斑蝥临床应用及炮制研究课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,斑蝥临床应用及炮制研究,斑蝥临床应用及炮制研究,1,2,概述,斑蝥入药始载于,神农本草经,，为芫青科昆虫南方大斑蝥,Mylabris phalerata,Pallas,或黄黑小斑蝥,Mylabris cichorii,Linnaeus,的干燥体,1,。,辛、热；有大毒。具有破血消癥，攻毒蚀疮，引赤发泡的作用。,由于斑蝥素具有毒性，常引起临床中毒，从古至今均需要炮制,2概述斑蝥入药始载于神农本草经，为芫青科昆虫南方大斑蝥M,2,3,主 要 内 容,斑蝥临床应用研究,1,斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究,3,斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究,4,斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究,7,斑蝥药材及饮片质量标准的研究,5,碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准研究,6,1,斑蝥米炒炮制工艺的研究,2,3主 要 内 容斑蝥临床应用研究1斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量,3,4,1.,临床应用及药理研究,含有的斑蝥素,(Cantharidin, C10H12O4),具有较强的抗肿瘤活性，并且不降低白细胞，同时具有较强的刺激；是重要的皮肤发泡剂。因而具有重要的药用价值,。,1.1,、治疗癌症,斑蝥及提取物以及斑蝥素的衍生物等对治疗原发性肝癌疗效显著，明显优于手术治疗或放疗。,斑蝥及斑蝥素的衍生物对乳腺癌、食道癌、肺癌、贲门癌、肠癌、等也有一定疗效。,1.2,、治疗神经性皮炎、疥癣、瘰疬,外用刺激皮肤发泡,41.临床应用及药理研究含有的斑蝥素(Cantharidin,4,5,2.,药理研究,2.1,抗肿瘤机制,斑蝥素及其衍生物，分子量小，易入细胞内，产生细胞毒作用，具有较强的抗肿瘤作用，作用机制主要有：,抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡；,抑制肿瘤细胞的侵袭和转移；,抑制癌细胞脱氧核糖核酸,(DNA),复制，增加放、化疗的敏感性。并且具有免疫增强和升高白细胞作用，这种独特的作用，早期可能由加速骨髓成熟或释放所致，后期则可能与促造血干细胞的增殖并向粒一单核系祖细胞不断分化有关。,2.2,抗纤维化和抗氧化损伤作用：,不同浓度的斑蝥素均能改变成纤维细胞的形态，抑制细胞增殖，成纤维细胞数目明显下降，形态变得不规则，排列混乱，代谢产物增加。从而证实斑蝥素能抑制,NIH/373,细胞的增殖，并且呈剂量依赖性。,2.3,抗炎、抗病毒、抗菌、促雌激素样作用。,52.药理研究2.1抗肿瘤机制,5,6,第二部分 斑蝥米炒炮制工艺的研究,05,版,中国药典,规定米斑蝥的炮制方法为取,净斑蝥与米拌炒，至米呈黄棕色，取出，除去头、翅、足。,斑蝥为毒性中药，,该炮制方法较为笼统，仅靠颜色对炮制程度进行判断，没有量化具体的工艺参数,，饮片企业很难按此生产出安全、可控、稳定的产品。,根据传统的炮制经验，结合现代炮制设备，,量化斑蝥米炒炮制工艺的参数，进行中试生产，制定,SOP,，符合中药现代化的要求,。,6第二部分 斑蝥米炒炮制工艺的研究05版中国药典规定米斑,6,7,米斑蝥小批量生产工艺,米斑蝥中试生产工艺,米斑蝥标准操作规程,SOP,入锅,温度,200,同时入锅炒制,2,4min,米呈黄棕色、米斑蝥完好,红外测温仪,滚筒,内壁,温度,300,铁锅,电加热炒药机,大米炒制,2min,后，,入斑蝥炒制,3min,7米斑蝥小批量生产工艺米斑蝥中试生产工艺米斑蝥标准操作规程S,7,8,米炒斑蝥,SOP,1,适用范围,本标准适用于饮片车间生斑蝥、米炒斑蝥的操作。,2,职责,操作工：严格按本,SOP,进行生斑蝥、米炒斑蝥操作。,3,内容,3.1,生斑蝥、米炒斑蝥前的准备,3.1.1,称量器具、红外测温仪、电热炒药机等处于完好、清洁状态，生产用具齐全。,3.1.2,工作间压差、温度、相对湿度符合生产工艺要求。,3.1.3,以上要求均满足后，方可生产。,3.2,领料,操作人员领取斑蝥、大米，核对品名、数量等。如有不符，严禁进入生产岗位，并按相关规定处理。,3.3,净制：,操作人员将斑蝥过,2,号筛，筛除杂质，去除头、足、翅，即为生斑蝥。,3.4,称量：,称取生斑蝥（除头、足、翅）,250g,根据生斑蝥每,10kg,用大米,2kg,，称取大米,50g,。,3.5,米炒：,将电热,炒药机温度设定在,400,，,开机，用红外测温仪监测滚筒内壁底温度，待,滚筒内壁温度升至,300,，立即投入大米，并开始计时，将大米炒,2min,后立即投入生斑蝥，继续炒制,3min,，,停止炒制，立即出锅，此时大米为棕黄色，放凉。拣去大米。