白血病分子生物学分型课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,白血病分子生物学分型,上海血液学研究所,朱勇梅,白血病分子生物学分型上海血液学研究所,1,白血病分子生物学,白血病的分子机制,白血病的分子检测,白血病分子检测的临床应用,白血病分子生物学白血病的分子机制,2,白血病的分子机制,基因(,gene)：,合成有功能的蛋白质多肽链或,RNA,所必需的全部核酸序列。,癌基因(,oncogene)：,细胞或病毒中存在的，能诱导正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。,癌基因活化的方式：,点突变,染色体重排,基因扩增,抑癌基因(,tumor suppressor genes)：,指一类基因，其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑制细胞的恶变。,白血病的分子机制基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或,3,白血病的分子机制,白血病的分子机制,4,白血病的分子机制,增殖,过度,分化,阻断,凋亡,受抑,白血病的分子机制增殖过度,5,“二次打击”学说,D.Gary Gilliland Best Practice 16:409-417,“二次打击”学说D.Gary Gilliland Best,6,白血病的分子检测,Southern blot,Northern blot,Western blot,FISH,PCR,测序,芯片,白血病的分子检测Southern blot,7,白血病的分子检测,PCR,反应原理,白血病的分子检测PCR反应原理,8,N = N,0,x (1+E),n,N：,扩增子数量,N,0,：,起始模板数量,E：,扩增效率,n：,循环数,白血病的分子检测,PCR,理论方程,N = N0 x (1+E)n 白血病的分子检测PCR理,9,白血病的分子检测,PCR,方法优点,快速,灵敏,特异,PCR,方法缺点,假阳性,假阴性,白血病的分子检测PCR方法优点,10,白血病的分子检测,PCR：,仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（2,kb），,如,T-ALL,中,SIL-TAL1,。,RT-PCR：,可用于染色体,断裂点跨越很大的区域的融合基因。,巢式,RT-PCR：,可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。,RQ-PCR：,可定量扩增产物。,多重,PCR：,同管扩增多个目的片段。,白血病的分子检测PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范,11,白血病的分子检测定量,PCR,RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR）,荧光标记扩增产物,荧光标记,引物,特异性荧光标记,探针,TaqMan,探针、分子信标、杂交双探针,荧光染料直接结合,扩增产物,SYBR Green I,与,DNA,双链结合,动态监测荧光信号变化,白血病的分子检测定量PCRRQ-PCR（Real-tim,12,TaqMan,探针法,特异性高,多重基因定量,成本较高,TaqMan探针法特异性高,13,SYBR Green I,法,成本低,最适合初步筛查,熔解曲线功能,无法多重检测,无模板特异性,灵敏度低,SYBR Green I 法成本低,14,白血病的分子检测定量,PCR,白血病的分子检测定量PCR,15,白血病的分子检测定量,PCR,C,T,值：荧光信号有统计学意义显著增长（穿过阈值线）时的循环次数,C,T,值与起始模板量成反比,白血病的分子检测定量PCRCT值：荧光信号有统计学意义显,16,白血病的分子检测定量,PCR,RQ-PCR,的检测系统：,该系统内置了96孔,PCR,仪，且在每个反应孔上均有一个监测探头用于检测,PCR,反应管中的荧光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实时检测的目的。,系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，并最终得到,C,T,值。,该系统可以根据标准品的,C,T,值和拷贝数自动绘制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷贝数。