药品QC微生物实验室管理课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015-7-25,药品,QC,微生物实验室管理,药品QC微生物实验室管理,1,目录,微生物实验室质量管理与保障,USP,微生物检测技术精要,培养基的质量控制和规范化操作,菌种管理（保藏、传代、分离和鉴定等）,药品微生物检测分析方法的验证,目录微生物实验室质量管理与保障,2,第一部分,微生物,实验室,质量管理,与保障,第一部分微生物实验室,3,目录,4,3,1,概述及法规要求,WHO,微生物实验室管理要求实例,质量管理与保障管理,2,微生物实验室的风险分析,目录431 概述及法规要求WHO微生物实验室管理要求实例,4,无菌检查和微生物限度检查的性质和特点,药品微生物的检验结果受很多因素的影响，如样品中微生物可能分布不均匀、微生物检验方法的误差较大等。因此，在药品微生物检验中，为保证检验结果的可靠性，必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室规范要求进行。,药品微生物实验室管理用于指导药品微生物检验实验室的质量控制及质量保证。,无菌检查和微生物限度检查的性质和特点药品微生物的检验结果受很,5,无菌检查和微生物限度检查的性质和特点,这决定了,微生物检验质量保证的高要求。,药品的无菌和微生物限度检测是指按照一定的,检测程序和质量控制措施,，,确定要求无菌的样品中,是否存有活的或者不允许存在的微生物,（定性试验,一次检出不得复试,），,或者确定,单位（,g/ml,）样品中存在微生物的数量,（定量试验）,无菌检查和微生物限度检查的性质和特点这决定了微生物检验质量保,6,相关法规和指南,相关法规,2010,年版,中国药典,一部附录,XVIII G,2010,年版,中国药典,二部附录,XIX Q,USP,36,版,MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES,WHO Technical Report Series, No. 961, 2011 Annex 2WHO good practices for pharmaceutical microbiology laboratories,FDA,药品质量控制微生物实验室检查指南,相关法规和指南相关法规2010年版中国药典一部附录XVI,7,微生物实验室的风险分析,人员风险,人员配置不足，不能准确及时完成岗位工作。,培训不足，工作人员不能按照,SOP,要求完成岗位工作。,微生物实验室的风险分析人员风险 人员配置不足，不能准确及时完,8,微生物实验室的风险分析,环境风险,环境洁净度：环境未达标，检验室环境污染导致测试结果阳性。,实验室功能区设计不合理，污染无菌室。,未,对进入微生物实验室的人员进行限制,，造成实验室污染。,所用消毒剂管理不规范，未进行消毒效果验证，不能有效保证洁净区的微生物控制。,微生物实验室的风险分析环境风险环境洁净度：环境未达标，检验室,9,微生物实验室的风险分析,检测方法风险,检测方法的制定不符合法规要求。,检测方法未进行确认或验证。,微生物实验室的风险分析检测方法风险检测方法的制定不符合法规要,10,微生物实验室的风险分析,设备风险,用于实验室,的,设备、仪器和其它装置,未按要求,进行验证和校准,。,用于实验室,的,设备、仪器和其它装置,维护不足。,实验室,的,设备、仪器和其它装置,的监控未按要求进行。,微生物实验室的风险分析设备风险用于实验室的设备、仪器和其它装,11,微生物实验室的风险分析,试液及培养基风险,未对供应商进行审核，不能保证试液及培养基质量。,未按照要求储存条件进行储存，对试液及培养基质量产生不良影响。,试液及培养基的配制未进行监控或验证，对试液及培养基质量产生不良影响。,未对试液及培养基进行质量检查，不能保证试液及培养基质量。,试液及培养基有效期管理不规范。,微生物实验室的风险分析试液及培养基风险未对供应商进行审核，不,12,微生物实验室的风险分析,菌种风险,未对供应商进行审核，菌种质量不能保证。,未按照要求储存条件进行储存，降低菌种活力。,菌种操作（复苏、传代、保存）不规范，造成菌种污染和活力降低。,未对保藏菌种进行质量检查，不能保证菌种的纯度及菌种特性。,菌种使用有效期管理不规范。,微生物实验室的风险分析菌种风险未对供应商进行审核，菌种质量不,13,微生物实验室的风险分析,样品管理风险,取样操作管理不规范，污染样品。,样品传递、保存、分发不规范，对样品中微生物产生不利影响或直接导致检验结果错误（如需阴凉存放的样品，放在普通环境，导致样品变质或被污染；分发错误，理化检测的样品用于微生物检测） 。,物品：消毒、灭菌措施未经验证，如灭菌釜温度过高，培养基被破坏，微生物没办法真实表达出来，造成假阴性结果。消毒、灭菌后存放条件不合适或放置时间过长造成污染。,微生物实验室的风险分析样品管理风险取样操作管理不规范，污染样,14,微生物实验室的风险分析,污物处理管理风险,污染物质的处理过程,不适当，造成,环境和,人员,的,污染,。,未按操作规程处理剩余样品，特别是剧毒样品、生物样品，导致严重的环境污染，甚至对人员健康造成不良影响。（检验样品、有毒的溶液、用过的培养基、动物实验动物及其排泄物）,微生物实验室的风险分析污物处理管理风险污染物质的处理过程不适,15,微生物实验室的风险分析,质量保证和质量控制,风险,实验室,未制定,内部质量保证和质量控制体系（如,偏差的处理、加标样品的使用、重复性检测和操作的熟练度）,，不能,保证每天的检测结果与标准规定的一致性,。,微生物实验室的风险分析质量保证和质量控制风险实验室未制定内部,16,质量管理和保障管理,5.,废弃物的处理,6.,检测报告,7.,样品,8.,检测步骤,1.,人员,2.,环境,3.,检验方法的验证,4.,结果质量保证和,操作质量控制,9.,样品操作和鉴别,10.,标准物质和,标准培养基,11.,试剂和培养基,12.,设备,微生物实验室管理,质量管理和保障管理5.