免疫组化双重染色技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第八章,.,免疫组化双重染色技术,(Double staining,technology in immunohistochemistry),用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两,种以上的抗原,以发现其定位,形态和功能上的相互关系,.,一,.,连续切片双重染色法,A.,最简单最可靠,.,用同样的免疫组化方法,在两张相邻切,片上各显示一种抗原,然后比较,.,由于每张切片上只进行,一次染色,所以不会互相干扰或出现假性双标记,.,B.,切片厚度,13,?,m.,如果较厚如神经组织切片,(1020,?,m),可以采用“镜像”法,即相邻切片翻转后贴在载玻片上,或利用软件,PS.,1,第八章. 免疫组化双重染色技术 (Double staini,二,.,免疫荧光双重染色法,:,用,不同的荧光色素,标记,不同的抗,体,染色后观察,相应的抗原物质显示不同的颜色,.,A.,直接法,:,1.,一步法,:,将,FITC (490495520530nm,黄绿色荧光,),和,TRITC,(550620nm,红色荧光,),分别标记的两种抗体按一定比例混,合,使每个抗体均为最适稀释度,然后孵育切片,.,2.,二步法,:,先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片,.,2,二. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗体,3.,观察,:,同一个视野里,.,a.,对每一种荧光标记物,(,绿色或红色,),使用不同的,滤色板,进行,观察和照相,每张照片显示一种荧光,比较两张照片,.,b.,两种荧光重叠照相,则在一张照片上可发现分别含不同抗,原的细胞,(,呈绿色或红色,),如果两种抗原存在于同一个细胞,或结构,则呈现两种红绿荧光的混合色,如黄色,.,免疫荧光双重染色法,: FITC,绿色, TRITC,红色,混合色为黄色,.,3,3. 观察: 同一个视野里. a. 对每一种荧光标记物(绿色,B.,间接法,:,1.,两种一抗不标记,但来自,不同种属的,动物如兔和豚鼠,.,2.,两种来源于,同种动物或不,同种动物,的二抗,(,如羊抗兔,IgG,和羊抗豚鼠,IgG,或羊抗,兔,IgG,和猪抗豚鼠,IgG),分别以,FITC,和,TRITC,标记,.,3.,染色程序,:,a.,先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片,显示第,一种抗原,;,然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育,切片,显示第二种抗原,.,b.,将两种一抗混合后孵育切片,再将两种标记的二抗混合后,孵育切片,最后用荧光显微镜观察,.,4,B. 间接法: 1. 两种一抗不标记, 但来自不同种属的动,5,免疫荧光双重染色法,: FITC,绿色, TRITC,红色,混合色为黄色,.,5 免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色,Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa,Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechst blue,6,Y.W Lin. USP26 stained by Alex,三,.,免疫酶双重染色,A.,单酶法,:,1.,原理,:,a.,用一种酶如,HRP,标记显示两种不同的抗原,但用,不同的,电子供体,如,DAB,和,CN,呈现不同颜色的反应终产物,.,b.,两种一抗,来自同种属动物,两重染色之间需将第一次,染色反应中的,各级抗体和酶,或,各级抗体,酶和反应产物,从组织上,洗脱,.,c.,连续做两次染色,所费时间较长,.,7,三. 免疫酶双重染色 A. 单酶法: 1. 