炒制过程共,5min,，用红外测温仪监测滚筒内壁温度范围在,280-320,。,3.6,称量：称重米斑蝥，计算收率。,3.7,包装：将米斑蝥定量包装，贴上标签，注明品名、批号、生产日期等。,3.8,清场：生产操作完毕，及时清场，将垃圾妥善处理，确保现场没有残留物。,米炒斑蝥,SOP,8米炒斑蝥SOP米炒斑蝥SOP,8,9,验证,由浙江中医药大学中药饮片厂生产出,9,批样品,，说明本操作规程可行。,9验证 由浙江中医药大学中药饮片厂生产出9批样品，说,9,10,第三部分 斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究,近年来相继有多篇文章 报道了采用,HPLC,法测定斑蝥素含量,缺点：准确度不高，重现性差，使用不普及,建立斑蝥素的,HPLC,含量测定方法,2005,版药典收载斑蝥素的含量测定方法为,GC,法,10第三部分 斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究近年来相继有多篇,10,11,斑蝥不同部位及米炒炮制前后斑蝥素含量比较研究,药材,大、小净斑蝥,根据,大小斑蝥的特征,进行挑拣，分档，除去杂质，其中一份除去头、足、翅，即为大、小生斑蝥。粉碎成粗粉，备用。,头、足、内外翅,因小斑蝥饮片的头、足、内外翅不易剥离，故选,大斑蝥进行各部位的剥离，,粉碎成粗粉，备用。,米炒斑蝥,取净斑蝥与米置锅内，用文火加热，拌炒至米呈黄棕色，取出，去米。每,100g,斑蝥，用米,20g,。,规定药材温度,110,，加热,2min,。,粉碎成粗粉，备用。,11斑蝥不同部位及米炒炮制前后斑蝥素含量比较研究 药材,11,12,斑蝥各部位重量比例表,样品,头重,%,足重,%,内翅重,%,外翅重,%,头、足、翅总重,%,胸腹部重,%,1,5.80,8.27,1.95,13.19,29.21,69.62,2,5.81,9.16,1.58,10.25,26.80,71.82,3,6.19,7.36,2.27,12.63,28.45,70.52,4,5.63,7.35,1.74,10.26,24.98,74.31,5,5.42,8.38,1.78,10.22,25.80,73.79,6,7.39,11.24,2.26,11.33,32.22,66.79,7,7.96,8.17,2.31,11.89,30.33,67.88,平均重量比例,%,6.31,8.56,1.98,11.40,28.26,70.68,12斑蝥各部位重量比例表样品头重%足重%内翅重%外翅重%头、,12,13,含量测定结果,斑蝥中,头足翅总重仅占,28.26%,，而其所含,斑蝥素在生品中占,0.16%,，且头足翅很难完全粉碎，临床不去头足翅易引起病人恶心呕吐，故可以,认为其为非药用部位。,通过比较可知，,斑蝥素含量：生斑蝥饮片,斑蝥药材,米炒斑蝥。,这说明,米炒炮制使斑蝥中的斑蝥素含量减少，毒性降低，,同时由于头足翅中斑蝥素含量较低，导致同等重量下斑蝥药材中的含量低于生斑蝥饮片中斑蝥素含量。,南方大斑蝥和黄黑小斑蝥中斑蝥素含量相差不明显，故可将两者一起炮制。,13含量测定结果 斑蝥中头足翅总重仅占28.26%，而其,13,14,第四部分 斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究,文献报道认为芫菁科豆芫菁属、斑芫菁属昆虫中含有的斑蝥素分为,游离和结合两部分,，并且总斑蝥素远远高于游离斑蝥素的含量。,05,版药典,规定的氯仿直接浸提法，没有得到总斑蝥素的含量,结合斑蝥素在酸水解条件下还原为游离的斑蝥素,通过预试验，证明斑蝥中不仅含有氯仿浸提的游离斑蝥素，还含有酸水解提取的结合斑蝥素。,药材及饮片中,总斑蝥素的研究,14第四部分 斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究文献报道认为芫,14,15,总斑蝥素,提取方法的考察,0.5mol/LH,2,SO,4,溶液调,PH,至,2,左右,样品粗粉,0.4g,蒸馏水,10ml,提取液,上清液,离心,70,水浴,加热,30min,酸液,至分液漏斗,至蒸发皿,50,水浴挥干,甲醇定容至,5ml,容量瓶,超声,15min,氯仿萃取,4,次,第一法,15总斑蝥素提取方法的考察0.5mol/LH2SO4溶液调,15,16,超声处理,15,分钟,静置,26h,样品粗粉,0.4g,三氯甲烷,10ml,提取液,至分液漏斗,至蒸发皿,50,水浴挥干,甲醇定容至,5ml,容量瓶,盐酸溶液（,PH=1,）,10ml,氯仿萃取,4,次,静置,26h,超声处理,15,分钟,第二法,第三法,第四法,16超声处理15分钟样品粗粉0.4g三氯甲烷10ml提取液至,16,17,结果,将上述四种方法所得供试品溶液，按色谱条件进样，计算各样品中总斑蝥素的含量。,提取方法,第一法,第二法,第三法,第四法,总斑蝥素含量（,%,）,1.37,1.60,1.60,1.61,为使斑蝥素转移完全，对该法中三氯甲烷的萃取次数及洗涤次数进行考察，结果表明，萃取五次和洗涤五次转移完全。