废弃物的处理6.检测报告7.样品8.检,17,WHO,微生物实验室管理要求实例,区域,安装级别,推荐要求,样品接收,无级别,无级别,培养基制备,无级别,无级别,灭菌前室,无级别,无级别,灭菌后室（无菌区域内）,Grade B,ISO 5 and10 cfu/m,3,无菌测试（操作区）,Grade A,ISO 5 and1 cfu/m,3,无菌测试（背景区）,Grade B,ISO 5 and10 cfu/m,3,操作区域布局,-1,WHO微生物实验室管理要求实例区域安装级别推荐要求样品接收无,18,WHO,微生物实验室管理要求实例,区域,安装级别,推荐要求,无菌测试（隔离器）,Grade A,ISO 5 and1 cfu/m,3,无菌测试（隔离器背景）,无级别,无级别,培养箱,无级别,无级别,计数区域,无级别,（关键步骤应在层流区域操作）,无级别,（关键步骤应在层流区域操作）,清洁区域,无级别,无级别,操作区域布局,-2,WHO微生物实验室管理要求实例区域安装级别推荐要求无菌测试（,19,WHO,微生物实验室管理要求实例,设备类型,要求,频率,培养箱,冰箱,冷库、烘箱,清洁和消毒,内部,外部,每月,需要时（,3,个月）,需要时（每年）,水浴,清洁、消毒、更换用水,每月,每,6,月灭菌剂消毒,离心机,维护,清洁和消毒,每年,每次使用,高压蒸汽灭菌器,外观检查,维护,压力容器安全检查,按照供应商要求,每年（按照供应商要求）,每年,设备维护,-1,WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率培养箱清洁和消,20,WHO,微生物实验室管理要求实例,设备类型,要求,频率,安全柜,层流柜,维护及机械检查,每年（按照供应商要求）,显微镜,维护,每年,厌氧罐,清洁和消毒,每次使用,培养基分配装置,清洁及适当消毒,每次使用,螺旋震荡器,清洁及消毒,每次使用,实验室,清洁和消毒工作区域、地面,清洁和消毒其它表面,每次使用,每,3,月,设备维护,-2,WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率安全柜维护及机,21,WHO,微生物实验室管理要求实例,设备类型,要求,频率,标准液体温度计,全量程校准,单点校准（通常为,0,点）,每,3,年,每年,标准热电偶,全量程校准,标准温度计核对,每,3,年,每年,工作温度计和工作热电偶,标准温度计冰点和,/,或全量程核对,每年,湿度计,校准,每次使用,设备校准及频率,WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率标准液体温度计,22,WHO,微生物实验室管理要求实例,设备类型,要求,频率,温控设备,确认温度的稳定性和均一性,温度监控,每,2,年及维修改造后,每次使用,干热灭菌柜,确认温度的稳定性和均一性,温度监控,每,2,年及维修改造后,每次使用,高压蒸汽灭菌器,确认温度的稳定性和均一性,温度监控,每,2,年及维修改造后,每次使用,无菌测试,A,级区,安全柜,隔离器,性能确认,微生物监控,空气流型监控,高效过滤器完整性监控,每年及维修改造后,每次使用,每,6,月,每,6,月,设备确认及监控,-1,WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率温控设备确认温,23,WHO,微生物实验室管理要求实例,设备类型,要求,频率,单向层流柜,性能确认,微生物监控,空气流型监控,高效过滤器完整性监控,每年及维修改造后,每周,每,6,月,每,6,月,培养基分配器,体积分配检查,每次调节及复位,移液管,体积分配精确性检查,定期（依据使用频率确定）,厌氧罐,/,培养箱,厌氧指示剂检查,每次使用,实验室环境,空气及表面微生物污染检查（通常使用空气采样器、沉降碟、接触碟、拭子）,依据风险评估，建立合适的监测计划。,设备确认及监控,-2,WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率单向层流柜,24,WHO,微生物实验室管理要求实例,标准菌株的使用,标准菌株（来源于有资质的供应商）,标准储存菌株,1,代（冻干、液氮、超低温保存）,工作菌株日常使用,标准储存菌株,2,代（冻干、液氮、超低温保存）,工作菌株日常使用,标准储存菌株,3,代（冻干、液氮、超低温保存）,工作菌株日常使用,标准储存菌株,4,代（冻干、液氮、超低温保存）,工作菌株日常使用,工作菌株日常使用,WHO微生物实验室管理要求实例标准菌株的使用标准菌株（来源于,25,第二部分,USP,微生物,检测,技术精要,第二部分USP微生物,26,目录,药典微生物章节概要,非无菌制剂的微生物检查,无菌测试,微生物特性确定，鉴定及菌株分型,目录药典微生物章节概要,27,微生物专家委员会的责任范围,负责,不负责,微生物测试,微生物监控,水,个论（除了设立微生物限度、无菌和细菌内毒素标准）,微生物专家委员会的责任范围负责不负责微生物测试水,28,微生物学是开发、生产及成品测试的一部分,无菌控制也适用于非无菌产品,控制贯穿于一个药物或生物制剂从研发到市场到成品控制的整个过程,整个过程中的各种微生物控制的整合将提高最终产品微生物的质量保证,USP,提供了每个阶段微生物控制程序和指导,微生物学是开发、生产及成品测试的一部分无菌控制也适用于非无菌,29,作为重要组成的微生物控制,原料和组分的微生物控制,环境的微生物控制,生产过程的微生物控制,成品的微生物控制,人员的微生物控制,所有微生物控制的组合,微生物控制,作为重要组成的微生物控制原料和组分的微生物控制微生物控制,30,原料和组分的微生物控制的,USP,观点及文件,非无菌制剂的微生物检查：微生物计数测试,非无菌制剂的微生物检查：特定微生物的检验,非无菌药品的微生物属性,原料和组分的微生物控制的,USP,观点及文件,原料和组分的微生物控制的USP观点及文件非无菌制剂的,