原理: a,8,抗体,酶和反应产物洗脱,8 抗体, 酶和反应产物洗脱,2.,染色的最佳条件,:,先对两种待检抗原分别染色,以决定合适的,抗体稀释度和反应条件等,.,3.,双重染色的先后次序,:,a.,先显示含量较少的抗原,.,b.,先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原,.,c.,先用不太敏感的抗体,.,d.,先用,DAB,显色,.,4.,对照试验,:,a.,单染对照,.,b.,在进行第二次染色前,要证明第一次染色的各级抗体和酶活,性被完全除去,而且洗脱后对第二个待检抗原无影响,.,9,2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合,5.,抗体洗脱,:,a.,酸洗法,:,pH2.2,甘氨酸,-HCl,缓冲,液,(,可加入适量二甲基甲酰胺,DMF)14,小时使抗原,-,抗体复合物,解离,.,b.,氧化法,:,2.5% KMnO,4,: 5% H,2,SO,4,:,DDH,2,O=1:4:10260, 1,分,氧化除去,抗体, 0.5% Na,2,S,2,O,5,漂白液脱色,.,第一次染色用,CN,显色,并注意对,第二种抗原的影响,.,c.,甲醛蒸气法,:,1,升容器,+3g,多聚,甲醛,+,切片,置,80,烤箱,14,小时,蒸汽破坏抗体的,Ig,结合部位,.,10,第一次用,ABC,法,氧化法洗脱抗体,.,对照试验证实此为假性双标,.,5. 抗体洗脱: a. 酸洗法: pH2.2甘氨酸-HCl缓,6.,具体操作步骤,:,a.,方法,1:,第一次染色后,除去抗体和酶,而使有色反应终产,物留在抗原部位,再用同样方法进行第二次染色,.,*.,切片处理,抑制内源性酶及正常血清封闭同前,.,*.,用,PAP,法完成第一次染色, CN-H,2,O,2,显色,. TBS,洗两次,每,次,510,分,.,*.,氧化法洗脱,. TBS,洗如上,.,*.,用,PAP,法完成第二次染色, 0.05B-0.01%H,2,O,2,显色,. TBS,洗如上,.,甘油胶封片,.,11,6. 具体操作步骤: a. 方法1: 第一次染色后, 除去,12,一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色,12 一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色,13,大鼠垂体前叶促性腺激素细胞,(,蓝色,),和生长激素细胞,(,棕色,),免疫,酶,(PAP,法,),双重染色,.,13 大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色)和生长激素细胞(棕色,b.,方法,2:,第一次染色后,照相记录,结果并记住照相视野的部,位,.,用有机溶剂,将反应终产物溶解除去,并将第一次染色形成,的,抗体复合物洗脱掉,然后进行第二次染色,.,对同一部位再一,次照相,比较先后照相所得照片,.,*.,切片处理同上,.,*.,用,PAP,法完成第一次染色, CN-H,2,O,2,显色,. TBS,洗两次,每次,510,分,.,*.,以,TBS,封片,照相,(,注意随时从盖片边缘补加,TBS,防止切片,干燥,).,*.,去盖片, TBS,洗,再用酒精,-,二甲苯,-,酒精处理,除去,CN,蓝色反,应产物, DDH,2,O,洗,.,*.,氧化法洗脱,然后,TBS,洗两次如前,.,*.,PAP,法完成第,2,次染色, 0.05B-0.01%H,2,O,2,或,CN-H,2,O,2,显色,.,*.,TBS,洗同上,封片,.,*.,找出第一次照相的部位,再次照相,.,14,b. 方法2: 第一次染色后, 照相记录结果并记住照相视野的,大鼠垂体前叶,GnRH,相关肽阳性细胞,(,左,蓝色,),与促性腺激素细胞,15,(,右,棕色,),为同一种细胞,免疫酶,(PAP,法,),双重染色,.,大鼠垂体前叶GnRH相关肽阳性细胞(左, 蓝色)与促性腺激素,B.,双酶法,:,1.,原理,:,a.,用两种无关的酶分别标记显示两种抗原,常用的酶为,HRP,和,AKP,或,HRP,和葡萄糖氧化酶,.,b.,两种一抗来源于,不同种属的动物,如兔和小鼠,或同种动,物,(,如小鼠,),的两种,单克隆,抗体,但其,Ig,亚类不同,如,IgGl,和,IgG2a.,c.,两种二抗分别是抗兔,IgG,和抗小鼠,IgG,或抗小鼠,IgGl,和抗,小鼠,IgG2a.,可以来自,同种属动物或不同种属动物,可以是,酶标抗体,(,一个用,HRP,另一个用,AKP,标记,),也可以是未标记,抗体,(,一个用兔,PAP,另一个用小鼠,APAAP).,16,B. 