第18章 高效液相色谱法课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,上一内容,下一内容,回主目录,返回,第十八章,高效液相色谱法,high performance liquid chromatography,；,HPLC,.,第十八章高效液相色谱法.,1,基本要求,掌握：,反相键合相色谱法的分离机制、保留行为的主要影响因素和分离条件选择；化学键合相的性质、特点和种类及使用注意事项；流动相对色谱分离的影响；,HPLC,中的速率理论及其对选择实验条件的指导作用；定量分析方法。,熟悉,:,反相离子对色谱法和正相键合相色谱法及其分离条件的选择；高效液相色谱仪的部件；紫外检测器和荧光检测器的检测原理和适用范围。,了解：,离子、手性和亲合三种色谱法；溶剂强度和选择性；混合溶剂强度参数的计算和流动相最优化方法。,基本要求掌握：反相键合相色谱法的分离机制、保留行为的主要影响,基本内容,18.1,高效液相色谱法的主要类型和原理,18.2,高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,18.3,高效液相色谱仪,18.4,高效液相色谱分析方法,基本内容18.1 高效液相色谱法的主要类型和原理,流动相为液体，采用高效固定相，以高压输送流动相的色谱法,。,引入气相色谱的,塔板理论,和,速率理论,及先进的实验技术和方法，通过改进固定相达到了,高效,，采用高压输送流动相，达到了,高速,。,特点：分离效能高、分析速度快及仪器化,next,高效液相色谱法,流动相为液体，采用高效固定相，以高压输送流动相的色谱法。,高效液相色谱法与经典液相色谱法对比,经典液相色谱法,高效液相色谱法,（分析型）,固定相,一般规格,特殊规格,固定相粒度（,m,）,75500,320,固定相粒度分布,(RSD),2030%,5%,柱长（,cm,）,10100,1030,柱内径（,cm,）,25,0.10.5,柱入口压强（,kg/cm,2,）,0.011,20300,柱效,(,每米理论塔片数,),10100,10,4,10,5,样品用量（,g,）,110,10,-7,10,-2,分析所需时间（,h,）,120,0.050.5,装置,非仪器化,仪器化,高效液相色谱法与经典液相色谱法对比经典液相色谱法高效液相色谱,高效液相色谱法与气相色谱法对比,气相色谱（,GC,）,高效液相色谱（,HPLC,）,应用范围,占有机物的,20%,占有机物的,80%,分离效果,高,更高,选 择 性,流动相是气体，只能选择固定相,流动相是液体，流动相、固定相都可选择。选择性广。,温 度,高温,常温（分离效果好）,灵敏度,(g/ml),10,-12,10,-9,高效液相色谱法与气相色谱法对比气相色谱（GC） 高效液相色谱,第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,一、基本类型,吸附色谱法,（,adsorption chromatography,LSC,）,分配色谱法,（,partition chromatography,LLC,）,离子交换色谱,(,ion exchange chromatography,IEC),空间排阻色谱,(,steric exclusion chromatography,SEC),第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理一、基本类型吸附色,主要类型,化学键合相色谱法,（,bonded phase chromatography,BPC,）,离子对色谱法,(paired ion chromatography PIC),离子抑制色谱法,(ion suppression chromatography ISC),亲合色谱法,(affinity chromatography AC),手性色谱法,(chiral chromatography CC),主要类型化学键合相色谱法（bonded phase chr,疏溶剂理论,疏溶剂缔合作用示意图,l.,键合烃基,2.,溶剂膜,3.,溶质的极性部分,4.,溶质的非极性部分,缔 和,解缔和,疏溶剂理论疏溶剂缔合作用示意图 缔 和解缔和,（,1,）反相离子抑制色谱,离子抑制剂：,弱酸、弱碱性物质,pH,一定的缓冲溶液,酸性物质,加入酸，如,HAc,，,t,R,，,K,碱性物质,加入碱，如,NH,3,H,2,O,，,t,R,，,K,调节,pH,范围：,2.08.0,适用：,pH=37,弱酸；,pH=78,弱碱；两性化合物,3.,反相离子抑制色谱和反相离子对色谱,（1）反相离子抑制色谱离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质3.