,按照该法对药渣进行提取，提取液中未检测到斑蝥素，表明提取完全。,17结果 将上述四种方法所得供试品溶液，按色谱条件进样，计,17,18,第四法正交设计实验考察,水平,因素,A,盐酸,PH,B,超声功率,(W),C,超声时间,（,min,）,D,三氯甲烷用量,（,ml,）,1,2,3,PH=1,PH=2,PH=3,300,400,500,10,15,20,10,20,30,因素水平表,通过预试验，分别对,盐酸,PH,值、超声功率、超声时间、三氯甲烷用量,四个因素，选用,L,9,（,3,4,）正交试验表对酸水解超声法提取工艺进行筛选优化。,18第四法正交设计实验考察水平因素A盐酸PHB超声功率(W,18,19,总斑蝥素提取方法,L,9,（,3,4,）正交实验及实验结果,实验号,因 素,总斑蝥素含量（,%,）,A,盐酸,PH,值,B,超声功率,(W),C,超声时间（,min,）,D,三氯甲烷用量（,ml,）,1,1,(PH=1),1(,300W),1(,10min),1(,10ml),1.32,2,1,2(,400W),2(,15min),2(,20ml),1.29,3,1,3(,500W),3(,20min),3(,30ml),1.51,4,2,(PH=2),1,2,3,1.43,5,2,2,3,1,1.00,6,2,3,1,2,1.31,7,3,(PH=3),1,3,2,0.39,8,3,2,1,3,0.44,9,3,3,2,1,0.41,K1,4.12,3.14,3.07,2.73,K2,3.74,2.73,3.13,2.99,K3,1.24,3.23,2.90,3.38,Sj,1.63,0.05,0.01,0.07,总和,9.20,9.20,9.20,9.20,9.10,19总斑蝥素提取方法L9（34）正交实验及实验结果 实验号因,19,20,方 差 分 析 表,方差来源,离差平方和,自由度,均值,F,值,显著性,A,1.6321,2,0.8160,172.00,*,B,0.0474,2,0.0237,4.99,D,0.0714,2,0.0357,7.52,误差,C,0.0095,2,0.0047,综合考虑确定总斑蝥素最佳工艺为：,A,1,B,2,C,2,D,1,。即：取三氯甲烷和,PH=1,的盐酸溶液各,10ml,，超声处理（功率,100W,，频率,40kHz,）,15,分钟。,20方 差 分 析 表 方差来源离差平方和自由度均值F值显著,20,21,验证,分别取同批次斑蝥药材样品粗粉,0.3g,各,3,份，精密称定，按优选的提取工艺提取总斑蝥素，,结果得各批次含量的相对平均偏差为,0.76%,，证明总斑蝥素采用此提取工艺提取可行。,斑蝥素是一种酸酐，能与体内的,Na,Mg,等金属元素结合，形成斑蝥素钠盐或镁盐等。这些,斑蝥酸的结合物在酸性环境中能够游离出斑蝥酸或者斑蝥素,，故,采用酸水解的方法提取总斑蝥素,。,实验过程中发现,斑蝥药材粉末总是在酸水层，不在氯仿层，故可以采用萃取的方式分取氯仿层提取液,。并采用正交实验设计优选出总斑蝥素的提取工艺。,21验证 分别取同批次斑蝥药材样品粗粉0.3g各3份,21,22,斑蝥不同部位及米炒前后总斑蝥素含量比较研究,药材,斑蝥药材、米炒斑蝥及斑蝥头、足、内外翅部分样品同,“,第二部分实验,3,中样品,”,。,供试品溶液的制备,按照实验,1,中优选提取工艺制备,色谱条件,流动相：甲醇水,(23:77),，,流速,1.0ml/min,，检测波长,230nm,，柱温：,30,精密称取斑蝥素对照品,2.18mg,，置,2ml,容量瓶内，少量甲醇超声使溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，备用。,对照品溶液的制备,22斑蝥不同部位及米炒前后总斑蝥素含量比较研究 药材 斑蝥,22,23,含量测定结果,斑蝥中,头足翅总重占,28.2%,，而其所含总,斑蝥素占,0.61%,，含量较低，进一步证明,其为非药用部位。,通过比较可知，总,斑蝥素含量：生斑蝥饮片,斑蝥药材,米炒斑蝥。,与其斑蝥素含量趋势一致。,这说明米炒炮制不但,使斑蝥素含量减少，而且总斑蝥素含量也减少，推测结合斑蝥素的存在。,23含量测定结果 斑蝥中头足翅总重占28.2%，而其所含,23,24,第五部分 斑蝥药材及饮片质量标准研究,本次质量标准的制定，共收集,斑蝥药材,16,批次，生斑蝥,10,批次，米炒斑蝥,15,批次,。,经河南中医学院生药学科陈随清教授鉴定分别为芫青科昆虫南方大斑蝥,Mylabris phalerata,Pallas,或黄黑小斑蝥,Mylabris cichorii,Linnaeus,的,干燥体、去除头足翅及杂质的净制加工品或米炒炮制加工品,。