31,环境微生物控制的,USP,观点及文件,洁净室和其他受控环境的微生物评估,消毒剂与杀菌剂,无菌产品包装,-,完整性评估,环境微生物控制的,USP,观点及文件,环境微生物控制的USP观点及文件洁净室和其他受控,32,过程微生物控制的,USP,观点及文件,灭菌与无菌保证,生物指示剂,灭菌,-,化学和物理指示剂，及综合指示剂,生物指示剂,-,耐受力测试,过程微生物控制的,USP,观点及文件,过程微生物控制的USP观点及文件灭菌与无菌保证过,33,成品微生物控制的,USP,观点及文件,无菌测试,细菌内毒素测试,热源测试,抗菌有效性测试,最终灭菌物品,-,参数放行,无菌产品包装,-,完整性评估,成品微生物控制的,USP,观点及文件,成品微生物控制的USP观点及文件无菌测试成品微生物控,34,微生物章节,防腐剂,-,有效性,生物指示剂,耐受力测试,非无菌产品的微生物检查：微生物测试,控制菌的微生物检查,无菌测试,细菌内毒素测试,灭菌生物指示剂,微生物章节防腐剂-有效性,35,微生物章节,消毒剂与杀菌剂,非无菌产品的微生物属性,水分活性应用,洁净室和其他受控环境的微生物评估,微生物实验室规范,无菌产品包装,-,完整性评估,微生物章节消毒剂与杀菌剂,36,微生物章节,无菌测试,-,隔离系统验证,无菌,-,化学和物理化学指示剂，及综合指示剂,灭菌和无菌保证,最终灭菌药品,-,参数放行,微生物替代方法验证,药物的微生物回收率验证,药典物质灭菌,微生物章节无菌测试-隔离系统验证,37,微生物章节,制药用水,微生物计数测试,-,营养和食品补充剂,控制菌的微生物检查,-,营养和食品补充剂,非无菌营养和食品补充剂的微生物评估,微生物章节制药用水,38,非无菌制剂的微生物,检查,-,计数方法,介绍,在此描述的测试允许对在需氧条件下生长的嗜温细菌和真菌进行定量计数,这些测试设计用于确定原料药或制剂是否符合已建立的微生物质量标准。当用于这样的目的时，按下列指导进行，包括取样数量，结果诠释。,该方法不适用于将微生物作为活性成分的产品。,其它可替代的微生物程序，包括自动化方法，如果已证明了其同药典方法的等效性，也可以使用。,非无菌制剂的微生物检查-计数方法介绍在此描述的测试允许对在需,39,常规过程,避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）,去除细菌抑制,/,真菌抑制性（为什么？）,常规过程避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）,40,计数方法,薄膜过滤法,孔径,0.45um,的滤膜，选择不受样品液干扰的材质，不对微生物的截留产生影响，建议每片薄膜上的样品量为,1g,，过滤后适当冲洗薄膜,平皿计数：,平皿浇注法,9cm,的平皿，加入,1ml,样品液，,15-20ml,培养基，浇制温度,45,，每种培养基每个稀释度至少,2,个平皿，可使用更大规格的平皿,平皿计数：,表面涂布法,9cm,的平皿，加入,45,左右,15-20ml,培养基，待凝固，每种培养基每个稀释度至少,2,个平皿，样品涂布不少于,0.1ml,，可使用更大规格的平皿,最大可能计数法（,MPN,）,用于检测极少数量的微生物，精密度、准确度差，不适用于霉菌,计数方法薄膜过滤法孔径0.45um的滤膜，选择不受样品液干扰,41,生长能力测试和方法适用性,生长能力测试,包括：,一般考虑,测试菌株准备,缓冲液,阴性对照,培养基生长测试,计数方法适用性,包括：,样品制备,接种与稀释,中和,/,去除抗菌活性,产品存在情况下的微生物回收率,结果与解释,生长能力测试和方法适用性生长能力测试包括：计数方法适用性包括,42,生长能力测试和方法适用性,“必须建立在待测产品存在微生物情况下，仍有检出微生物能力的方法,”,“如果测试性能发生变化或发生可能影响测试结果的产品变更，方法适用性必须重新进行再确认,”,USP,生长能力测试和方法适用性“必须建立在待测产品存在微生物情况下,43,测试菌种及阴性对照,微生物使用不超过,5,代,2,小时内使用，如,2-8,不超过,24h,黑曲霉及枯草芽孢杆菌也可制备孢子悬浮液，,2-8,保存期限需确认,阴性对照必须没有微生物，测试失败需要进行调查,测试菌种及阴性对照微生物使用不超过5代,44,培养基生长能力测试,测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制备得到的培养基，及根据配方制备得到的培养基,按上述表中的条件培养,TSA/TSB 30-35 ,，沙堡葡萄糖琼脂,20-25 ,细菌：,3d,，真菌,5d,结果判断：,固体培养基：偏差系数为,2,液体培养基：有明显生长，与前次测试结果一致,培养基生长能力测试测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制,45,计数方法的适用性,计数方法适用性章节包括样品准备，接种，稀释，中和抗菌活性和在产品存在的情况下的回收率，结果和解释的方面的讨论,计数方法的适用性计数方法适用性章节包括样品准备，接种，稀释，,46,样品制备,样品制备方法依据待测产品的物理特性。如如下述的个程序均被证明不适用，必须开发适用的替代方法,水溶性产品,水不溶性非脂类产品,脂类产品,气雾剂,皮肤贴剂,样品制备样品制备方法依据待测产品的物理特性。如如下述的个程序,47,测试样品数量,除非其他地方指出，用,10g,或,10ml,气雾剂：,10,个容器,皮肤贴剂：取,10,片,随机抽样，混合测试,测试样品数量除非其他地方指出，用10g或10ml,48,产品检测,样品培养：,TAMC: 30-35 ,3-5d,TYMC: 20-,2,5 ,5-7d,产品检测样品培养：,49,非无菌制剂的微生物,检查,-,特定微生物的检验,介绍,样品培养,下述检验方法用于在规定条件下测定指定的微生物是否存在。,该测试设计用于确定一种原料药或制剂是否符合已建立的微生物质量质量标准。当用于这样的目的时，按下述的指导进行，包括取样数量，结果诠释。