-柠檬酸谷氨酸发酵机制

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,一、柠檬酸简介,柠檬酸又名枸橼酸，学名,-,羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称,2-,羟基丙三羧酸，英文文献俗名,citric acid,，分子式,C,6,H,8,O,7,。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。,第一节 概述,第四章 柠檬酸发酵机制,食品工业：,主要作为饮品的,酸味剂,，用于各种清凉饮料，还有汽水、糖果、饼干、罐头、果酱、果汁等食品的制造。 也可用作油脂的,抗氧剂,；,医药工业：,是许多医药品的,原材料,，如柠檬酸哌吡嗪（驱蛔虫药）、柠檬酸铁铵（补血剂）、柠檬酸钠（输血剂）等。此外，柠檬酸还用在许多医药中做,酸化剂,；,化学工业：,柠檬酸的酯类可以作为无毒增塑剂，来制造食品包装的塑料薄膜；,其它方面，,如用于工业、民用的洗涤剂中作为助剂，制造无公害洗涤剂；用在混凝土中作缓凝剂；在电镀中、皮革业、油墨、晒图等工业中也被得到广泛应用。,二、柠檬酸的应用概况,三、我国柠檬酸生产现状,生产状况：,60,年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界第一，出口量一直占国内总产量的,50%,以上。目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有,6,家。主要有,安徽丰原生物化学集团公司,（生产能力为,12.0,万吨,/,年）、,江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司,（生产能力为,4.0,万吨,/,年）、,安徽华源生物药业有限公司,（生产能力为,3.5,万吨,/,年）等。,存在问题：,出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利用率不到,60%,，行业经济效益呈滑坡态势。,第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控,1940,年，,Krebs: TCA,；,1953,年，,Jagnnathan,证实黑曲霉中存在,EMP,途径所有酶；,1954,年，,Shu,提出葡萄糖,80%,经,EMP,途径代谢；,1954-1955,年，,Ramakrishman,等发现黑曲霉中存在,TCA,循环。,一、柠檬酸合成途径的发现,二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径,黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经,EMP,、,HMP,途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰,CoA,，另一方面经,CO,2,固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰,CoA,缩合生成柠檬酸。,(1),生长期与产酸期都存在,EMP,与,HMP,途径，前者,EMP:HMP=2:1,，后者,EMP:HMP=4,：,1,(2),黑曲霉柠檬酸产生菌中存在,TCA,循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵，当柠檬酸积累时，,TCA,和乙醛酸循环被,阻断或减弱,。,(3),由于,TCA,和乙醛酸循环被阻断或减弱，,草酰乙酸,是由丙酮酸（,PYR,）或磷酸烯醇式丙酮酸（,PEP,）羧化生成的。即由两个,CO,2,固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化,CO,2,生成草酰乙酸为主。,三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制,1,、磷酸果糖激酶（,PFK,）：,（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节,Mn,2+,浓度对磷酸果糖激酶的影响,Mn,2+,缺乏为何会使,NH,4,+,浓度升高呢,？,当培养基中,Mn,2+,缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（,GA,、,GLu,、,Arg,、,Gln,等），这些氨基酸的积累，意味着体内,蛋白质的合成受阻,，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样,NH,4,+,的消耗下降，,NH,4,+,浓度就会升高。,磷酸果糖激酶（,PFK,）的调节,柠檬酸和,ATP,对该酶有抑制,生产菌需要解除该抑制作用,AMP,、无机磷以及,NH,4,+,对该酶有活化作用,NH,4,+,有效解除柠檬酸和,ATP,对该酶有抑制 ，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量,Mn,2+,的影响：,Mn,2+,缺乏,菌体的,TCA,酶活下降,Mn,2+,缺乏,可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解,NH,4,+,水平升高,减少柠檬酸对该酶的抑制,2,、,CO,2,固定反应,通过,CO,2,固定反应提供,C4,二羧酸,（,1,）磷酸烯醇式丙酮酸,+ CO,2,=,草酰乙酸（,C4,二羧酸）,酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,（,2,）丙酮酸,+ CO,2,=,草酰乙酸（,C4,二羧酸）,酶：丙酮酸羧化酶,以上两种,CO,2,固定反应所需要的辅酶都是生物素。