,实验,1.,样品的收集与鉴定,24第五部分 斑蝥药材及饮片质量标准研究 本次质量标准,24,25,编号,样品名称,规格等级,批号,产地,样品重,g,提供单位,1,斑蝥,大小混装,Y080822,贵州,200,浙江中医药大学饮片厂,2,斑蝥,大小混装,Y080820,云南,200,浙江中医药大学饮片厂,3,斑蝥,大小混装,Y080821,云南,200,浙江中医药大学饮片厂,4,斑蝥,大小混装,Y081210,不详,20,陕西中医学院,5,斑蝥,大小混装,Y081212,不详,30,天津中医药大学,6,斑蝥,大小混装,Y081214,不详,25,江西中医学院,7,斑蝥,大小混装,Y090115,不详,130,成都中医药大学,8,南方大斑蝥,大,Y080418A,不详,1000,河南中医学院,9,黄黑小斑蝥,小,Y080418B,不详,1000,河南中医学院,10,斑蝥,大小混装,Y090209,广西,100.8,市售,11,斑蝥,大小混装,Y090210,郑州,97,市售,12,斑蝥,大小混装,Y090218,洛阳,96.3,市售,13,斑蝥,大小混装,Y090221-1,禹州,1,100,市售,14,斑蝥,大小混装,Y090221-2,禹州,2,100,市售,15,斑蝥,大小混装,Y090221-3,安国,100,市售,16,斑蝥,大小混装,Y090221-4,亳州,100,市售,斑蝥药材样品来源表,25编号样品名称规格等级批号产地样品重提供单位1斑蝥大小混装,25,26,生斑蝥样品来源表,编号,样品名称,规格等级,批号,产地,样品重（,g,）,提供单位,1,生斑蝥,统货,S080822,贵州,50,浙江中医药大学饮片厂,2,生斑蝥,统货,S080820,云南,1,100,浙江中医药大学饮片厂,3,生斑蝥,统货,S080821,云南,2,100,浙江中医药大学饮片厂,4,大生斑蝥,统货,S080418A,河南,500,河南中医学院,5,小生斑蝥,统货,S080418B,河南,500,河南中医学院,6,生斑蝥,统货,S090115,成都,20,成都中医药大学,7,生斑蝥,统货,S090221-1,禹州,1,100,市售,8,生斑蝥,统货,S090221-2,禹州,2,100,市售,9,生斑蝥,统货,S090221-3,安国,100,市售,10,生斑蝥,统货,S090221-4,亳州,100,市售,26生斑蝥样品来源表编号样品名称规格等级批号产地样品重（g）,26,27,米炒斑蝥样品来源表,编号,样品名称,规格等级,批号,采购地,重量,/g,炮制生产单位,净制米炒顺序,1,米炒斑蝥,大小混装,080822,贵州,200,浙江中医药大学饮片厂,米拌炒去头足翅,2,米炒斑蝥,大小混装,080820,云南,100,浙江中医药大学饮片厂,米拌炒去头足翅,3,米炒斑蝥,大小混装,080821,云南,200,浙江中医药大学饮片厂,米拌炒去头足翅,4,米炒斑蝥,大小混装,081210,陕西,15,陕西中医学院,去头足翅米拌炒,5,米炒斑蝥,大小混装,081212,天津,12,天津中医药大学,去头足翅米拌炒,6,米炒斑蝥,大小混装,081214,江西,12,江西中医学院,去头足翅米拌炒,7,米炒大斑蝥,大,080418A,河南,1000,河南中医学院,去头足翅米拌炒,8,米炒小斑蝥,小,080418B,河南,1000,河南中医学院,去头足翅米拌炒,9,米炒大斑蝥,大,090114-1,贵州,143.7,浙江中医药大学饮片厂,去头足翅米拌炒,10,米炒小斑蝥,小,090114-2,贵州,52.6,浙江中医药大学饮片厂,去头足翅米拌炒,11,米炒大斑蝥,大,0901131-1,云南,67.2,浙江中医药大学饮片厂,去头足翅米拌炒,12,米炒小斑蝥,小,0901131-2,云南,41.2,浙江中医药大学饮片厂,去头足翅米拌炒,13,米炒大斑蝥,大,0901132-1,云南,167.1,浙江中医药大学饮片厂,去头足翅米拌炒,14,米炒小斑蝥,小,0901132-2,云南,64.7,浙江中医药大学饮片厂,去头足翅米拌炒,15,米炒斑蝥,大小混装,090221-4,亳州,10,亳州市售,去头足翅米拌炒,27米炒斑蝥样品来源表编号样品名称规格等级批号采购地重量炮制,27,28,由于,斑蝥是毒剧药材，临床用量较少，,几乎所有中药饮片企业在申报,GMP,认证过程中均没有上报此生产品种，,由于,每次炮制量太小,，饮片生产企业无法用炒药机进行机械化生产，无法通过设备控制生产条件。,除,浙江中医药大学饮片厂生产的样品和河南中医学院炮制的样品,，我们请各地中医药院校炮制教研室的专家教授们采购,当地市售米炒品或采购生斑蝥自己加工炮制,作为样品来源，但鉴于斑蝥是毒剧药不能随意购买，因此,斑蝥的来源和数量,受到了限制。,28 由于斑蝥是毒剧药材，临床用量较少，几乎所有中药饮片,28,29,斑蝥药材,南方大斑蝥 体型较大，呈长圆形，长,1.5,2.5cm,，宽,0.5,1cm,。头及口器向下垂，有较大的复眼及触角各,1,对，触角多已脱落。背部具革质鞘翅,1,对，黑色，有,3,条黄色或棕黄色的横纹；鞘翅下面有棕褐色薄膜状透明的内翅,2,片。胸腹部乌黑色，胸部有足,3,对。有特殊的臭气。,黄黑小斑蝥 体型较小，长,1,1.5cm,。,南方大斑蝥 黄黑小斑蝥 伪品斑蝥,实验,2.,斑蝥药材及饮片性状、显微鉴别研究,性状鉴别,29斑蝥药材南方大斑蝥 黄黑小斑蝥,29,30,大生斑蝥 小生斑蝥,生斑蝥,南方大斑蝥 体型较大，头足翅偶有残留。头部去除后的断面不整齐，边缘黑色，中心土黄色。有特殊的臭气。