,可替代的微生物程序，包括自动化方法，如果已证明了其同药典方法的等效性，也可以使用。,非无菌制剂的微生物检查-特定微生物的检验介绍样品培养下述检验,50,常规过程,常规过程,避免产品以外的微生物污染（,最大的污染源是什么？,）,去除细菌抑制,/,真菌抑制性（,为什么？,）,常规过程常规过程避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么,51,产品测试,产品测试,通则分别列出了各个微生物测试的章节，每个章节包括以下这些通用部分：,样品制备和增殖,选择性培养,结果解释,产品测试产品测试通则分别列出了各个微生物测试的章节，每个章节,52,培养基适用性测试和方法适用性测试,培养基适用性测试和方法适用性测试,培养基适用性测试：,测试菌株准备,缓冲液,阴性对照,生长能力测试，抑制及选择性测试,方法适用性包括,样品制备,接种与稀释,中和,/,去除抗菌活性,产品存在情况下的微生物回收率,结果与解释,培养基适用性测试和方法适用性测试培养基适用性测试和方法适用性,53,菌种、阴性对照及培养基,菌种、阴性对照及培养基,菌种,微生物使用不超过,5,代,2,小时内使用，如,2-8,不超过,24h,生孢梭菌也制备孢子悬浮液，,2-8,保存期限需确认,阴性对照必须没有微生物，测试失败需要进行调查,测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制备得到的培养基，及根据配方制备的培养基，根据药典确认相应培养基具有适当的特性,菌种、阴性对照及培养基菌种、阴性对照及培养基菌种,54,质控可接受标准,质控可接受标准,生长能力测试,液体培养基与前一批通过测试并被批准的培养基结果一致,固体培养基,-,清楚观察到与前一通过测试并被批准的培养基的前次结果一致,抑制性,应无测试微生物生长,指示能力,菌落外观和指示反应与前一通过该测试并被批准的培养基的前次结果一致,质控可接受标准质控可接受标准生长能力测试,55,方法适用性,方法适用性,如果对某个微生物的抗菌活性不能去除，那就假设这个被抑制的微生物不会出现在产品中,方法适用性方法适用性如果对某个微生物的抗菌活性不能去除，那就,56,剂型,TAMC,(cfu/g or cfu/ml),TYMC,(cfu/g or cfu/ml),控制菌（,1g,或,ml,）,非液体口服给药制剂,10,3,10,2,大肠埃希菌,液体口服给药制剂,10,2,10,1,大肠埃希菌,直肠给药制剂,10,3,10,2,-,牙龈、皮肤、鼻及耳用,10,2,10,1,金黄色葡萄球菌,铜绿假单孢菌,阴道制剂,10,2,10,1,金黄色葡萄球菌,铜绿假单孢菌,白色念珠菌,吸入剂,10,2,10,1,金黄色葡萄球菌,铜绿假单孢菌,耐胆盐革兰阴性菌,活性药物成分，辅料,10,3,10,2,方法适用性,剂型TAMC TYMC 控制菌（1g或ml）非液体口服给药制,57,控制微生物测试,控制微生物测试,沙门菌,大肠埃希菌,铜绿假单孢菌,金黄色葡萄球菌,白色念珠菌,生孢梭菌,耐胆盐G- 的定性及定量,没有其他的,有害微生物吗？,控制微生物测试控制微生物测试沙门菌没有其他的,58,FDA,说什么,无有害微生物,21 CFR 211.113,微生物污染控制（,a,）适当的书面程序必须建立并遵循以防止非无菌药品中的有害微生物,FDA说什么无有害微生物21 CFR 211.113微生物污,59,FDA,说什么,还有什么？,21 CFR 211.165,分发前的测试与放行,（,b,）必须的话，对每批应不存在有害微生物的药品应有适当的实验室测试,不仅仅是不存在,USP,规定的微生物,FDA说什么还有什么？21 CFR 211.165分发前的测,60,有害微生物,有害微生物,有害微生物的概念不适合用于无菌产品，,无菌产品中不得有任何微生物,将用于非无菌产品的微生物测试，及非无菌生产环境中分离得到的微生物评估及清洁验证,有害微生物有害微生物有害微生物的概念不适合用于无菌产品，无菌,61,有害微生物,有害微生物,有害微生物可以被定义为：,能在产品中增殖的微生物，对药品的物理特性及治疗作用有负面影响，并且,由于产品中微生物的数量及致病性能导致使用该药品的患者受到感染,有害微生物有害微生物有害微生物可以被定义为：,62,有害微生物,有害微生物,显而易见的药品的有害微生物举例：,在含有普通防腐剂的局部用霜剂、鼻腔喷剂或口服液中能够增殖的假单胞菌，片剂的表面生长的真菌,食源性的致病细菌，如口服制剂中的沙门菌和志贺菌,暴露与高湿环境中的气泡眼包装内的片剂表面会生长真菌,有害微生物有害微生物显而易见的药品的有害微生物举例：,63,在注射剂中经常会发现下述要求：,“当按待检产品无菌测试要求进行膜过滤法测试时符合要求。”,各,论中对无菌的通常要求,在各论中另一种指出无菌测试要求的方法是什么呢？,在注射剂中经常会发现下述要求：各论中对无菌的通常要求,64,吗啡硫酸盐注射剂：“,其他要求,符合注射剂项下要求。,”,各,论中对无菌的通常要求,FromInjections,注射剂：,无菌测试,-,注射剂应符合无菌测试,的要求,吗啡硫酸盐注射剂：“其他要求符合注射剂项下要求。”各论中,65,美国传统的对无菌的观点：“,没有细菌或其它微生物,”,什么是“无菌”,灭菌和无菌保证中的观点“按照无菌最严格的定义，只有当样品中完全没有活的微生物时，它才能被称为是无菌的”,证明产品中完全没有活的微生物，有可能吗？,美国传统的对无菌的观点：“没有细菌或其它微生物”什么是“无菌,66,不能，除非你不准备留下产品进行销售，因为你不将整批产品进行逐个破坏检查是无法证明绝对无菌的,无菌测试的首要难点,尽管批产品中有污染，但通过无菌测试的概率有多大呢？,不能，除非你不准备留下产品进行销售，因为你不将整批产品进行逐,67,无菌测试的首要难点,假设生产无菌注射剂，批量为,20,，,000,瓶，该批染菌率为,0.1%,，即,20,瓶，从,20,，,000,中随机抽取,20,（,n,）瓶进行无菌检查，检查合格的机会,P,为多少？