UvrC切除DNA po,63,3.重组修复,RecA,DNA pol,切除修复,57/62,3.重组修复RecADNA pol切除修复57/62,64,4. SOS修复,：,DNA分子多处受到较大范围的损伤，细胞所作出的一系列反应。,细胞能继续生存，但,引起DNA较长期的广泛的突变。,后果：,SOS修复系统：,Uvr类，Rec类，DNA pol，LexA等,组成调节子（regulon）网络系统。,特点：,抑制细胞分裂，允许大量快速的,切除修复,和,重组修复,， 允许损伤的DNA作为模板进行复制，,对碱基选择性低,等。,58/62,4. SOS修复：DNA分子多处受到较大范围的损伤，细,65,五、逆转录现象和逆转录酶,逆转录酶,（reverse transcriptase）,又称为,反转录酶,，为,依赖RNA的DNA聚合酶,(RNA-dependent DNA polymerase,RDDP,),以RNA为模板，dNTP为原料，按碱基配对规律合成DNA的过程，由,逆转录酶,催化。,逆转录现象,59/62,五、逆转录现象和逆转录酶 逆转录酶（reverse tra,66,逆转录酶是,多功能酶,，有三种酶活性：,1.,逆转录活性：,即以RNA为模板合成DNA,2. RNase活性：,水解,RNA,:DNA中的,RNA,3. DNA pol活性：,以DNA,为模板合成DNA,60/62,逆转录酶是多功能酶，有三种酶活性：1. 逆转录活性：即以RN,67,RNA模板,逆转录酶的逆转录活性,逆转录酶的RNase活性,RNA:DNA杂化双链,单链DNA,逆转录酶的,DNA pol活性,整合,(integration),入细胞基因组,双链DNA,病毒基因组通过,基因重组,插入到宿主细胞基因组中，称为,整合,。,tRNA引物,61/62,RNA模板逆转录酶的逆转录活性逆转录酶的RNase活性RNA,68,逆转录及逆转录酶的生物医学意义,1. 丰富和发展了中心法则,2. 丰富和发展了致癌理论,3. 在基因工程中的应用,RNA也可作为遗传信息的载体,RNA在进化中可能比DNA更原始,癌基因,与病毒致癌理论,逆转录酶广泛应用于,基因工程,中,逆转录病毒是,基因治疗,的常用载体,62/62,逆转录及逆转录酶的生物医学意义1. 丰富和发展了中心法则2.,69,2. 逆转录与癌变 致癌病毒多数是RNA病毒，少数是DNA病毒，致癌病毒感染宿主细胞后，致癌基因由病毒基因整合到宿主细胞的染色体中，致癌基因可表达成蛋白质，此蛋白使正常细胞转变为癌细胞。致癌病毒已证实40余种致癌基因，已知20种以上的 逆转录病毒致癌基因,.,有相应的正常细胞基因，称作细胞原癌基因（c-onc），它们只有在特定条件下，才引发癌变。,2. 逆转录与癌变 致癌病毒多数是RNA病毒，少数是D,70,这些致癌基因按其蛋白质产物可分以以下五类：,1.src 家族:10余种基因,表达酪氨酸蛋白激酶类;,2.ras 家族:多种表达信息传递蛋白质基因,G蛋白;,3.myc家族:数种表达DNA结合蛋白基因,起转录调控;,4.sis家族:致癌基因是为生长因子编码的基因;,5.erb 家族:四种表达细胞骨架蛋白质基因,与细胞形态和运动有关。,致癌基因的发现，使肿瘤发病机制的研究深入到分子水平，而有关致癌基因在什麽情况下才会表达成癌细胞，将是一个十分重要的课题。,这些致癌基因按其蛋白质产物可分以以下五类：,71,