,黄黑小斑蝥 体型较小。,30大生斑蝥 小生斑蝥生,30,31,米炒斑蝥,南方大斑蝥 体型较大，头足翅偶有残留。色乌黑发亮，头部去除后的断面不整齐，边缘黑色，中心灰黄色。质脆易碎，有米炒后的焦香气。,黄黑小斑蝥 体型较小。,31 米炒斑蝥,31,32,显微鉴别,刚毛 横纹肌纤维 复眼碎片,体壁碎片,气管壁碎片,主要特征,由于米炒斑蝥与生斑蝥、斑蝥药材均为动物昆虫，其基本组织相同，没有根本区别，显微鉴别很难区分，故没有收载显微鉴别项。,32 显微鉴别 刚毛 横纹肌纤,32,33,因,2005,年版药典方法提取时间较长，取样量较多易出现脱尾等，故对,2005,版药典,TLC,鉴别供试品溶液制备方法进行如下考察：,对提取方法的选择,从左至右,:,1,、斑蝥素,5ul,；,2,、,3,、,2005,药典法提取样品；,4,、斑蝥素,3ul,5,、,6,、超声法提取样品,超声法时间短、更便捷，故采用超声提取法。,实验,3.,斑蝥药材及饮片,TLC,鉴别,33 因2005年版药典方法提取时间较长，取样量较多易,33,34,对取样量的选择,从左至右：,1,、,2,、,3,、,4 3g,样品；,5,、斑蝥素,5ul,；,6,、,7 2g,样品,取样量为,3g,者，色谱中有拖尾现象，故将取样量减少为,2g,。,34对取样量的选择从左至右：1 、2、3 、4 3g样品；,34,35,对石油醚沸程的选择,从左至右：,1,、,6,、斑蝥素,5ul,；,2,、,3,、石油醚（,60,90,）,4,、,5,、石油醚（,30,60,）,两种石油醚对斑蝥素斑点的分离度、拖尾情况均无影响，但石油醚（,30,60,）挥发性较好，故仍选用石油醚（,30,60,）。,35对石油醚沸程的选择从左至右：1、6、斑蝥素5ul；2、,35,36,取本品粉末,2g,，,加三氯甲烷,20ml,，超声处理（功率,400W,，频率,40KHz,）,15,分钟，,滤过，滤液蒸干，残渣用石油醚（,30,60,）洗,2,次，每次,5ml,，小心倾去上清液，残渣加三氯甲烷,1ml,使溶解，作为供试品溶液。,供试品溶液的制备,取斑蝥素对照品,加三氯甲烷制成每,1ml,含,5mg,的溶液，作为对照品溶液。,对照品溶液的制备,36 取本品粉末2g，加三氯甲烷20ml，超声处理（功率4,36,37,考察了不同展距对薄层斑点的,Rf,值的影响，,为使其适中故选择其展距为,8cm,。,8cm,6cm,5cm,对展距的选择,展开,展开剂：三氯甲烷丙酮,(49:1),显色剂：,0.1, 溴甲酚绿乙醇溶液,37 考察了不同展距对薄层斑点的Rf值的影响，为使其适中故,37,38,TLC,耐用性考察,薄层板的选择,分别对青岛海洋化工厂生产的,预制板（,10*20cm,）、手工铺制板（,10*20cm,）、手工铺制板（,10*10cm,）,进行考察，各板薄层斑点的分离度及拖尾情况良好。因选择展距为,6cm,，故,选用宽度为,10cm,的预制板,。,青岛海洋预制板,（,10*20cm,）,手工铺板（,10*20cm,）,手工铺板（,10*10cm,）,38TLC耐用性考察薄层板的选择 分别对青岛海洋化工厂生产,38,39,湿度的考察,根据硫酸,-,水溶液相对湿度表，配制,58.9%,、,26.2%,浓度的硫酸水溶液，在密闭的干燥器中分别造成相对湿度为,20%,、,80%,的环境，,在不同湿度下薄层斑点的分离度及拖尾情况良好。,不同浓度的硫酸水溶液,相对湿度,%,20,35,80,硫酸浓度,%,58.9,51.0,26.2,水溶液相对密度,d,4,25,1.48,1.40,1.19,20%,36%,80%,39湿度的考察 根据硫酸-水溶液相对湿度表，配制58,39,40,温度的考察,分别在,4,10,（冰箱）、室温,条件下展开，,在不同温度下主斑点的分离度及拖尾情况良好,。,4,10,（冰箱）,19,（室温）,40温度的考察 分别在410（冰箱）、室温条件下,40,41,斑蝥有芫青科昆虫南方大斑蝥,Mylabris phalerata,Pallas,或黄黑小斑蝥,Mylabris cichorii,Linnaeus,两个品种，故对南方大斑蝥和黄黑小斑蝥两个品种样品分别进行鉴别。,从左至右：,1,、云南,1,斑蝥药材；,2,、云南,2,米炒斑蝥；,3,、斑蝥素；,4,、 生小斑蝥；,5,、米炒小斑蝥；,6,、生大斑蝥；,7,、米炒大斑蝥,结果显示这两个品种的鉴别情况一致。,多来源品种的鉴别,41 斑蝥有芫青科昆虫南方大斑蝥Mylabris ph,41,42,定性鉴别,精密吸取上述斑蝥药材、生斑蝥及米炒斑蝥各批样品的供试品溶液及斑蝥素对照品溶液各,5l,分别点于同一硅胶,G,薄层板上。,以氯仿,:,丙酮,(49:1),为展开剂，展开，展距,6cm,，晾干，喷以,0.1%,溴甲酚绿乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。,供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的斑点。