,白血病的分子检测定量PCRRQ-PCR的检测系统：,17,白血病的分子检测定量,PCR,RQ-PCR,方法优点：,灵敏而特异,起点定量,闭管化学（污染的风险低）,没有,PCR,后处理（无需走胶，拍照等）,高度自动化,定性：单数据点测定,定量：多数据点测定,能做基因分型及,SNP,鉴定,白血病的分子检测定量PCRRQ-PCR方法优点：,18,RQ-PCR,的操作流程,从细胞或组织中抽提,DNA,或,RNA,用,PCR,或,RT-PCR,扩增特异片段,将,PCR,产物克隆到合适的载体上,纯化，定量和系列稀释质粒,DNA,或,RNA,体外转录成,RNA,片段（仅用于,RNA,样品）,构建标准曲线（,CT, lgcopy,）,样品的定量检测,校正样品基因拷贝数,RQ-PCR的操作流程从细胞或组织中抽提DNA或RNA用PC,19,白血病分子检测的临床应用,白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义：,补充,MIC,检查的不足,发现新的亚型,监测白血病的微小残留病灶（,MRD）,为研究白血病的发病机制打下基础,白血病分子检测的临床应用白血病的分子生物学检查对白血病诊断分,20,PCR,方法检测,MRD,常用的分子标志,PCR方法检测MRD常用的分子标志,21,AML1-ETO,t(8;21)(q22;q22),68%原发性,AML，,在,M2,中的阳性率为2040%，在,M2b,中阳性率为90%,少见于,M4,和,M1，,极少见于,MDS,和骨髓增生综合症,AML1-ETO+,白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感,AML1-ETO+,患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他,AML,亚型（,M3,除外）好,AML1-ETOt(8;21)(q22;q22),22,AML1-,阴性,ETO+,AML1- 阴性,23,AML1-ETO,对初发患者进行,t(8;21),和,AML1-ETO,融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要,AML1-ETO,定性结果不能用于评价患者,MRD,情况,RQ-PCR,能实时反映体内,AML1-ETO,水平。连续定量,AML1-ETO,转录本水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发,AML1-ETO对初发患者进行t(8;21)和AML1-ET,24,PML-RAR,t(15;17)(q22;q21),98%,M3,患者,继,t(15;17),之后，又先后发现4种,M3,特异的累及,RAR,的变异性染色体易位：,t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21),以及,dup(17)(q21.3;q23)，,分别产生,PLZF-RAR,，,NPM-RAR,，,NuMA-RAR,和,STAT5b-RAR,融合基因,临床上，具有,PLZF-RAR,或,STAT5b-RAR,融合基因患者对,ATRA,治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经,ATRA,治疗可获完全缓解,PML-RARt(15;17)(q22;q21),25,PML-RAR,APL,累及的,RAR,基因及其伙伴基因结构示意图,PML-RARAPL累及的RAR基因及其伙伴基因结构示意,26,PML-RAR,由于,PML,基因断裂点,不同产生3,种不同的,PML-RAR,异构体,约,55%,的,M3,患者为,L,型，,40%,为,S,型，,5%,为,V,型，且每位患者只表达一种,PML-RAR,融合蛋白,形态学上,S,型白血病细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常，,V,型,APL,患者的白血病细胞体外对,ATRA,的敏感度低,PML-RAR由于PML基因断裂点不同产生3种不同的PML,27,L+,阴性,S+,L+ 阴性 S+,28,PML-RAR,RT-PCR,检测,PML-RAR,是敏感且特异的,APL,诊断方法，还能用于治疗后,MRD,监测。