,P=,（,1-0.1%,）,20,=,98,%,无菌测试的首要难点假设生产无菌注射剂，批量为20，000瓶，,68,首要难点的推论,如果你不能评估批产品中的每个产品，那根据什么判断产品的？,无菌是根据概率的原则判断的。从给定批号的所有产品中存在被污染产品的概率得出判断目的是使其可能性与真实性仅有可接受的微小差异。在无菌保证中将详细讨论。,首要难点的推论如果你不能评估批产品中的每个产品，那根据什么判,69,我们现在知道不能用无菌测试合格来证明整批产品的无菌性,无菌测试,那么，一个产品通过无菌测试能证明什么呢？,我们现在知道不能用无菌测试合格来证明整批产品的无菌性无菌测试,70,无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。产品的无菌保证是通过灭菌工艺或灭菌工艺的验证来得到的。,无菌测试,无菌测试适用于药典要求无菌的药物成分，配剂或制剂。然而，合格结果仅说明在测试条件下受检的样品中未发现微生物污染。,无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。产品的无,71,无菌测试流程,培养基和细菌抑制,/,真菌抑制性测试（方法验证）,去除任何抑制细菌和真菌生长的因素,确定用于测试的样品数量，每个样品的用量,培养样品,检查测试样品是否有生长的迹象,显微镜检查有疑问的容器是否有生长的迹象,必要的话再接种培养,写报告,无菌测试流程培养基和细菌抑制/真菌抑制性测试（方法验证）,72,无菌测试：培养基测试,培养基储存,2-25,无菌，密闭容器,储存不超过验证的期限,巯乙醇酸盐液体培养基颜色指示要求符合,培养基的无菌,每种要求的培养基取一部分在特定温度下培养,14,天，检查是否浑浊？（为什么不止一个温度？）,与测试同时进行培养基的无菌检查（这样做有什么风险吗？）,无菌测试：培养基测试培养基储存,73,无菌测试：培养基测试,生长能力测试：,细菌培养,3,天，真菌培养,5,天,检查生长的迹象,“生长”看起来是什么样的？,无菌测试：培养基测试生长能力测试：,74,无菌测试：方法适用性测试,产品特性允许的话，首选膜过滤法,解释：,如果生长，有浑浊产生，和对照一致。,如果不是，你需要修改测试条件以去除抗菌活性,如何做呢？,无菌测试：方法适用性测试产品特性允许的话，首选膜过滤法,75,无菌测试：常规方法,测试的样品量是多少？,每个容器中需要转移出的样品量，例如：液体（非抗生素）,:,装量小于,1ml/,瓶,所有内容物；固体：装量,300mg,5g150mg,每种培养基的样品测试的数量，例如：批量大于,500,瓶,2%,或,20,瓶，取少量。,当一个容器的内容物足够用于两种培养基时，该测试数量可等分至两种培养基，否则按药典表中取双倍数量,无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？,76,无菌测试：常规方法,测试的样品量是多少？,膜过滤法时，可能的话，使用容器中所有样品,直接接种法时，两种培养基中使用同样的样品，除非一个容器中的样品不够用于两种培养基,无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？,77,无菌测试：通常的注意点,无菌测试在无菌环境中进行,注意避免污染的同时，注意不要影响测试对微生物的检出,进行测试的工作环境应通过对工作环境取样，进行定期监控并进行适当的控制,无菌测试时包括适当的阴性对照,无菌测试：通常的注意点无菌测试在无菌环境中进行,78,无菌测试：常规方法,培养条件：,巯乙醇酸盐液体培养基在,32.52.5,培养不少于,14D,，,TSB,在,22.52.5,培养不少于,14D,，,观察,在,14D,的培养过程中定期观察培养基,显微镜检查（浑浊的话，除非合理的将结果视为无效）,无菌测试：常规方法培养条件：,79,无菌测试：结果解释,只有一项或多项下列情况发生时，测试才可能被考察为,无效测试,：,无菌测试区域的微生物环控数据显示有错误发现,发现测试过程有错误,阴性对照发现微生物阳性,测试污染微生物鉴定后，能明确地将微生物生长归因于用于无菌测试使用的物料,/,技术发生错误无效测试可重新进行测试,无菌测试：结果解释只有一项或多项下列情况发生时，测试才可能被,80,微生物特性确定，鉴定及菌株分,型,-,概述,USP35-NF30,2012,年,5,月,1,日,生效,内容,介绍,纯培养分离,初步筛选及初步确认,表型微生物鉴定,基因型微生物鉴定,微生物鉴定方法确认,生物种类史思考,微生物特性确定，鉴定及菌株分型-概述USP35-NF30 2,81,何时需要进行微生物定性,在下述情况中检出的微生物,原料药,辅料,制药用水,生产环境,中间体,成品,何时需要进行微生物定性在下述情况中检出的微生物,82,微生物定性程度,微生物特性确定,微生物鉴定,菌株分离,微生物定性程度微生物特性确定微生物鉴定菌株分离,83,微生物定性程度,微生物特性确定,利用菌落形态学、细胞形态学，不同的染色计数，重要的诊断特性来确定实验室分离得到的微生物的特性，用于趋势分析及调查，并不是鉴定。,适用于大多数非无菌生产运作及部分无菌生产环境的风险评估。,微生物定性程度微生物特性确定利用菌落形态学、细胞形态学，不同,84,微生物定性程度,微生物鉴定,定义：确定实验室分离的微生物的类别，大类（如细菌，酵母菌或霉菌），小类（如属、种）。,更明确的鉴定到种和属，某些方法甚至鉴定到株。,当产品中的微生物数量高于制定限度或出现异常高的微生物检出率时，尤其适用。,对无菌工艺很有帮助，对在无菌测试阳性及模拟工艺，如培养基灌装，失败时检出的微生物污染进行评估时是必须的。,微生物定性程度微生物鉴定定义：确定实验室分离的微生物的类别，,85,微生物定性程度,微生物鉴定,控制菌检测中，特别指出，当在选择性或指示培养基上发现的疑似菌落需进行确认鉴定。