,斑蝥药材定性鉴别（从左至右,1,7,为各批斑蝥药材,8,为斑蝥素）,42定性鉴别 精密吸取上述斑蝥药材、生斑蝥及米炒斑,42,43,生斑蝥定性鉴别（从左至右,1,6,为各批生斑蝥,7,为斑蝥素）,43生斑蝥定性鉴别（从左至右16为各批生斑蝥 7为斑蝥素,43,44,米炒斑蝥饮片定性鉴别,（从左至右,1,10,为各批米炒斑蝥,11,为斑蝥素,12,13,为大、小斑蝥,14,15,为大、小米炒斑蝥）,根据要求对,TLC,鉴别进行耐用性考察，其结果稳定，重现性高，故质量标准中均收载,TLC,鉴别项。,但该,TLC,色谱条件下，仅显斑蝥素色谱点，成分较单一，,无法区别斑蝥药材、生斑蝥与米炒斑蝥,。,44米炒斑蝥饮片定性鉴别 根据要求对TLC鉴别进行耐用性,44,45,按照中国药典附录, K,灰分测定法对各批次样品进行,总灰分及酸不溶灰分,测定。,实验,4.,斑蝥药材及饮片水分、灰分和浸出物含量检查,按照中国药典附录, H,水分测定法第三法减压干燥法对各批次样品进行,水分,的测定。,按照中国药典附录,A,浸出物测定法中冷浸法测定各批次样品的,水溶性浸出物、醇溶性浸出物,。,45按照中国药典附录 K灰分测定法对各批次样品进行总灰分,45,46,46,46,47,因,斑蝥及米炒斑蝥为毒剧药材，不入汤剂多入丸散，且其有效成分斑蝥素易升华,，在浸出物测定中，干燥过程使斑蝥素升华，因此，无论醇浸出物、还是水浸出物都不包含游离斑蝥素成分，故,未对其浸出物的含量进行限度要求。,斑蝥作为,生长在植物叶片上的成虫，不易掺附杂质,，并且,经净制（去头足翅）和炒制后灰分含量没有明显改变,，酸不溶性灰分含量有些降低但并不稳定，因而在质量标准中,未将灰分、酸不溶灰分的检查作为检查项目。,斑蝥中所,含斑蝥素具有升华性，,84,即开始升华，,故无法用烘干法测定其水分；甲苯法要求样品量较多（取样量要约含有,1,4ml,水分，而米斑蝥为炒制品，水分含量较低，样品需要几十克）；由于是毒剧药，一般使用单位采购量、库存量均少，本次浙江中医药大学饮片厂所提供的三批样品，其中一批为,100g,，用甲苯法测定其水分含量样品量就显不足；气相法测定需要专门的仪器设备；最后,选用减压干燥法测定各批次样品的水分含量，结果证明斑蝥中水分含量较低，,但减压干燥法本身准确度不高，因此质量标准中,均不设水分限度检查,。,47 因斑蝥及米炒斑蝥为毒剧药材，不入汤剂多入丸散，且,47,48,色谱条件,对照品溶液的制备,精密称取斑蝥素对照品,2.18mg,，置,2ml,容量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，备用。,实验,5.,斑蝥药材及饮片斑蝥素、总斑蝥素含量测定,流动相：甲醇水,(23:77),，,流速,1.0ml/min,，检测波长,230nm,，柱温：,30,供试品溶液的制备,斑蝥素,取本品粉末约,1g,，精密称定，置具塞锥形瓶中，,用三氯甲烷作溶剂，超声处理（功率,400W,，频率,40kHz,）,2,次（,30ml,，,30ml,），每次,15,分钟,，提取液滤过，用少量三氯甲烷分次洗涤容器，滤液和洗液滤入同一蒸发皿中，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至,10ml,量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀,即得。,48色谱条件对照品溶液的制备 精密称取斑蝥素对照品2,48,49,总斑蝥素,取本品粗粉约,0.3g,，精密称定，置,50ml,具塞锥形瓶中，,加三氯甲烷,10ml,再加盐酸溶液（,PH=1,）,10ml,，超声处理（功率,400W,，频率,40kHz,）,15,分钟,，置,分液漏斗中，分取三氯甲烷层，,酸液再用三氯甲烷振摇提取,5,次（,10ml,10ml,5ml,3ml,3ml,），残渣和容器用三氯甲烷洗涤,5,次，每次,3ml,，合并三氯甲烷液，抽滤，容器用三氯甲烷洗涤,5,次，每次,3ml,，滤液和洗液置同一蒸发皿中，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至,10ml,容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各,10l,，注入液相色谱仪，测定，即得。,含量测定,供试品溶液的制备,49总斑蝥素 取本品粗粉约0.3g，精密称定，置50ml具,49,50,50,50,51,根据以上实验测定结果，将斑蝥药材斑蝥素含量计算平均值，下浮,20%,为,0.51%,，综合考虑规定,斑蝥药材中斑蝥素含量限度标准为不得少于,0.50%,；,生斑蝥因去除了重量近,30%,的头足翅，而头足翅斑蝥素含量又很低，因此斑蝥素含量升高，故,规定其斑蝥素含量限度标准为不得少于,0.65%,；,将米炒斑蝥饮片斑蝥素含量计算平均值为,0.54%,，上浮,20%,，为,0.65%,，规定,米炒斑蝥中斑蝥素应不得高于,0.65,、,总斑蝥素含量计算平均值为,1.42%,，下浮,20%,为,1.13%,，综合考虑规定,总斑蝥素以斑蝥素计不得少于,1.0%,。