,PML-RAR,阳性提示的分子复发常早于临床复发3-6个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障,RQ-PCR,能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，在,MRD,监测中比,RT-PCR,具有更高价值,PML-RARRT-PCR检测PML-RAR是敏感且特异,29,PML-RAR,A,B,PML-RARAB,30,CBF,-MYH11,inv(16)(p13;q22),及,t(16;16)(p13;q22),主要见于,M4Eo，10%,不伴异常嗜酸细胞,M4，,少见于,M2,CBF,-MYH11,融合蛋白通过干扰核心结合因子（,core binding factor,CBF）,的转录激活作用而致病,具有,CBF,-MYH11,的患者对化疗敏感，预后较好，故提高检测率尤具临床意义,CBF-MYH11inv(16)(p13;q22)及t(1,31,CBF,-MYH11,CBF,-MYH11,具有多种变异型，其中最常见的为,A,型，占,80%,RT-PCR,检测,CBF,-MYH11,进行,MRD,监测显示，大部分患者在完全缓解时,PCR,转阴，但仍有小部分长期存活者,PCR,仍为阳性,最新研究采用,RQ-PCR,检测,CBF,-MYH11,转录本水平来评价,M4Eo,患者,MRD,情况，预示复发,CBF-MYH11CBF-MYH11具有多种变异型，其中,32,白血病分子生物学分型课件,33,DEK-CAN,t(6;9)(p23;q34),主要见于,M2,或,M4,，也见于,M1，MDS,-,RAEB,伴,DEK-CAN,的患者年龄一般较轻，且预后较差,此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，调整治疗方案,DEK-CANt(6;9)(p23;q34),34,BCR-ABL（p190）,t(9;22)(q34;q11),1530%,成人,ALL,及,35%,儿童,ALL,9,号染色体的断裂点与,CML,相同，但,22,号染色体断裂点具有异质性,此融合蛋白,p190,刺激细胞增殖的能力比,p210,要强。在转基因试验中观察到,p190,诱发的白血病具有起病早、发展快和恶性程度高的特点,BCR-ABL+,ALL,患者预后差，,5,年存活率,20%,，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗,BCR-ABL（p190）t(9;22)(q34;q11),35,BCR-ABL（p190）,对于自体或异体移植,ALL,患者，移植前后,BCR-ABL,的有无以及,BCR-ABL,的转录本类型与预后有关,BCR-ABL（p190）对于自体或异体移植ALL患者，移植,36,e1a2+,阴性,e1a2+ 阴性,37,E2A-PBX1,t(1;19)(q23;p13),56%儿童,ALL,和3%成人,ALL,此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无病生存期（,DFS）,仅6个月，3年,DFS,为20%，需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后,核型和,E2A-PBX1,检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要,E2A-PBX1,的预后价值需更多的临床研究证实,E2A-PBX1t(1;19)(q23;p13),38,白血病分子生物学分型课件,39,TEL-AML1,t(12;21)(p13;q22),25%儿童,ALL，,是儿童,ALL,中最常见的分子异常,目前为止尚未在,T-ALL，AML,或,NHL,中发现,t(12;21)，,在婴儿白血病中极少报道，在成人白血病患者中频率很低（2%）,此类患者发病年龄小（2岁10岁），,WBC,计数低（50 000/,L），,免疫表型为前,B-ALL,此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好,TEL-AML1t(12;21)(p13;q22),40,TEL-AML1,由于12,p,和21,q,末端在常规显带中很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅0.05%,，,需应用,FISH,或,RT-PCR,方法提高检测阳性率,TEL,基因重排是独立预后因素，,RT-PCR,检测,TEL-AML1,融合基因能将低危险度与高危险度的,ALL,患者区分开来。