,建议对分离得到的微生物进行适当频率的鉴定，以支持环境监测计划。,对大量的非致病微生物，如葡萄球菌，棒状杆菌，微球菌，一般鉴定到属。,微生物定性程度微生物鉴定控制菌检测中，特别指出，当在,86,微生物定性程度,菌株分离,菌株分型是临床及公共健康微生物学中，流行病学调查的组成部分。方法包括脉冲场凝胶电泳，核糖体,DNA,测序，随意引物聚合酶链反应，全基因组序列限制图或光学图，用于证明微生物是相同菌株，并非常可能是同一来源。,用于调查微生物的来源。,微生物定性程度菌株分离菌株分型是临床及公共健康微生物学中，流,87,微生物定性程度,菌株分离,对无菌工艺很有帮助，对在无菌测试阳性或模拟工艺失败时检出的微生物污染进行评估时是必须的。,无菌测试允许，当测试中分离的微生物经鉴定，其生长明确归因于与物料和,/,无菌测试中所用到的技术相关的错误，该测试可判断为无效。,微生物定性程度菌株分离对无菌工艺很有帮助，对在无菌测试阳性或,88,微生物鉴定步骤及方法,分离纯培养,初步筛选及特性确定,表型微生物鉴定,基因型微生物鉴定,微生物鉴定步骤及方法分离纯培养,89,第三部分,培养基的质量控制和规范化操作,第三部分培养基的质量控制和规范化操作,90,目录,培养基制备的质量控制,2,培养基使用规范,4,培养基测试,3,3,培养基的确认和接收,3,1,培养基有效期的验证,3,5,目录培养基制备的质量控制2培养基使用规范4培养基测试33培养,91,培养基定义,培养基（,Medium,）是供微生物、植物组织和,动物组织,生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、,无机盐,（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。,培养基定义培养基（Medium）是供微生物、植物组织和动物组,92,培养基特点,培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被,细菌,污染或,分解,变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。,对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须冷藏存放。,培养基特点培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管,93,购置,验收要求,技术数据,清单,产品名称、编号,批号,使用前的,pH,必要的安全,/,危害数据,有效期,生产企业提供材料：,产品标签,购置验收要求技术数据产品名称、编号批号使用前的pH必要的安全,94,购置验收要求,生产企业提供材料：,质控证书,性能评价,所用测试菌株,购置验收要求生产企业提供材料：质控证书性能评价所用测试菌株,95,购置验收要求,实验室验收,例行常规检查内容,使用前检查,(,即用型培养基,),购置验收要求实验室验收,96,培养基储存,培养基的储存条件应按照供应商的要求进行。,大部分培养基应储存在干燥、阴凉处，温度一般为,15,25,。,部分培养基需要储存在,2,8,。,培养基储存培养基的储存条件应按照供应商的要求进行。,97,培养基储存,培养基应建立台账，至少应包括以下信息：,名称、批号、数量、规格、有效期、到货日期、,验收日期、有效期、储存地点、储存条件,依据“先进先出”原则进行使用。,应制定开瓶的培养基的使用周期。,培养基储存 培养基应建立台账，至少应包括以下信息：,98,药典,2010,版，,2,部,除附录另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行,1,次。,如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均要进行适用性检查试验，试验的菌种可根据培养基的用途从相关附录中进行选择，也可增加从生产环境及产品中常见的污染菌株。,培养基制备的质量控制,药典2010版，2部培养基制备的质量控制,99,培养基用水,配制环境,器具,称量,溶解,培养基制备的质量控制,pH,灭菌前分装,灭菌,灭菌后,分装,储存,培养基用水培养基制备的质量控制 pH,100,成品质量检查,外观检查,pH,值,无菌性检查,促生长能力,抑菌能力,指示能力,培养基测试,成品质量检查培养基测试,101,外观检查,外观、色泽和均一性,无沉淀（一般）,无气泡,包装完整,琼脂凝胶,无裂痕,无褶皱,平板培养基应水平,特殊要求,培养基测试,外观检查培养基测试,102,pH,值,冷却至室温后测定。,应与培养基说明或相关法规要求范围一致。,如不符合，应进行,pH,值调整。,培养基测试,pH值培养基测试,103,无菌性检查,无菌检查用培养基均应进行无菌性检查。,用于环境监控的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行,100%,的预培养以防止外来的污染物带到环境中及避免出现假阳性结果。,其他试验用培养基应进行预培养。,培养基测试,无菌性检查培养基测试,104,菌种,菌悬液制备,促生长能力,抑菌能力,指示能力,培养基测试,菌种培养基测试,105,培养基使用规范,制备培养基的储存，注意,琼脂培养基易受冷冻的影响，不宜低于,0,，凝胶结构破坏。,避光、避热。,琼脂培养基密封，防止水分蒸发。,培养基使用规范制备培养基的储存，注意,106,培养基使用规范,融化,重复融化应被限制（不超过,1,次），防止过度加热或潜在污染,融化时，使用,水浴或流通蒸汽,微波炉，热板要防止过度加热,融化的培养基的储存,在,40-45,水浴不应超过,8h,浇制平皿前擦干防止污染,培养基使用规范融化,107,培养基使用规范,-,存储,培养基应标示,批号，制备批号,制备日期，有效期,培养基名称,有效期确定,根据成分，配方，容器，储存条件等确定,生长能力试验数据支持,培养基储存不得超过有效期,培养基使用规范-存储培养基应标示,108,培养基使用规范,-,存储,培养基应根据生产商的说明书，并在验证过的条件下,储存,重要区域环控用培养基必须,双重包装,最终灭菌，否则进行全数预培养及用前检查,应根据当地生物危险品安全程序处置过期培养基,培养基使用规范-存储培养基应根据生产商的说明书，并在验证过的,109,培养基使用规范,记录,入库记录,配置记录,灭菌记录,菌种使用记录,培养箱使用记录,培养基质量检测记录,培养基配制验证报告,培养基有效期验证报告,培养基使用规范记录,110,培养基有效期的验证,培养基有效期：,干粉培养基,未开封，按照商品说明制定。