,51 根据以上实验测定结果，将斑蝥药材斑蝥素含量计算平均,51,52,52,52,53,第六部分 碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准的研究,采用,低浓度的药用氢氧化钠溶液炮制斑蝥,，可以使斑蝥素在虫体内转化成斑蝥酸钠,，,以达到降低毒性，保留斑蝥抗癌活性的目的，其作用优于米炒法。这也是利用了炮制辅料使毒性成分结构改变，同时与毒性成分生成盐而使毒性降低的原理。,实验,1.,碱制斑蝥饮片的制备及斑蝥素提取工艺研究,53第六部分 碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准的研究 采,53,54,碱制斑蝥的制备,最优碱制方案为,A,2,B,2,C,3,，即,以,6,倍于原药材量的,0.75%NaOH,水溶液，,50,60,浸渍,6,小时后低温干燥,。,实验因素水平表,水平 因素,A B C,浸渍时间 浸渍温度 碱液浓度,1 A1 12h B1 30,40 C1 0.25%,2 A2 6h B2 50,60 C2 0.50%,3 A3 3h B3 70,80 C3 0.75%,54 碱制斑蝥的制备 实验因素水平表水平,54,55,样品粗粉,0.4g,蒸馏水,10ml,提取液,上清液,离心,70,水浴,加热,30min,酸液,至分液漏斗,至蒸发皿,50,水浴挥干,甲醇定容至,5ml,容量瓶,氯仿萃取,4,次,0.5mol/LH,2,SO,4,溶液调,PH,至,2,左右,超声,15min,振摇,10min,静置,5min,超声法：,振摇法：,斑蝥素,提取方法的考察,比较提取方法,结果表明超声提取效率最高。,55样品粗粉0.4g蒸馏水10ml提取液上清液离心70水浴,55,56,超声时间的选择,提取时间,峰面积,5min,845485,15min,915431,25min,836809,超声法提取工艺的优化,超声次数的选择,提取次数,峰面积,1,次,915431,2,次,1023907,浸渍时间的选择,浸渍时间,峰面积,0h,1133120,2h,968523,4h,1025888,6h,1025816,56超声时间的选择提取时间峰面积5min84548515mi,56,57,洗液的选择,洗液,平均峰面积,石油醚洗提取,1259946,石油醚：无水乙醇洗提取,921930,石油醚洗液,33281,石油醚：无水乙醇洗液,159959,表明石油醚洗提取效率最高，但石油醚洗液中仍有斑蝥素的存在，故选不用洗液提取。,超声法提取工艺的确定,通过单因素循环法对提取方法、提取次数、提取时间、浸渍时间和洗液进行了考察,确定最佳提取工艺为超声,15min,提取,2,次，不浸渍，不用洗液。,57洗液的选择 洗液平均峰面积石油醚洗提取1259946石油,57,58,Agilent HC-C18,色谱柱（,4.6250mm,）,流动相：甲醇水,(30:70),，,流速,1.0ml/min,，检测波长,230nm,，柱温：,30,。,实验,2.HPLC,法测定碱制斑蝥饮片中斑蝥素含量,仪器与材料,仪器,日本岛津,LC-2010AT,高效液相色谱仪,样品,实验室自制碱制斑蝥三批,色谱条件,58 Agilent HC-C18色谱柱（4.6250m,58,59,标准曲线的绘制,对照品溶液的制备,精密称取斑蝥素对照品,1.32mg,，置,2ml,容量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，备用。,进样量,(,g,),1.32,2.64,3.96,5.28,6.60,7.92,10.56,13.2,峰面积分值,68754,133654,192279,258388,324053,388372,506555,633139,在,1.32,13.2g,范围内线性关系良好，回归方程为,Y=47532X+7443.7,，,R,2,=0.9998,。,59标准曲线的绘制1.322.643.965.286.60,59,60,方法学考察,稳定性,重复性,加样回收率,精密度,RSD=0.3%,RSD=1.04%,RSD=3.06%,RSD=2.7%,60方法学考察稳定性重复性加样回收率精密度RSD=0.3%R,60,61,样品含量测定结果,实验编号,样品重量,斑蝥素含量,（）,平均含量（）,斑蝥酸钠含量（）,080722,080804,080808,0.2102,0.2048,0.2025,0.2027,0.2039,0.2038,0.2036,0.2036,0.2037,1.99,1.99,1.90,1.90,1.96,1.94,2.04,2.05,2.06,1.96,1.93,2.05,2.58,2.54,2.70,含量测定,精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各,10l,，按色谱条件进样，计算样品中斑蝥素含量,供试品溶液的制备,按照实验,1,中优选的提取工艺制备,61样品含量测定结果实验编号样品重量 斑蝥素含量平均含量,61,62,斑蝥素标准品色谱图,碱制斑蝥中斑蝥素色谱图,以上结果证明，由于采用碱提法提取，斑蝥中总斑蝥素含量较高，斑蝥酸钠含量也大大高于游离斑蝥素含量。