因此早期检测,TEL-AML1,融合基因对临床预后，确定合适的治疗方案都有重要意义,TEL-AML1由于12p和21q末端在常规显带中很相似，因,41,白血病分子生物学分型课件,42,MLL,相关融合基因,累及,MLL,基因的分子异常见于5.2%,AML，22%ALL,和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可见于治疗相关白血病，尤接受,topoisomerase II,抑制剂治疗的患者,MLL,基因涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有：,t(4;11)(q21;q23),MLL-AF4,融合基因,ALL,t(9;11)(p22;q23),MLL-AF9,融合基因,AML,t(11;19)(p13;q23),MLL-ENL,融合基因,AML,及,ALL,MLL相关融合基因 累及MLL基因的分子异常见于5.2%AM,43,MLL,相关融合基因,至今，,MLL,相关融合蛋白的致病性还不清楚，推测其可能具有双重作用：,融合蛋白可能获得新的功能，促使细胞转化,MLL,发生断裂后，缺失锌指结构域的,MLL,不能与,DNA,结合，失去其转录活化功能，使受,MLL,调节的靶基因（,HOX,基因）表达异常，也影响造血细胞的发育,MLL相关融合基因至今，MLL相关融合蛋白的致病性还不清楚，,44,MLL-AF4,t(4;11)(q21;q23),t(4;11),的发生率在不同年龄段是不同的，在婴儿,ALL,中最多见，为,5070%,，而在儿童和成人中较低，分别为,2%,和,36%,此类患者发病年龄低（通常90%,CML,患者,BCR-ABL,融合蛋白（,p210）,的酪氨酸蛋白激酶活性较正常,ABL,高，可能是,BCR,对,ABL,激酶活性调节区的作用所致,由于5%,CML,患者为隐匿性,Ph,染色体，因此无,Ph,染色体,CML,患者还需使用更灵敏的分子检测手段如,FISH,或,RT-PCR,检测,BCR-ABL,融合基因,RT-PCR,还能区分,e1-a2,和,b2-a2/b3-a2,二种,BCR-ABL,转录本，从而区分,ALL,患者与,CML,急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不同的治疗方案,BCR-ABL（p210）t(9;22)(q34;q11),52,b3a2+ b2a2+,阴性,b3a2+ b2a2+ 阴性,53,BCR-ABL（p210）,巢式,RT-PCR,检测,BCR-ABL,融合基因用于,CML,移植患者移植后,MRD,监测。可在患者血液学复发前的624个月骨髓检测就呈阳性。,RQ-PCR,更能动态观察患者治疗（格列卫，骨髓移植等）后,BCR-ABL,转录本水平变化情况，反映疗效。,BCR-ABL（p210）巢式RT-PCR检测BCR-ABL,54,FIP1L1-PDGFR,del(4)(q12;q12),见于,HES,和,CEL,，中位发生频率23%(0-56%),由于断裂点不同以及,FIP1L1,多种选择性剪切形式，产生了不同的融合蛋白，但研究发现所有的病例必有一种融合蛋白维持读码框架，并保留,PDGFR,的激酶活性区。,FIP1L1-PDGFR,融合蛋,白具有失调的蛋白酪氨酸,激酶活性。,FIP1L1-PDGFRdel(4)(q12;q12),55,基因突变,45%,AML,患者核型正常，预后属中等风险组，但其实这是一组异质性很高的人群，有赖于通过基因突变检测对其分类,基因突变分二大类：,Class I,突变激活信号转导通路，增加造血前体细胞增殖、存活。如,FLT3，RAS，JAK2,Class II,突变影响转录因子或转录共激活复合物成员，从而影响细胞分化。如,CEBPA，MLL，NPM,基因突变45%AML患者核型正常，预后属中等风险组，但其实这,56,C-KIT,基因突变,C-KIT,为,III,型受体酪氨酸激酶家族（还包括,c-FMS，PDGFR,和,c-KIT,）,成员之一,C-KIT,突变可见于伴,inv(16),的,M4,以及伴,t(8;21),的,M2,患者,26/54,例,(48.1%),M2b,患者中检测到,C-KIT,基因突变,57,例不伴,t(8;21),的其他类型血液肿瘤患者均未检测到,C-KIT,基因突变,以上结果提示,C-KIT,突变与,M2b,密切相关,(,R=0.94, P0.01),C-KIT基因突变C-KIT为III型受体酪氨酸激酶家族（还,57,C-KIT,基因突变,C-KIT,基因结构,JM,C-KIT基因突变C-KIT基因结构JM,58,C-KIT,基因突变,KIT,突变主要有两种。第一种位于受体胞外部分的,8,号外显子；第二种位于,17,号外显子的,816,编码子。,外周血白细胞计数,C-KIT基因突变KIT突变主要有两种。第一种位于受体胞外部,59,C-KIT,基因突变,多因素分析显示，,KIT,突变提示预后不良、生存期缩短。