,草酰乙酸的积累利于加速柠檬酸合成,（二）三羧酸循环的调节,1,、柠檬酸合成酶的调节：,柠檬酸合成酶是,TCA,循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。,2,、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：,顺乌头酸水合酶、,NAD,和,NADP-,异柠檬酸脱氢酶,在柠檬酸产生与不产生时，这,3,种酶均存在（,组成酶,）；而控制铜离子,0.3mg/L,，铁离子,2mg/L,和,pH2.0,情况下，这,3,种酶均不出现活力。,顺乌头酸水合酶,是催化柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸可逆反应。研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸,:,顺乌头酸,:,异柠檬酸,90:3:7,。,铁为顺乌头酸酶的激活剂，,3,、,-,酮戊二酸脱氢酶的调节,在黑曲霉柠檬酸产生菌中，,TCA,循环的一个显著特点是，,-,酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏,。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在,-,酮戊二酸脱氢酶或活力很低。,-,酮戊二酸脱氢酶催化的反应是,TCA,循环中,唯一不可逆反应,，一旦,-,酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：,TCA,循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆,TCA,循环生成，使,TCA,循环成,“,马蹄形,”,。,-,酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。,菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过,EMP,到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：,丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的,NADH,，在有氧的条件下，每分子的,NADH,经过呼吸链彻底氧化成,H,2,O,，并氧化磷酸化产生,3,分子的,ATP,，造成了微生物体内,能荷,的增加，,能荷增加则抑制,PFK,等关键酶的酶活性,，使得从葡萄糖到柠檬酸的,代谢停止,。,（三）能荷,调节对柠檬酸发酵的影响,如果,NADH,（还原型）不能够快速的被氧化转变成,NAD,（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的,NAD,而停止，仍然不能够合成柠檬酸。,柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，,NADH,即被氧化了，又没有产生,ATP,。,解偶联剂（,uncoupler,）,使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对,H,+,的通透性，消除,H,+,梯度，因而无,ATP,生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。常用解偶联剂主要有：,质子载体：,2,，,4-,二硝基酚,(DNP),，羰基,-,氰,-,对,-,三氟甲氧基苯肼,(FCCP),。,质子通道：增温素（,thermogenin,）。,其它离子载体：如缬氨霉素。,某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。,一种假设：该菌体内存在一条,侧系呼吸链，,NAD(P)H,经过该呼吸链，可以正常的传递,H,+,，将其氧化为,H,2,O,，但是并没有氧化磷酸化生成,ATP,；,能够正常产生,ATP,的呼吸链称之为,标准呼吸链,。,实验证明，在某些微生物体内确实存在,侧系呼吸链,，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，,如在柠檬酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度在很低水平维持一段时间，或中断供氧一段时间（,20,分钟），则这一侧系呼吸链,不可逆的失活,，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体,。,草酰乙酸,柠檬酸,琥珀酸,异柠檬酸,苹果酸,延胡索酸,乙醛酸,乙酰,CoA,乙酰,CoA,乙酸,乙酸,（四）乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸,丙酮酸脱羧反应是不可逆的，存在,异柠檬酸裂解酶,，草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成,3,醋酸,1,柠檬酸,生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸,顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸,= 90,：,7,：,3,。