无疑碱制斑蝥既能最大限度地保留斑蝥素，提高抗肿瘤活性，同时又能降低毒性。,是斑蝥炮制的较好方法,。,62斑蝥素标准品色谱图 碱制斑蝥中斑蝥素色谱图 以上结,62,63,测定各种无机元素的含量，推测结合斑蝥素的存在形式,3,本研究证明，斑蝥含有结合状态的斑蝥素,，但斑蝥素究竟是与何种元素结合而存在？,2,1,斑蝥素是一种酸酐，能与体内的,Na,Mg,等元素结合,，,形成斑蝥素钠盐或镁盐等。,这些,斑蝥酸的结合物在酸性环境中能够游离出斑蝥酸或者斑蝥素,。,第七部分 斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究,原子吸收法,63测定各种无机元素的含量，推测结合斑蝥素的存在形式3本研究,63,64,分别取各批次样品粉末,0.3g,于消解罐中，精密称定，依次加入,浓硝酸,6ml,，过氧化氢,2ml,，放入,微波消解仪,中，按微波消解程序表进行消解，待整个消解系统冷却后，取出消解罐，打开罐盖，用少量去离子水吹洗消解罐盖子和杯壁，在电炉上蒸发浓缩溶液至约,1 mL,，冷却，将溶液移入容量瓶中，用去离子水定容至,50mL,，作为,测定铜,(Cu),、锰,(Mn),、铅,(Pb),、镉,(Cd),、砷,(As),、汞,(Hg),元素的供试品溶液,。,另取上述母液,5ml,，移入,50ml,容量瓶中，用去离子水定容至刻度，作为,测定锌,(Zn),、铁,(Fe),、镁,(Mg),、钙,(Ca),、钾,(K),元素的供试品溶液,。,随同试样做空白试验。,Step,功率,(W) Ramp(min) Temp () Hold(min),1 800 5 120 1,2 800 3 150 3,3 800 4 180 25,微波消解样品,64 分别取各批次样品粉末0.3g于消解罐中，精密称定,64,65,分别采用,火焰、石墨炉、氢化物发生,-,冷原子吸收法,测定铜,(Cu),、锰,(Mn),、锌,(Zn),、铁,(Fe),、镁,(Mg),、钙,(Ca),、钾,(K),，铅,(Pb),、镉,(Cd),、砷,(As),，汞,(Hg),。,方法与结果,65 分别采用火焰、石墨炉、氢化物发生-冷原子吸收法测,65,66,标准曲线的绘制,精密吸取各对照品溶液，按照仪器的操作条件，进行测定，进样量,20l,，计算线性回归方程和相关系数。,66 标准曲线的绘制 精密吸取各对照品溶液，按照仪器,66,67,含量测定,精密吸取各供试品溶液，按照仪器的操作条件，进行测定，进样量,20l,，计算含量。,67 含量测定 精密吸取各供试品溶液，按照仪器的操作,67,68,结果表明，各样品中均含有以上十一种微量元素，且其,含量高低为：,K,Mg,Fe,Ca,Zn,Mn,Cu,Pb,As,Hg,Cd,。,在斑蝥各样品中，,As,、,Hg,、,Pb,的含量,以头足翅最高，斑蝥药材、生斑蝥次之，米炒斑蝥最低；,Cd,、,K,、,Zn,的含量,以生斑蝥最高，斑蝥药材、米炒斑蝥次之，头足翅最低；,Cu,、,Mg,的含量,以米炒斑蝥最高，头足翅最低；,Mn,的含量,以斑蝥药材最高，生斑蝥次之，米炒斑蝥和头足翅约等，最低；,Fe,的含量,以斑蝥药材最高，米炒斑蝥最低；,Ca,的含量,以头足翅最高，米炒斑蝥、斑蝥药材次之，生斑蝥最低。,68 结果表明，各样品中均含有以上十一种微量元素，且其含,68,69,结合斑蝥素结构的推断,根据各批次样品中结合斑蝥素的含量，将其百分含量换算成摩尔含量后，与它们体内,Mg,、,Mn,、,Ca,、,Zn,、,Cu,、,K,微量元素含量进行相关性研究。,结果提示斑蝥体内结合斑蝥素可能,以斑蝥酸镁、斑蝥酸钾及少量斑蝥酸锌存在,，但还待进一步研究。,69 结合斑蝥素结构的推断 根据各批次样品中结合斑蝥,69,70,斑蝥素和总斑蝥素含量：生斑蝥饮片,斑蝥药材,米炒斑蝥。,斑蝥素的含量远远小于总斑蝥素的含量。斑蝥头足翅中斑蝥素和总斑蝥素含量较低，为非药用部位。,制定米炒斑蝥的,SOP,，为中药饮片厂执行,GMP,管理，提供了技术标准。,结 论,以,HPLC,法代替,GC,法，测定斑蝥素和总斑蝥素，控制斑蝥饮片及药材的质量。,70斑蝥素和总斑蝥素含量：生斑蝥饮片斑蝥药材米炒斑蝥。斑,70,71,结 论,建立斑蝥药材、生斑蝥及米炒斑蝥饮片质量标准草案，被,2010,版药典收载。,采用原子吸收法首次研究斑蝥中存在的结合斑蝥素，推测斑蝥体内,结合斑蝥素可能以斑蝥酸镁、斑蝥酸钾及少量斑蝥酸锌存在,，但还待进一步研究。,首次建立碱制斑蝥中斑蝥酸钠提取方法及,HPLC,法测定碱制斑蝥中斑蝥酸钠含量测定方法，稳定且重现性佳，可以较好的控制斑蝥碱制品的质量。,71结 论建立斑蝥药材、生斑蝥及米炒斑蝥饮片质量标准草案，被,71,72,湖南中医药大学：蒋孟良教授陕西中医学院：李景丽、吴建华教授天津中医药大学：窦志英教授江西中医学院：龚千峰教授成都中医药大学：胡昌江教授,感,谢,提,供,样,品,支持,72湖南中医药大学：蒋孟良教授陕西中医学院：李景丽、吴建华,72,