双酶法: 1. 原理: a. 用两种无关的酶分别标,c.,可避免抗体残留而引起的假性双标记,不需中间洗脱处理,.,由,于无交叉反应,可将两重染色的同一层抗体混合同时使用并,先,后显示,两种酶的活性,在同一张切片上获得不同颜色的反应终,产物,如棕色和蓝色,.,如两种抗原共存于同一个细胞,则出现灰,紫色的混合色,.,17,c. 可避免抗体残留而引起的假性双标记, 不需中间洗脱处理.,2.,染色的最佳条件,:,先对两种待检抗原分别染色,以决定,合适的抗体稀释度和反应条件等,.,3.,双重染色的先后次序,:,先显示,HRP,再显示,AKP,或葡萄糖,氧化酶,.,4.,对照试验,:,a.,单染对照,.,b.,必需排除两套抗体系统之间的,交叉反应,.,如第二种羊抗,兔,IgG,二抗可能与第一种小鼠,IgG,一抗结合而出现假性双,标记,因此应事先做抗体进行交叉染色实验,.,18,2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合,5.,染色步骤,:,以先后使用,PAP,法和,APAAP,法为例,.,a.,切片处理,抑制内源性酶及正常血清封闭如前,.,b.,两种一抗混合液,(,各自稀释度由单染色决定,),室温,30,分或,4,过夜,. TBS,洗两次,每次,510,分,.,c.,两种二抗混合液,(,各自稀释度由单染色决定,),室温,30,分,.,TBS,洗同上,.,d.,PAP,和,APAAP,混合液,(,各自稀释度由单染色决定,),室温,30,分,.,TBS,洗同上,.,e.,显示,HRP,如用,0.05B-0.01%H,2,O,2,镜下控制染色,. TBS,洗,同上,.,f.,显示,AKP,如用萘酚,AS-MX,磷酸盐加固蓝,BB,镜下控制染色,.,TBS,洗同上,.,g.,甘油胶封片,.,19,5. 染色步骤: 以先后使用PAP法和APAAP法为例.,6.,注意事项,:,a.,过厚切片,(7,?,m),可能出现混合色,(,双标记,),的假象,.,b.,APAAP,法中缓冲液用,TBS,而不用,PBS,或至少在显示酶,活性的一步中用,TBS.,c.,内源性,AKP,一般不会引起问题,.,d.,正常血清封闭用两种二抗来源动物的正常血清,.,四,.,免疫酶,-,免疫荧光双重染色法,:,首先用免疫酶法显示,第一种抗原,然后用间接免疫荧光法定位第二种抗原,.,若,两个一抗来自同一动物,需要注意可能发生的,交叉反应,.,20,6. 注意事项: a. 过厚切片(7?m)可能出现混合色,五,.,免疫酶,-,免疫金,(,银,),双重染色法,:,A.,免疫酶,-,免疫金双重染色法,:,1.,用,PAP,法显示第一种抗原,为了加强与胶体金的红色,的对比,用,CN,显色,(,蓝色,),如该抗原存在于神经,则用,DAB,显色,.,2.,用酸洗法洗脱第一次染色的抗体复合物,继之用,IGS,法显示第二种抗原,在光镜下监视染色,直到出现满意,的红色为止,.,3.,用,PAP,法后再用,IGS,法,可防止标记在二抗的胶体金颗,粒与抗体一起洗脱掉,.,金标抗体穿透组织能力差,常需,用较大的一抗和金标抗体浓度并提高其穿透力,.,21,五. 免疫酶-免疫金(银)双重染色法: A. 免疫酶-免疫,B.,免疫酶,-,免疫金银双重染色法,:,1.,用,IGSS,法显示第一种抗原,用,5nm,小颗粒胶体金标记二抗,.,应用物理显影液进行银加强后,在金颗粒周围形成金属银,壳,不但增强了金颗粒的可见度,而且封闭了第一次染色的,各级抗体,从而,避免了,第二次染色试剂发生,交叉反应,.,因银,壳可能覆盖第二种抗原,该法只适用于两种抗原存在于,不,同组织结构,.,2.,缓冲液彻底清洗后,再用免疫酶法,(,如,PAP,或,ABC,法等,),显示,第二种抗原,. IGSS,法所得黑色可与免疫酶法所得棕色,蓝色,等形成显明对比,.,22,B. 免疫酶-免疫金银双重染色法: 1. 用IGSS法显示,