细胞质中积累大量异柠檬酸。,Mn,2+,缺乏抑制蛋白合成,NH,4,+,，有一条呼吸活动强的不产生,ATP,的侧呼吸链：,解除磷酸果糖激酶的代谢调节,，,促进,EMP,途径畅通。,丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰,CoA,和,CO,2,的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。,小结：,顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：,柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸,=90,：,3,：,7,同时控制,Fe,2+,含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。,随着柠檬酸积累，,pH,降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。,（五）柠檬酸发酵的产率,1,、无,CO,2,固定反应的产率,合成,1,分子柠檬酸需要,3,分子乙酰辅酶,A,，也就是需要,1.5,分子的葡萄糖。,理论产率为：,192 /( 1801.5) = 71.1%,2,、通过,CO,2,固定反应提供,C,4,二羧酸,四、柠檬酸发酵过程的控制要点,（,1,）控制,Mn,2+,、,NH,4,+,浓度，解除柠檬酸对,PFK,的抑制，使,EMP,畅通无阻。,（,4,）控制培养基中的,Fe,2+,的浓度及产酸发酵的,pH,，使顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶失活。,（,2,）控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。,（,3,）筛选丙酮酸羧化酶高活性菌株，培养基生物素含量充足,，,提高,CO2,固定合成草酰乙酸能力,柠檬酸发酵中，三个控制点,C,6,H,12,O,6,控制,Mn,+,NH,4,+,浓度，解除柠檬酸对,PFK,的抑制,（,1,）点：,EMP,畅通无阻,控制溶氧，防止侧系呼吸链失活,丙酮酸,+,丙酮酸,（,2,）点：通过,CO,2,固定反应生成,C4,二羧酸,乙酰辅酶,A + C4,二羧酸,柠檬酸,（,3,）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低，控制培养基中的,Fe,2+,的浓度,柠檬酸发酵中，三个控制点,五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：,1.,透明圈大的菌株,平板：,10%,甘薯,+ 2 %,的琼脂,+ 0.5% CaCO,3,诱变后，涂布，透明圈大的则好,2.,显色圈大小,平板：麦汁培养基,+ pH,值指示剂 诱变后，,33,培养,3,天，变色圈大的则好。,3.,不分解柠檬酸的菌株,不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其,TCA,循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。,方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。,4.,选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株,在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使,TCA,循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。,（中间产物少，,C,架少，不利于合成代谢，不利于孢子的形成）,第五章 氨基酸发酵机制,（谷氨酸发酵）,一、概 述,在食品工业上的应用,。,甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸具有酸味，谷氨酸钠、天冬氨酸钠具有鲜味，可用作食品添加剂。蛋氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸目前作为饲料添加剂。,在医药工业上的应用,。,氨基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉剂可作宇航员、飞行员的补品。精氨酸药物用于治疗由氨中毒造成的肝昏迷；丝氨酸药物用作疲劳回复剂；蛋氨酸、胱氨酸用于治疗脂肪肝；,L,谷氨酸与,L,谷氨酰胺用于治疗脑出血后的记忆力障碍等。,在化妆品生产中的应用,。,氨基酸及其衍生物与皮肤的成分相似，具有调节皮肤,pH,和保护皮肤的功能。胱氨酸用于护发素中，丝氨酸用于面霜中。谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸与脂肪酸形成的表面活性剂，具有清洗、抗菌等功能，用于护肤品、洗发剂。,在农业上的应用,。,一些氨基酸在体外并无杀菌功能，但能干扰植物与病原菌之间的生化关系，使植物的代谢及抗病能力发生变化，从而达到抑菌的目的。苯丙氨酸和丙氨酸可用于治疗苹果疮痂病。用甘氨酸制成了除草剂，易被微生物分解，不会造成环境污染。,氨基酸的制备方法,发酵法,：发酵法又可分为,直接发酵法,与,添加前体的发酵法,。