反相离,(2),反相离子对色谱法,适用：,pH:,离子对试剂,种类及浓度：,(2) 反相离子对色谱法适用：pH:离子对试剂,(2),反相离子对色谱法,离子对试剂种类及浓度：,适用：,pH:,(2) 反相离子对色谱法离子对试剂种类及浓度：适用：pH:,第18章 高效液相色谱法课件,第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,一、化学键合相色谱的固定相,（）液固吸附色谱法（）,固定相常用硅胶、高分子多孔微球,第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择一、化学键合相,第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,一、化学键合相色谱的固定相,优点：固定液不易流失，稳定（在,pH28,范围,),，热稳定性好，且能用于梯度洗脱。,硅胶,-,烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响,1-,尿嘧啶；,2-,苯酚；,3-,乙酰苯；,4-,硝基苯；,5-,苯甲酸甲酯；,6-,甲苯,键合量评价：,含碳量覆盖度封尾,第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择一、化学键合相,二、化学键合相色谱法的流动相,要求：,与固定液不反应,对样品有良好溶解度,k=110,最佳,k=25,与检测器匹配,粘度小、纯度高。,流动相使用前需用微孔滤膜滤过、脱气。,二、化学键合相色谱法的流动相 要求：,(,一）流动相对分离的影响,由填,固充,定质,相量,及决,色定,谱,受,溶,剂,种,类,(,选择性,),影,响,受,溶,剂,配,比,(,强度,),影,响,(一）流动相对分离的影响由填受受,(,二,),溶剂的强度和选择性,1,溶剂的极性和强度,斯奈德,(Snyder),溶剂极性参数,(polarity parameter),正相色谱,溶剂,极性越强,，洗脱能力越强，是,强溶剂。,反相色谱,溶剂,极性越弱,，洗脱能力越强，是,强溶剂。,强度因子,S,(二)溶剂的强度和选择性1溶剂的极性和强度正相色谱 溶剂,第18章 高效液相色谱法课件,正相色谱,极性参数,P,反相色谱,反相色谱常用溶剂的强度因子,水,甲醇,乙腈,丙酮,二恶烷,乙醇,异丙醇,四氢呋喃,0,3.0,3.2,3.4,3.5,3.6,4.2,4.5,强度因子,S,正相色谱极性参数P反相色谱 反相色谱常用溶剂的强度因子水,正相键合相色谱法,式中和为,纯溶剂,i,的极性参数及该溶,剂在混合溶剂中的体积分数。,2.,混合溶剂的强度,反相键合相色谱法,正相键合相色谱法式中和为纯溶剂 i 的极性参数及,原则,：控制,k=25,Xe=lg(K,g,),e,/P,X,d,=lg(K,g,),d,/P,X,n,=,lg(K,g,),n,/P,3,溶剂的选择性,依据,：溶剂和溶质间的作用力,-,选择性参数,原则：控制k=25Xe=lg(Kg)e/P, Xd=l,处于同一组中的各溶剂的作用力类型相同，在色谱分离中具有相似的选择性，而处于不同组别的溶剂，其选择性差别较大。,(,三）流动相最优化方法,四面体法,(a),四面体内的等洗脱面,ABC,（,b,）等洗脱面中,10,个初试实验,溶 剂的配比（,A/B/C,）,处于同一组中的各溶剂的作用力类型相同，在色谱分离中具有相似的,第18章 高效液相色谱法课件,三、分离条件选择,（一）,HPLC,中的速率理论（与,GC,对比）,GC,:,H=A+B/u+Cu,(,填充柱）,或,H=B/u+Cu,(,毛细管柱）,HPLC:,H=A+Cu,三、分离条件选择（一）HPLC中的速率理论（与GC对比）HP,2,）涡流扩散项及其影响因素,1,）流动相流速对,HPLC,板高的影响,讨论,2）涡流扩散项及其影响因素 