,C-KIT基因突变多因素分析显示，KIT突变提示预后不良、生,60,FLT3,基因突变,Fms-related tyrosine kinase 3,FLT3,为,III,型受体酪氨酸激酶家族（还包括,c-FMS，PDGFR,和,c-KIT,）,成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用,综合国外各研究报道，,FLT3-ITD,和,D835,突变在,AML,中阳性率分别为,24%(385/1585),和,7%(30/429),，总阳性率超过,30%,，使其成为,AML,中最普遍发生突变的靶基因,许多临床研究发现，,FLT3,突变还与临床预后密切相关，尤对,60,岁以下的,AML,患者，,FLT3,突变患者预后较差，且可独立于核型之外,FLT3基因突变Fms-related tyrosine k,61,FLT3,基因突变,FLT3基因突变,62,FLT3,基因突变,FLT3,基因主要突变类型,FLT3基因突变FLT3基因主要突变类型,63,FLT3,基因突变,mut-FLT3,信号通路,FLT3基因突变mut-FLT3信号通路,64,FLT3,基因突变,外周血白细胞计数,FLT3基因突变外周血白细胞计数,65,NPM,基因突变,Nucleophosmin，,为核-浆穿梭蛋白，调控,p53-ARF,通路,见于约50%核型正常的,AML,患者，而在伴低危/高危核型患者中极少见,主要见于,M1，M2，M4,中，以原发,AML,为主，而在,MDS,继发,AML,和,t-AML,中少见,伴此突变患者,WBC,计数高,NPM,突变患者预后较好（,CR,率高，,EFS/OS,更长），但,NPM,突变同时伴,FLT3-ITD,者预后差，,NPM+/FLT3-ITD+,预后与,NPM-/FLT3-ITD+,接近,NPM基因突变Nucleophosmin，为核-浆穿梭蛋白，,66,NPM,基因突变,第12号外显子的插入/缺失。14种突变型，,A,型最多（近90%），其次,D,型（近10%）,NPM基因突变第12号外显子的插入/缺失。14种突变型，A型,67,MLL-PTD,MLL-partial tandem duplications,约90%三体11，近10%核型正常的,AML，,少部分,t-AML,发生频率与年龄有关（老年患者中频率较高）,与,FAB,分类关系不大,主要类型有,e9/e3，e10/e3，e11/e3,MLL,-PTD,突变总是同时伴有,MLL,野生型等位基因的静默,此类患者预后差,MLL-PTD,可与,FLT3-ITD,共存,MLL-PTDMLL-partial tandem dupl,68,MLL-PTD,MLL-PTD,产生原因是由于,Alu,重复序列的错配,MLL-PTD,可导致,wt-MLL,活性丧失，此外重复的,DNA,结合结构域可导致高转录激活能力，从而致病,MLL-PTD,在正常人中也存在，但,AML,患者中,MLL-PTD,表达水平比正常人高4,log，,患者,MLL-PTD,表达下降水平可反映其预后,MLL-PTDMLL-PTD产生原因是由于Alu重复序列的错,69,CEBPA,基因突变,CCAAT/enhancer binding protein, gene,，,是髓系多能祖细胞向成熟中性粒细胞分化的关键基因,见于约10%左右的核型正常,AML,主要见于,M2，M1,突变可导致,CEBPA,蛋白,N,端截短，此截短的,CEBPA,蛋白可抑制野生型,CEBPA,的,DNA,结合和转录激活能力,突变患者预后较好,CEBPA基因突变CCAAT/enhancer bindin,70,N-RAS,基因突变,为,RAS,基因家族成员之一，染色体定位于1,p32.2。,具有,GTP/GDP,结合和,GTPase,活性，调控正常细胞的生长,此基因突变存在于11-30%,AML,在,inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3),中突变率较高，而在,t(15;17),中低,突变热点位于,codon12,13,和61,伴此突变患者外周血,WBC,计数低,该突变预后意义尚不明,N-RAS基因突变为RAS基因家族成员之一，染色体定位于1p,71,WT-1,基因突变,Wilms tumor 1,存在于约10%核型正常,AML,患者中,突变主要存在于,exon7,和,exon9,突变类型主要是移码突变，其次置换突变,突变患者预后差,WT-1基因突变Wilms tumor 1,72,NOTCH1,基因突变,NOTCH1,信号对,CLP(common lymphoid