添加前体法是以氨基酸的中间产物为原料，用微生物法转化为相应的氨基酸。,提取法,：将蛋白质原料用酸水解，然后从水解液中提取氨基酸。目前，胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用提取法生产。,酶法,：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。,合成法,：用化学合成法制造的氨基酸有,DL-,蛋氨酸、,DL-,丙氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸。,二、氨基酸的发酵生产,氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异，然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。,按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：,谷氨酸族,（,-,酮戊二酸族）,包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸；,丙酮酸族,包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；,天冬氨酸族,（草酰乙酸族）,包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；,磷酸甘油酸族,包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；,芳香族,包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；,组氨酸,合成为单独的一条途径。,氨基酸,使用的菌株,谷氨酸,谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌或黄色短杆菌、北京棒杆菌、钝齿棒杆菌,缬氨酸,北京棒杆菌、乳糖发酵短杆菌,丙氨酸,凝结芽孢杆菌,脯氨酸,链形寇氏杆菌、黄色短杆菌,赖氨酸,黄色短杆菌、乳糖发醇短杆菌、谷氨酸棒杆菌,苏氨酸,大肠杆菌、大肠杆菌,鸟氨酸,谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌,亮氨酸,黄色短杆菌,酪氨酸,氨酸棒杆菌,部分氨基酸及其生产所用菌株,氨基酸发酵是典型的,代谢控制发酵,氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的产物,氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累的关键是取决于是否能打破微生物的正常代谢调节。,控制旁路代谢,降低反馈作用物的浓度：控制反馈作用物浓度是克服反馈抑制和阻遏，使氨基酸的生物合成反应能顺利进行的一种手段,消除终产物的反馈抑制与阻遏：通过使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法来进行,控制细胞渗透性,控制发酵环境,促进,ATP,的积累，以利于氨基酸的生物合成,D-,苏氨酸,L-,苏氨酸,-,酮基丁酸,L-,异亮氨酸,L-,苏氨酸,脱氢酶,反馈抑制,D-,苏氨酸,脱氢酶,谷氨酸,N-,乙酰谷氨酸,N-,乙酰,-,谷氨酰磷酸,N-,乙酰谷氨酸,-,半醛,N-,乙酰鸟氨酸,鸟氨酸,瓜氨酸,精胺琥珀酸,精氨酸,负反馈控制,N-,乙酰谷氨酸激酶,Arg,-,天冬氨酸,天冬氨酰胺磷酸,天冬氨酸半缩醛,高丝氨酸,苏氨酸,赖氨酸,天冬氨酸激酶,协同反,馈抑制,谷氨酸产生菌因环境条件变化而引起的发酵转换,环境因子,发 酵 产 物 转 换,溶解氧,谷氨酸,乳酸和琥珀酸,酮戊二酸,（通气不足）,（适中）,（通风过量，转速过快）,NH,4,+,酮戊二酸,谷氨酸,谷氨酰胺,（适量）,（缺乏）,（过量）,pH,值,谷氨酰胺，,N-,乙酰谷酰胺,谷氨酸,（,pH,值,5,5.8,，,NH,4,+,过多）,（中性或微碱性）,磷酸,缬 氨 酸,谷氨酸,（高浓度磷酸盐）,（磷酸盐适中）,生物素,乳酸或琥珀酸,谷氨酸,（过量）,（限量）,早期生产谷氨酸的方法有两种，一是提取法：甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处理可得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋加酸水解，再分离提纯。,1957,年发酵法生产谷氨酸在日本协和发酵公司投产。,通过代谢调控发酵谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量,300,多倍的谷氨酸,三、谷氨酸发酵,（一）合成谷氨酸的,生化途径,葡萄糖,丙酮酸,草酰乙酸,柠檬酸,琥珀酸,透过细胞膜,异柠檬酸,-,酮戊二酸,谷氨酸,谷氨酸,谷氨酸的生物合成途径大致是：,葡萄糖,经糖酵解（,EMP,途径）和己糖磷酸支路（,HMP,途径）生成,丙酮酸,，再氧化成乙酰辅酶,A,（乙酰,COA,），然后进入三羧酸循环，生成,酮戊二酸,。,酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有,NH,4,+,存在的条件下，生成,谷氨酸,。,Glucose,的酵解，,EMP,Glucose,的有氧氧化，,HMP,丙酮酸的有氧氧化，,TCA,循环,乙醛酸循环途径，,DCA,循环,CO,2,固定反应,-KGA,的还原氨基化,（二）谷氨酸生产菌的生化特征,内在因素,1,生物素缺陷型,谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,控制生物素亚适量,(,贫乏量,) ,引起菌种代谢失调,使谷氨酸得到大量积累。