分子医学技能ppt课件-实验一

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子医学技能,分子医学技能,实验一,口腔粘膜细胞基因组,DNA,的制备、,apoB,基因,PCR,加样上机,实验一 口腔粘膜细胞基因组DNA的制备、apoB基因,实验原理,1,、核酸的分类,DNA,主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量,DNA,，如线粒体,DNA,（,mtDNA,），叶绿体,DNA,（,cpDNA,），质粒,DNA,。,RNA,存在于细胞质中，如,mRNA, rRNA, tRNA,等。,除上述,DNA,，,RNA,外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含,DNA,，或只含有,RNA,。,在细胞中核酸都是以与蛋白质结合的状态存在。,实验原理1、核酸的分类 DNA 在细胞中核酸都是以与蛋白质结,染色体,染色质纤维,核小体,组蛋白,DNA,染色体染色质纤维核小体组蛋白DNA,核酸提取的主要步骤,主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。,核酸提取的主要步骤,分离纯化基因组,DNA,的步骤,：,不同生物（植物、动物、微生物）的基因组,DNA,的提取方法有所不同，分离方法也有差异。但原理相似，因此它们有共同的步骤,：,裂解细胞,：,SDS,裂解细胞，,EDTA,抑制核酸酶,除去蛋白质,：蛋白酶,K,水解蛋白质，酚和氯仿,/,异戊醇,抽提、分离蛋白质；,析出,DNA,：乙醇沉淀使,DNA,从溶液中析出。, 分离纯化基因组DNA的步骤：,分离纯化核酸总的原则：,应保证核酸一级结构的完整性；,排除其它分子的污染（,蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源,DNA,、,RNA,等）,。,核酸纯化应达到的要求：,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；,其它生物大分子的污染应降低到最低程度；,排除其它核酸分子的污染。,2,、核酸制备的一般原则,分离纯化核酸总的原则：2、核酸制备的一般原则,尽量简化操作步骤，缩短提取过程。, 减少化学因素对核酸的降解,（如过量酸碱）,。, 减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力（,强,烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融,）和,高温, 防止核酸的生物降解,（,核酸酶,的预防）,。,3,、,核酸制备时应注意的事项,:, 尽量简化操作步骤，缩短提取过程。3、核酸制备时应,人基因组,DNA,的制备,实验目的及意义,1.,从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组,DNA,2.,掌握基因组,DNA,抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理,人基因组DNA的制备,实验材料及试剂,材料：,人口腔上皮细胞,试剂及其功能：,抽提缓冲液：,Tris-Cl pH8.0,，,EDTA,，,NaCl,，,RNAase SDS,，蛋白酶,K,，,饱和酚,氯仿,/,异戊醇（,24:1,）,75%,及,95%,乙醇,TE,缓冲液：,Tris,，,EDTA,实验材料及试剂,酚：,使蛋白质变性，蛋白与,DNA,联结键断裂，蛋白分子表面含极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而,DNA,溶于水相,氯仿：,去除核酸溶液中的迹量酚,异戊醇：,降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含,DNA,的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定,乙醇：,DNA,溶液是,DNA,以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去,DNA,周围的水分子，使,DNA,失水而易于聚合,酚：使蛋白质变性，蛋白与DNA 联结键断裂，蛋白分子表面含极,分子医学技能ppt课件-实验一,取材,:,漱口后,(,去食屑,),，含生理盐水,1015ml,约,23min(,需咀嚼,),，用,15ml,离心管离心,（,5000,rpm,3,min,）收集细胞，弃上清,沉淀中加入,0.5ml,抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至,1.5ml EP,管,（微量移液器的正确使用）,混匀，,65,温育,30min,，间歇振荡,加入等体积的饱和酚（,注意：取下层的酚溶液,），充分颠倒混匀,12000rpm,5min,，上层水相,300ul,转移至新的,EP,管,（高速离心机的使用与安全：管对称平衡）,加入等体积氯仿,/,异戊醇，颠倒混匀,12000rpm,5min,，上层水相,200ul,转移到新的,EP,管,加入,2,倍体积,95%,的乙醇，颠倒混匀，,12000rpm,5min,弃上清，沉淀中加入,0.5ml,75%,乙醇漂洗，,12000rpm,2min,轻轻弃去上清，打开,EP,盖，管平放室温静置,5min,加入,50,l TE,溶液，取,4 l,做,PCR,，剩余统一收集于保存盒内,实验操作,取材: 漱口后(去食屑)，含生理盐水1015ml约23m,apoB,基因,PCR,参数,总体积：,25,l,Mix12.5 l,引物,2 l,ddH,2,O 6.5 l,模板,DNA 4 l,步骤,预变性：,94 5min,变性：,94 1min,退火,+,延伸：,60 4min,延伸：,60 5min,30 cycles,apoB基因PCR参数总体积：25 l 30 cycles,微量加样枪使用程序及注意事项,分子医学实验室,微量加样枪使用程序及注意事项 分子医学实验室,分子医学技能ppt课件-实验一,第一步,:,看整体,操作按钮,容量刻度,套头,第一步: 看整体操作按钮容量刻度套头,操作按钮,容量刻度,套头,操作按钮容量刻度套头,第二步,:,看大小,调节加样枪容量时,切勿超过最大容量,，否则加样枪将被损坏,。,第二步: 看大小调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加,20,l,1000,l,100,l,100,100,200,20 l1000 l100 l100100200,调节加样枪容量时,切勿超过最大容量,，否则加样枪将被损坏,0.5-10,l,20-200,l,100-1000,l,1 0 . 0,2 0 0,1 0 0 0,调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏 0.5,第三步,:,学调节,调节钮,切记,:,看着刻度调大小,刻度,第三步: 学调节调节钮切记:刻度,第四步,:,学使用,一挡吸取二挡放,切记,:,第四步: 学使用一挡吸取二挡放切记:,第五步,:,学维护,1,调节加样枪容量时,切勿超过最大容量,，,否则加样枪将被损坏。,2,切勿自行拆卸加样枪,3,对腐蚀性及毒性试剂等注意防范。,返 回,第五步: 学维护1 调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则,