progenitors),向,T,细胞定向以及前,T,细胞受体复合物组装是必须的,35-50%,T-ALL,患者存在此基因突变,伴,NOTCH1,基因突变的成年,T-ALL,患者预后较差,NOTCH1基因突变NOTCH1信号对CLP(common,73,NOTCH1,基因突变,NOTCH1,基因结构,NOTCH1基因突变NOTCH1基因结构,74,NOTCH1,基因突变,NOTCH1,突变患者预后差,NOTCH1基因突变NOTCH1突变患者预后差,75,GATA2,基因突变,调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力,CML,急变患者中新发现,GATA2,基因突变， 而,CML,慢性期、加速期，,AML,（,M1-M7,），,MDS,，,ALL,，,CLL，,淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及正常对照均未发现该突变，可见,GATA2,基因突变仅与,CML,急变相关，是,CML,疾病进展过程中的获得性突变。总发生率为,12.5%（5/40）,，且均造成,CML,急粒单变,GATA2,基因,突变与,CML,患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明,GATA2基因突变调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维持,76,JAK2,基因突变,Janus kinase 2,此基因突变主要见于,MPD,和,MDS，,另可存在于部分,AML,尤,M2,骨髓增殖性疾病中，,JAK2,V617F,突变在,PV,中发生率约,95%,，在,IMF,中发生率约,58%,，在,ET,中的发生率约,50%,。,突变主要为,V617F,突变去除了,JAK2 JH2,负性调控，导致该基因的持续活化，赋予细胞增殖存活优势,JAK2,可成为靶向治疗的靶点,JAK2基因突变Janus kinase 2,77,IKZF1,基因,位于7号染色体, 转录产物为,ikaros,C,端2个锌指结构介导,ikaros,家族蛋白的二聚化，,N,端锌指结构介导,ikaros,和,DNA,的结合。,Ikaros,对正常造血时淋系的分化起关键作用。,由于,IKZF1,基因转录后的选择性剪接导致不同,isoform,的形成。目前主要有13种已经命名的,isoform。,IK1，IK2，IK3,为长片段的野生型,isoform，,在正常骨髓,胸腺及胎肝的造血细胞中表达。短片段无,DNA,结合功能的,isoform,对野生型,isoform,有显性负的抑制作用，转入无,DNA,结合功能的,Ikaros isoform,的小鼠可发生白血病。,IKZF1基因位于7号染色体, 转录产物为ikaros,78,IKZF1,基因,IKZF1基因,79,IKZF1,基因,在淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病急变的白血病细胞中检出无,DNA,结合功能的短片段,isoform,Ikaros isoform,在各类白血病患者及正常人中的表达频率,IKZF1基因在淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病急变的白血病,80,HOX11,基因异常表达,t(10;14)(q24;q11) ，t(7;10)(q34;q24),7%,的,T-ALL,易位使,HOX11,基因受控于,TCR,和,TCR,基因调控序列，导致其异常,表达,另有部分,HOX11,高表达患者核型正常,伴有此种异常的患者对联合化疗反应好，预后也较其他,T-ALL,患者要好，完全缓解率为,100%,，平均无病生存期为,46,个月，,3,年无病生存率为,75%,HOX11基因异常表达 t(10;14)(q24;q11),81,HOX11L2,基因异常表达,t(5;14)(q35;q32),20%,的儿童,T-ALL,易位使,HOX11L2,基因处于,CTIP2,调控元件的控制下，而,CTIP2,基因在,T,淋巴细胞分化时高度表达,在随访患者中检测到高水平,HOX11L2,说明白血病细胞的存在，强烈预示复发，而完全缓解患者,HOX11L2,表达水平迅速降低，并维持在一个低水平。可见,HOX11L2,的表达水平可作为,MRD,检测的标志,HOX11L2基因异常表达t(5;14)(q35;q32),82,WT-1,基因高表达,Wilms tumor 1,在正常人中低表达,是无特异分子异常的急性白血病患者理想的,MRD,检测指标,伴此基因高表达者预后差，且表达程度与预后相关,WT-1基因高表达Wilms tumor 1,83,基因表达异常,BAALC,基因,最初表达于神经外胚层衍生组织和造血祖细胞中，成熟血细胞中不表达。在保留野生型,FLT3,等位基因（包括,FLT3,-ITD,杂合突变）的患者中，外周血细胞异常高表达,BAALC,提示预后不良、生存期缩短。