,2,具有,CO,2,固定反应的酶系,菌种能利用,CO,2,产生大量草酰乙酸,有利于谷氨酸的大量积累。,3.-KGA,脱氢酶酶活性微弱或丧失,这是菌体生成并积累,-KGA,的关键，,-KGA,是菌体进行,TCA,循环的中间性产物，很快在,-KGA,脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶,A,，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由,-KGA,进行还原氨基化生成,GA,的可能性很少。,只有当体内,-KGA,脱氢酶活性很低时，,TCA,循环才能够停止，,-KGA,才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。,4.GA,产生菌体内的,NADPH,氧化能力欠缺或丧失,（,1,）,NADPH,是,-KGA,还原氨基化,生成,GA,必须物质，该还原氨基化所需要的,NADPH,是与柠檬酸氧化脱羧,相偶联,的。,（,2,）由于,NADPH,的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的,NADPH,有一定的积累，,NADPH,抑制,-KGA,的脱羧氧化。,5.,乙醛酸循环（,DCA,）的关键酶,异柠檬酸裂解酶,该酶是一种,别构酶,，通过该酶酶活性的调节来实现,DCA,循环的封闭，糖的代谢才能沿着, -,酮戊二酸的方向进行,从而有利于谷氨酸的积累。,6.,强烈的,L-,谷氨酸脱氢酶活性,-KGA + NH,4,+,+NADPH = GA + NADP,L-,谷氨酸脱氢酶的酶活性强，, -,酮戊二酸易生成谷氨酸。,L-,谷氨酸脱氢酶催化,-,酮戊二酸易生成谷氨酸是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联的：,偶联反应,-KGA NADPH -KGA,GA NADP,异柠檬酸,L-,谷氨酸脱氢酶,异柠檬酸脱羧氧化,􀂄 氨基酸合成的方式,1.,氨基转移作用,：转氨酶催化的转氨反应,-,酮戊二酸和其它氨基酸经过转氨酶的作用下使,-,酮戊二酸转化成谷氨酸。,2.,谷氨酸合成酶催化反应,：,3.,还原氨基化作用,：,NH4+,供氢体辅酶,的存在下,-,酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下生成谷氨酸。,（三）,GA,生物合成的理论得率,1.,存在乙醛酸循环，体系不存在,CO,2,固定反应,3/2 C,6,H,12,O,6,+ NH,4,+,C,5,H,9,NO,4,+ 4 CO,2,产率：,147 /,（,180*3/2,）,= 54.4%,3/2Glucose,EMP,丙酮酸,+,丙酮酸,+,丙酮酸,CO,2,乙酰辅酶,A +,乙酰辅酶,A +,乙酰辅酶,A,柠檬酸（,DCA,循环）,谷氨酸,不存在,CO,2,固定反应,草酰乙酸,2.,封闭乙醛酸循环， 存在,CO,2,固定反应,C,6,H,12,O,6,+ NH,4,+,C,5,H,9,NO,4,+ CO,2,产率：,147 / 180 = 81.7%,Glucose,EMP,丙酮酸,+,丙酮酸,CO,2,CO,2,草酰乙酸,（草酰乙酸羧化酶）,乙酰辅酶,A + C4,二羧酸,苹果酸,（苹果酸合成酶）,柠檬酸（,DCA,循环封闭）,谷氨酸,存在,CO,2,固定反应,CO,2,固定反应,(1),磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,的作用下,磷酸丙酮酸,+ CO,2,+ GDP =,草酰乙酸,+ GTP,(2),苹果酸酶,的作用下,丙酮酸,+ CO,2,+NADH =,苹果酸,+ NAD,需要,Mn,2+,做辅因子，所以，在,GA,发酵过程中需要向培养基中补充,Mn,2+,（四）、生物素对,GA,发酵的影响,GA,产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：,V,H,-,生物素对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。,1.,生物素对糖代谢的影响,（,1,）,V,H,对于,糖酵解,有促进作用,;,对,丙酮酸的有氧氧化,乙酰辅酶,A,的生成也有促进作用，,对两者的,促进作用不一样,，对前者大一些。这样培养基中如果有较,丰富的,V,H,，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致,丙酮酸的积累,，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，,乳酸生成,，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的,pH,值下降。,当,V,H,缺乏时：,A,：,丙酮酸的有氧氧化就会减弱,(,由于,V,H,对,TCA,循环的促进作用,),，则：乙酰辅酶,A,的生成量就会少，产,醋酸浓度降低,，降低对异柠檬酸裂解酶的诱导作用；,B,：,V,H,对,TCA,循环促进作用的降低，使中间产物,琥珀酸,的氧化速度降低，产生积累，阻遏和抑制异柠檬酸裂解酶作用加强；,两者综合的作用：,异柠檬酸裂解酶的活性丧失,，,DCA,循环得到封闭。,（,2,）,对乙醛酸循的调控,。