,已开封，依据培养基组分性质制定，有效期应适中。,外购成品培养基,参考商品说明和有效期验证结论制定。,培养基有效期的验证培养基有效期：,111,培养基有效期的验证,培养基有效期：,自制成品培养基,平板固体培养基：有效期一般为七天,未密封培养基：有效期一般为,21,天,密封培养基：有效期最长不超过一年,培养基有效期的验证培养基有效期：,112,培养基有效期的验证,培养基有效期验证内容：,外观检查,pH,值,无菌性检查,促生长能力,抑菌能力,指示能力,培养基有效期的验证培养基有效期验证内容：,113,培养基有效期的验证,培养基有效期验证阶段：,有效期较短的培养基：,两点验证：,0,天、有效期截止时间（可适当延长）,应有验证报告,有效期较长的培养基：,多点验证：,0,天、有效期内选择验证时间点、有效期截止时间（可适当延长）,验证报告,定期的培养基质量检查,培养基有效期的验证培养基有效期验证阶段：,114,第四部分,菌种管理,第四部分菌种管理,115,目录,菌种管理,2,菌种确认,4,菌种复苏、传代、保藏,3,3,菌种概述,3,1,目录菌种管理2菌种确认4菌种复苏、传代、保藏33菌种概述31,116,菌种概述,菌种泛指从自然界获取的各种微生物的不同的种。,标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。,标准储备菌株：由标准菌株经传代得到的培养物。,工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。,商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。,代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。,菌种概述 菌种泛指从自然界获取的各种微生物的不同的种。,117,菌种概述,中国药典,2010,年版,在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规定,实验室认可准则,检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明（,CNAS-CL09,）,USP,菌种概述 中国药典2010年版,118,菌种概述,涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（,CMCC,）提供,。,CMCC,提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。,美国模式培养物集存库,(American type culture collection,ATCC),ATCC,向全球发布其获取、鉴定、保存及开发的生物标准品，推动科学研究的验证、应用及进步,菌种概述 涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中,119,菌种概述,中国医学菌种保藏,中心提供的标准菌株,ATCC,的标准菌株,商业派生菌株,自制冷冻保藏菌株,菌种概述 中国医学菌种保藏ATCC的标准菌株商业派生菌株自制,120,为保证菌种的质量应对以下几个方面进行控制：,文件管理,效期管理,标识管理,确认管理,使用管理,菌种管理,为保证菌种的质量应对以下几个方面进行控制：菌种管理,121,菌种的使用：,菌种采购,菌种的接受和储存,菌种的复苏,菌种的传代,工作菌悬液的制备,菌种的保存,菌种的确认,菌种的销毁,菌种管理,菌种的使用：菌种管理,122,实验环境,应在生物安全柜中进行菌种的传代,冻干保藏菌种处理,用,75%,酒精棉消毒菌种管外壁。,先用砂轮在安瓶上三分之一处划痕，再用干燥的无菌纱布包裹安瓶，最后将安瓶掰开。,用无菌吸管将胰酪胨大豆肉汤培养基0.5ml左右注入被开启的菌种安瓶中吹打，使安瓶中的冻干菌种溶解成菌悬液。,菌种复苏,实验环境菌种复苏,123,甘油冷冻,保藏菌种处理,将甘油冷冻保藏菌种置于,2,8,至融化。,用75%酒精棉消毒菌种管外壁。,用无菌吸管混匀菌种悬液,接种：,用无菌吸管吸取适量菌种悬液加入到适量胰酪胨大豆肉汤培养基中，其中生孢梭菌加入到硫乙醇酸盐流体培养基中进行复苏,，并做好标识。,菌种复苏,菌种复苏,124,培养：,将接种好的培养基置于培养箱中进行培养。细菌于,30,35,培养,18,24,小时；真菌于,23,28,培养,24,48,小时。,废弃物灭菌：,将染菌的器具、试剂等浸泡消毒液，进行湿热灭菌,121,30min,后废弃或清洗。,菌种复苏,菌种复苏,125,实验环境,应在生物安全柜中进行菌种的传代。,混匀,：,用无菌吸管混匀培养好的菌种复苏培养物。,接种：,用无菌吸管吸取适量菌种复苏培养基加入到适量的适宜胰酪胨大豆肉汤培养基或胰酪胨大豆琼脂培养基中。其中生孢梭菌提供厌氧环境或加入到硫乙醇酸盐流体培养基中进行传代；黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基。,已接种菌种的培养基均应做好标识。,菌种传代,实验环境菌种传代,126,培养：,将接种好的培养基置于培养箱中进行培养。,接种于液体培养基时，细菌于,30,35,培养,18,24,小时；真菌于,23,28,培养,24,48,小时。