,ERG,基因,属于,ETS,转录因子家族成员，参与调节细胞增殖、分化和凋亡。在核型正常的青年,AML,中，外周血,ERG,基因异常高表达提示预后不良。而且，在伴,NPM,+ /,FLT3,-ITD-,突变的患者中，,ERG,基因异常高表达可以逆转其良好预后，导致无病生存期缩短。,基因表达异常 BAALC基因最初表达于神经外胚层衍生组织和造,84,基因表达异常,MN1,基因,克隆于伴平衡易位,t(12;22) (p13;q11-12),的,AML,，,与,ETV6,基因形成融合基因。在核型正常的青年,AML,中，,MN1,基因的表达异常与高复发率和较短的生存期相关。,EVI1,基因,异常高表达在核型中危异常的,AML,中提示预后较差，但需同时排查,NPM1,、,FLT3,、,CEBPA,等基因突变的影响。,基因表达异常 MN1基因克隆于伴平衡易位t(12;22) (,85,SNP(Single Nucleotide Polymorphism),SNP,定义,DNA,序列的某个位点上存在的单个碱基变化,(,替代、插入或缺失,),，在人群中发生频率超过,1%,A T T C C G G G T A C T A C T,A T T C C G G A T A C T A C T,SNP,SNP(Single Nucleotide Polymorp,86,SNP,SNP,的数量和分布,3,000,000,000,碱基对,3,000,000 SNP,500,000,1000-10000,10-100,人类基因组计划,所有的,SNP,与基因有关的,SNP,与疾病有关的,SNP,致病性,SNP,SNPSNP的数量和分布3,000,000,000 碱基对3,87,SNP,rSNP,：位于调控区的多态，有可能改变转录因子的结合位点，因而影响基因的表达量,cSNP,：在基因的编码区，如引起蛋白质重要部位氨基酸的变化，会导致蛋白功能及活性改变,iSNP,：位于内含子，如果靠近编码区，有可能会影响,mRNA,的剪接。这种情况并不多见,其他,SNP,：分布在基因组其它部位的,SNP,。虽然可能与基因功能改变不直接相关，但可以作为标记，用于疾病基因的寻找，群体遗传学的研究等,SNPrSNP：位于调控区的多态，有可能改变转录因子的结合位,88,SNP,的检测,对未知多态的检测,直接测序,变性梯度凝胶电泳分析,(DGGE),变性高效液相色谱分析,(DHPLC),在人群中筛查已知多态,大规模,SNP,分型方法如,荧光定量、焦磷酸测序、质谱检测、荧光磁珠等,SNP的检测对未知多态的检测,89,SNP,的检测直接测序,CT,CC,SNP的检测直接测序CTCC,90,SNP,的检测直接测序,AACAGT/-,SNP的检测直接测序AACAGT/-,91,SNP,的检测质谱检测技术,基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱,（,matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF）,原理：在激光飞行时间质谱仪中，样品被基质吸附后形成晶体，在激光激发下变成亚稳态的离子，在强电场作用下在真空管中飞行达检测器。离子质量越小，带的负电荷越多，会越快到达检测器，据此可准确区分出分子量相差很小的不同核酸片段。,SNP的检测质谱检测技术基质辅助激光解吸附电离飞行时间质,92,SNP,的检测质谱检测技术,SNP的检测质谱检测技术,93,SNP,的检测质谱检测技术,工作流程,结果分析,识别,PCR,SAP,纯化,去除未反应,的,dNTP,碱基延伸,树脂纯化,去除盐离子,移液站上样,384,孔芯片,飞行时间,质谱检测,SNP的检测质谱检测技术工作流程结果分析PCRSAP纯化,94,SNP,的检测质谱检测技术,单碱基延伸反应,T,C,T,引物,(,23,碱基,),延伸引物,(,26,碱基,),A,C,T,延伸引物,(,24,碱基,),T,C,T,A,C,T,相同的引物,(,23,碱基,),+,酶,+,ddATP,+,dCTP/dGTP/dTTP,A,T,G,A,EXTEND Primer,Allele 1,EXTEND Primer,Allele 1,Allele 2,EXTEND Primer,Allele 2,TT,TA,AA,SNP的检测质谱检测技术单碱基延伸反应TCT引,95,SNP,的检测质谱检测技术,SEQUENOM,MassARRAY,TM,System,SNP的检测质谱检测技术SEQUENOM MassARR,96,SNP,研究的意义,SNPs,作为遗传标记,通过连锁分析定位疾病基因,有些,SNP,本身就可直接导致疾病,SNPs,对疾病的早期风险评估、早期诊断、预防和治疗,等各方面均具有其特殊应用价值,药物基因组学,有助于新药设计、药物疗效、毒副作用的探究，是实,现个体化用药，选择最佳药物的基本保证,进化和群体遗传研究,研究相应,DNA,区段的变异速率和序列间差异，获取丰,富进化信息，为人类的起源、进化和人群的迁移提供,可靠的遗传学证据,SNP研究的意义SNPs作为遗传标记,97,SNP,研究新近展,全基因组,SNP,作图芯片技术（,genome-wide SNP-based mapping arrays,）,可在较高分辨率的基础上检测等位基因信息和拷贝数异常。