可以通过控制,V,H,的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。,当,V,H,丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性加强,，则,DCA,循环正常进行，,DCA,循环的进行，一方面提供了大量的,“,中间性产物,”,，另一方面，菌体的,能荷水平,得到提高。,前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。,结果是利于菌体的增殖和生长；则,GA,的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的,“,只长菌，不产酸,”,的现象。,以上分析说明，,GA,发酵过程中，,前期，,菌体的增殖期，一定量的生物素是菌体增殖所必需的；而在,产物合成期,，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。,2.,生物素影响细胞膜的通透性,用能积累谷氨酸菌株做如下,实验,:,生物素充足时,细胞内含大量谷氨酸,但培养液里几乎不含谷氨酸,用溶菌酶消化细胞壁得到的原生质体仍不分泌谷氨酸,当把原生质体放入低渗溶液里,将其涨破,谷氨酸才排出,生物素亚适量时,培养液里含大量谷氨酸,细胞里含量少,结论,:,谷氨酸的分泌是由细胞膜控制；生物素影响细胞膜的通透性进而影响谷氨酸积累,生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶,乙酰,CoA,羧化酶,的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成,.,当磷脂合成量少到正常的,1/2,左右时,细胞变形,Glu,向膜外泄漏,.,葡萄糖,丙酮酸,+,丙酮酸,乙酰辅酶,A,乙酰辅酶,乙酰辅酶,A,羧化酶,CO,2,丙二酰辅酶,A,C4,丙二酰辅酶,A,CO,2,C6,CO,2,培养基中生物素限量时，胞内,AA 92%,胞外,培养基中生物素丰富时，胞内,AA 12%,胞外,2. V,H,对菌体细胞膜通透性的影响,菌体进入产物合成期时，有,GA,的产生，如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以,解除,GA,对,L-,谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用,，从而使由,GlucoseGA,的高效率转化。,谷氨酸发酵采用的菌种都是,V,H,-,，而,V,H,又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，通过控制,V,H,的浓度，可以实现对菌体细胞膜通透性的调节。,限制发酵培养基中生物素,亚适量,(5-10,g/L).,在发酵初期,(0-8,小时,),细胞可以正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞,从生长型到积累型（细胞膜缺陷）转换,.,谷氨酸发酵过程中,合适的发酵条件如生长素、发酵温度、,pH,值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。,在实际生产中,只有针对存在的问题,严格控制工艺条件,才能达到稳产、高产的目的。,（五）,GA,发酵的外在因素,1.,供氧浓度,/,通风,过量：,NADPH,的再氧化能力会加强，使,-KGA,的还原氨基化受到影响，不利于,GA,的生成。,供氧不足：,则丙酮酸向乳酸方向转化，积累大量的乳酸，使发酵液的,pH,值下降，不利于,GA,的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了,糖酸转化率,，降低了产物的提出率。,2. NH,4,+,浓度,（,1,）影响到发酵液的,pH,值,（,2,）与产物的形成有关：,NH,4,+,过量，,菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产酸阶段,Glu,会受谷氨酰胺合成酶作用转化为,Gln,NH,4,+,不足，,不利于,-KGA,的还原氨基化，,-,酮戊二酸积累，引起反馈调节,NH,4,+,的供给方式：,（,1,）流加液氨,（,2,）流加,0.8%,尿素,3.,磷酸盐,过量：,（,1,）促进,EMP,途径，打破,EMP,与,TCA,之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等,（,2,）产生并积累,Val,，,Glucose,丙酮酸,+,丙酮酸,（焦磷酸硫胺素，,TPP,）,活性乙醛,-,乙酰乳酸,Val,Val,合成途径,Val,（,1,）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使,GA,的生物合成受到阻止,（,2,）消耗丙酮酸，降低了糖酸转化率,（,3,）发酵液中的,Val,存在，严重的影响,GA,的结晶、提取。,4.,发酵液的碳氮比,碳源,在一定范围内,谷氨酸的产量随糖含量的增加而增加；但糖含量过高,渗透压过大,对菌体生长不利,谷氨酸对糖的转化率低。发酵液中还原糖的含量一般应控制在,10 %,13 %,氮源,氮源是合成菌体细胞蛋白质、核酸和谷氨酸的氨基来源，大约,85%,的氮源被用于合成谷氨酸,，另外,15%,用于合成菌体。,谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为,100,：,0.22.0,，,谷氨酸发酵的碳氮比为,100,：,1521,。