1）流动相流速对HPLC板高的影,3,）传质阻抗项及其影响因素,注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗，忽略固定相的传质阻抗,m,：色谱柱及填充情况决定的因子,3）传质阻抗项及其影响因素 注：只考虑流动相和静态流动相的传,涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响,涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响,HPLC,法的分离条件,(1),固定相的选择：,小粒度、分布均匀的球形化学键合相固定相（,dp10m,）,(2),流动相及其流速的选择：,选粘度小、低流速,(1ml/min),的流动相,甲醇或乙腈,(3),柱温的选择：,一般选室温,25,0,C,左右,(4),洗脱方式：等度洗脱,（恒组成溶剂洗脱）,梯度洗脱,HPLC法的分离条件(1) 固定相的选择：小粒度、分布均匀的,第三节 高效液相色谱仪,一、高效液相色谱仪流程图,1,贮液罐,(,滤棒，可滤去颗粒状物质,),2,高压泵（输液泵）,3,进样装置,4,色谱柱,分离,5,检测器,分析,6,废液出口或组分收集器,7,记录装置,第三节 高效液相色谱仪一、高效液相色谱仪流程图1贮液罐,.,输液泵,:,柱塞往复泵,压力：,2050MPa,。,特点：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。,.输液泵:柱塞往复泵压力：2050MPa。特点：具有压力,.,输液泵,:,柱塞往复泵,.输液泵:柱塞往复泵,1.,等度洗脱,洗脱方式,2.,梯度洗脱,梯度洗脱的优点：缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形，很少拖尾；增加检测灵敏度（因峰变瘦、变高）。但有时引起基线漂移及重复性不佳是其缺点。,1. 等度洗脱洗脱方式 2. 梯度洗脱梯度洗脱,两种实现梯度洗脱的装置：高压梯度和低压梯度,两种实现梯度洗脱的装置：高压梯度和低压梯度,二、进样系统和色谱柱,（一）进样器,流路中为高压力工作状态，,通常使用耐高压的六通阀进样装置，,其结构如图所示：,load,injection,二、进样系统和色谱柱 （一）进样器loadinject,(,二,),色谱柱,柱体为直型不锈钢管，内径,1,6 mm,，柱长,5,40 cm,。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(4.0 mm250 mm,，,5 m),(二) 色谱柱 柱体为直型不锈钢管，内,三、检测器,（一）光电二极管阵列检测器（,PDAD,）,三、检测器（一）光电二极管阵列检测器（PDAD）,二、蒸发光散射检测器,(ELSD),二、蒸发光散射检测器(ELSD),第四节 高效液相色谱分析方法,定性分析方法,定量分析方法：,外标法、内标法 同,GC,第四节 高效液相色谱分析方法 定性分析方法,作业：,3,13,19,作业：3,13,19,三、分离条件选择（自学）,（一）,HPLC,中的速率理论（与,GC,对比）,GC,:,H=A+B/u+Cu,(,填充柱）,或,H=B/u+Cu,(,毛细管柱）,HPLC:,H=A+Cu,三、分离条件选择（自学）（一）HPLC中的速率理论（与GC对,2,）涡流扩散项及其影响因素,1,）流动相流速对,HPLC,板高的影,讨论,2）涡流扩散项及其影响因素 1）流动相流速对HPLC板高的影,3,）传质阻抗项及其影响因素,注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗，忽略固定相的传质阻抗,m,：色谱柱及填充情况决定的因子,3）传质阻抗项及其影响因素 注：只考虑流动相和静态流动相的传,涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响,涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响,HPLC,法的分离条件,(1),固定相的选择：,小粒度、分布均匀的球形化学键合相固定相（,dp10m,）,(2),流动相及其流速的选择：,选粘度小、低流速,(1ml/min),的流动相,甲醇或乙腈,(3),柱温的选择：,一般选室温,25,0,C,左右,(4),洗脱方式：等度洗脱,（恒组成溶剂洗脱）,梯度洗脱,HPLC法的分离条件(1) 固定相的选择：小粒度、分布均匀的,