,接种于固体培养基时，细菌于,30,35,培养,24,48,小时；白色念珠菌于,23,28,培养,48,72,小时；黑曲霉于,23,28,培养,5,7,天。,废弃物灭菌：,将染菌的器具、试剂等浸泡消毒液，进行湿热灭菌,121,30min,后废弃或清洗。,菌种传代,培养：菌种传代,127,保藏原理,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。,其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态,。,菌种保藏,保藏原理菌种保藏,128,保藏方式,各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。,一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。,菌种保藏,保藏方式菌种保藏,129,保藏方式,斜面低温保藏法,甘油冷冻,低温,保藏法,液体石蜡,封藏法,冷冻真空干燥保藏法,液氮超低温保藏法,菌种保藏,保藏方式菌种保藏,130,菌悬液准备,取培养好的菌种传代液体培养物或刮取培养好的菌种传代固体培养物上的菌落至无菌,0.9%,氯化钠溶液中，并用无菌,0.9%,氯化钠溶液稀释至,1,10,6,5,10,6,CFU/ml,。,取经2328培养5-7天的黑曲霉固体培养物，加入含0.05%吐温的无菌0.9%氯化钠溶液10ml洗下孢子，吸出转移至无菌试管作为原液，用含0.05%吐温的无菌0.9%氯化钠溶液做10倍系列稀释成110,6,-510,6,CFU/ml的菌悬液。,菌种保藏,菌悬液准备菌种保藏,131,10%,甘油菌悬液,向已制备好的菌悬液中加入等体积浓度为,20%,的无菌甘油溶液，得到,10%,甘油菌悬液。,分装：,将,10%,甘油菌悬液无菌分装至已灭菌的保存管中，每管,1.0ml,，并标记菌种名称、代次、编号、传代时间。,保藏：,将菌种保存管置于程序降温盒中，在,-70,的冰箱中保存过夜。,将保存过夜的菌种保存管从程序降温盒中取出，放置于菌种专用保藏容器中，于,-70,以下保存，保藏有效期为,1,年。,菌种保藏,10%甘油菌悬液菌种保藏,132,菌种保藏,外购的,0,代标准菌株,复苏，,1,代,传代，,2,代,2,代储备菌种,复苏，,3,代,传代，,4,代工作菌种,2,代储备菌种,菌种保藏外购的0代标准菌株复苏，1代传代，2代2代储备菌种复,133,菌种确认,确认要求：,所有标准菌株在进行菌种保存后，应取一支保存菌种进行菌种鉴别，符合要求后方可做为标准菌株储备菌种使用,。,包括以下几个方面：,纯培养：菌落生长情况,染色镜检,菌种特性检查,生化试验,血清学检查,菌种确认确认要求：,134,菌种确认,纯培养,所谓微生物的纯培养是指在一个微生物的菌落形成单位中，所有的微生物细胞或孢子都属于生物学的同一个种。,严格地说，纯培养是在培养基上由一个细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代。,在该细胞或孢子的生长过程种，不受其他微生物的侵犯，不会在培养物中产生另外微生物种的后代，在整个生长过程中不发生变异或死亡,。,菌种确认纯培养,135,菌种确认,纯培养,菌种,确认,人员按照,相应规程,对菌种就进行复苏培养。,如有厌氧需要，应提供厌氧环境进行培养。,菌种,确认,人员挑取传代培养物，在适当的通用微生物培养基上用进行扇形划线分离，经过适当的培养后得到分离的纯培养单菌落。,菌种鉴别人员对菌种的菌落形态进行记录，,菌落形态应相似，,包括但不限于,菌,落,的隆起度、表面形态、边缘、光泽、质地、颜色、透明程度、表面菌落、深层菌落和底层菌落等，并进行拍照存档,。,菌种确认纯培养,136,菌种确认,染色镜检,革兰氏染色,芽孢染色,荚膜染色,镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似,。,菌种确认染色镜检,137,菌种确认,菌种特性检查,生化试验,各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。,根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验,。,血清学检查,指抗原抗体反应。,抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应,。,菌种确认菌种特性检查,138,菌种确认,大肠埃希菌的,确认,菌落形态,取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经,30,35,培养,18,24h,后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。,曙红亚甲蓝琼脂,(EMB),琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。,麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。,菌种确认大肠埃希菌的确认,139,菌种确认,大肠埃希菌的,确认,革兰染色、镜检,革兰染色：取菌落形态观察操作的培养物少许进行革兰氏染色，待干后，镜检。,染色结果：革兰阴性菌呈红色。,镜检结果：短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。,菌种确认大肠埃希菌的确认,140,菌种确认,大肠埃希菌的,确认,生化试验,靛基质试验，实验结果应为阳性。,甲基红试验，实验结果应为阳性。,乙酰甲基甲醇生成试验，实验结果应为阳性。,枸橼酸盐利用试验，实验结果应为阳性。,乳糖发酵试验，实验结果应为产酸产气。,菌种确认大肠埃希菌的确认,141,菌种确认,金黄色葡萄球菌的,确认,菌落形态,取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经,30,35