,在谷氨酸发酵过程中,菌体生长期碳氮比应大一些,(,氮低）,在产酸期,碳氮比应小些,(,氮高）,。,5.,生物素,对糖代谢的影响,对细胞膜通透性的影响,6.,发酵温度,谷氨酸发酵前期,应采取菌体生长最适温度,即,30,32 ,。,温度过低,菌体生长繁殖慢,;,若温度过高,菌体易衰老,生产中表现为,DO,值增长慢,耗糖慢, pH,值高,最终发酵周期长,产酸少。,发酵中、后期,菌体生长基本停止,为积累大量谷氨酸,应适当提高发酵温度,（,产谷氨酸的最适温度35-37 ,),。,但温度过高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。,7. pH,值,1,）,pH,值对谷氨酸产生菌生长的影响,当高于或低于最适生长,pH,值范围,:(1),菌体内的,酶,受到抑制,菌体新陈代谢受阻,生长停滞,; (2),菌体,细胞膜,所带电荷发生改变,从而改变细胞膜的渗透性,影响菌体对营养的吸收和代谢产物的排出,; (3),影响,培养基组分和中间代谢产物的离解,影响菌体对这些物质的利用。,2,）,pH,值对谷氨酸积累的影响,谷氨酸脱氢酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最适,pH,为,7.0,7.2 ,当发酵液的,pH,值偏酸时,(pH 5.0-5.8) ,谷氨酸脱氢酶受到抑制。,在发酵后期由于耗用大量,NH,4,+,pH,值下降,此时就要进行,pH,值调节,以保证发酵的正常进行。,前期,pH,（,7.58.0,），中后期,pH7.07.6,。通过采用流加尿素，氨水等办法调节,pH,，补充氮源,8.,泡沫,谷氨酸发酵是好气性发酵,因通风和搅拌产生泡沫是正常的,但泡沫过多会带来一系列问题,: (1),泡沫形成泡盖时,代谢产生的气体不能及时排出,妨碍菌体呼吸作用,影响菌体的正常代谢,; (2),泡沫过多,发酵液会外溢,造成浪费和污染,; (3),泡沫过多,易冲上罐顶,造成染菌。,小结：谷氨酸产生菌的主要特征,1.,-,酮戊二酸氧化能力微弱,:,-,酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低,.,2.,谷氨酸脱氢酶活性强,.,3.,还原性辅酶,(NADPH),进入呼吸链能力缺陷或微弱,.,4.,异柠檬酸裂解酶活力微弱,.,有利于谷氨酸前体物,酮酮戊二酸的生成，满足合成谷氦酸的需要。,5.,CO,2,固定能力强,.,使三羧酸循环的中间代谢物能得到补充。,6.,菌种是生物素营养缺陷型,具有向胞外分泌谷氨酸的能力,.,7.,分解转化和利用谷氨酸的能力低,.,四、控制细胞膜通透性的方法：,控制磷脂的合成；,控制细胞壁的合成；,选育温敏突变株,生物素营养缺陷型,作用机制,:,生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰,CoA,羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成,.,当磷脂合成量少到正常的,1/2,左右时,细胞变形,Glu,向膜外泄漏,.,控制关键,:,使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量,(5-10,g/L).,在发酵初期,(0-8,小时,),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换,.,油酸营养缺陷型,作用机制,:,油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的,1/2,左右,.,控制关键,:,保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换,.,添加表面活性剂,添加,表面活性剂,(,如吐温,60),能造成细胞渗漏,积累谷氨酸,.,机理,:,表面活性剂,在脂肪酸合成时对生物素有,拮抗,作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜,.,关键,:,控制好添加表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞,.,添加青霉素,机理,:,青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸,.,控制关键,:,一般在进入对数生长期的早期,(3-6,小时,),添加,.,添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换,.,五、谷氨酸发酵工艺,1,适应期,:,尿素分解出氨使,pH,上升,.,糖不利用,.2-4h.,措施,:,接种量和发酵条件控制使适应期缩短,.,2,对数生长期,:,糖耗快,尿素大量分解使,pH,上升,氨被利用,pH,又迅速下降,.,溶氧急剧下降后维持在一定水平,.,菌体浓度迅速增大,菌体形态,为排列整齐的八字形,.,不产酸,.12h.,措施,:,及时供给菌体生长必须的氮源及调节,pH,在,pH7.5-8.0,时流加尿素,;,维持温度,30- 32,3,菌体生长停止期,:,谷氨酸合成,.,措施,:,提供必须的氨及,pH,维持在,7.2-7.4.,大量通气,控制温度,34-37 .,4,发酵后期,:,菌体衰老,糖耗慢,残糖低,.,措施,:,营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐,.,发酵周期一般为,30h.,