,通过肿瘤组织中的信号值与正常组织之间的信号值之比得出受检等位基因在全基因组中的拷贝数变化。,Gorletta,小组在约,10%,的核型正常,AML,中找到显微缺失位点如,9,q34.1,、,12p21.3-13.2,、,15q14-15.3,、,16q24,、,21q21.3,和,21,q22.1-22.2,。,Mullighan,小组在,40%,的,B,系祖细胞,ALL,病例中找到新的缺失、扩增、点突变和其他基因结构异常，尤其是,PAX5,基因的突变率达到,31.7%,。,SNP研究新近展全基因组SNP作图芯片技术（genome-w,98,多重,PCR,一次同时扩增多种分子异常,提高异常阳性检出率,适合白血病患者初发时初筛,存在非特异条带,敏感度较单个,PCR,低,多重PCR一次同时扩增多种分子异常,99,多重,PCR,Step 1 Choose primer sequences,-GC=30-60%,-20bp or longer,-gel-separable amplification products,Step 2. Test/align primer sequences,-with each other,-BLAST programs for repetitive seq.,Step 3. Single locus PCR: Initial program,-amplify all loci individually, same conditions,-take 1PCR buffer, no adjuvants,-adjust cycling conditions only,Step 4. Multiplex PCR: equimolar primer mix,-0.1-0.4,m,M each primer,-use PCR program from step 3,Multiplex PCR: step-by-step protocol,多重PCRStep 1 Choose primer sequ,100,多重,PCR,白血病融合基因检测,inv(16)(p13;q22),；,t(X;11)(q13;q23),；,t(6;11)(q27;q23),；,t(11;19)(q23;p13.1),；,t(1;11)(p32;q23),；,t(11;17)(q23;q21),；,t(10;11)(p12;q23),；,dupMLL(11q23),；,t(1;19)(q23;p13),；,t(17;19)(q22;p13),；,t(12;21)(p13;q22),；,del(1)(p34;p34),；,t(8;21)(q22;q22),；,t(3;21)(q26;q22),；,t(16;21)(p11;q22),；,t(4;11)(q21;q23),；,t(11;19)(q23;p13.3),；,t(9;11)(p22;q23),；,t(1;11)(q21;q23),；,t(9;22)(q34;q11),；,t(9;12)(q34;p13),；,t(5;12)(q33;p13),；,t(6;9)(p23;q34),；,t(9;9)(q34;q34),；,t(11;17)(q23;q21),；,t(15;17)(q21;q22),；,t(2;5)(p23;q35),；,t(5;17)(q35;q22),；,t(3;5)(q25.1;q35),多重PCR白血病融合基因检测,101,多重,PCR,ALL IG/TCR,重排检测,IGH,基因：完全,VH-JH,重排,不完全,DH-JH,重排,IGK,和,IGL,基因,IGK,基因：,kappa,缺失重排,(Kde),TCRB,基因：完全,V,-J,重排,不完全,V,-J,重排,TCRG,基因,TCRD,基因,BCL1-IGH,and,BCL2-IGH,多重PCRALL IG/TCR重排检测,102,多重,PCR,多重PCR,103,多重,PCR,联合使用,IGH VH-JH,和,IGH DH-JH,可使检测阳性率高达92%, 如再增加,IGK,，可使检测阳性率进一步提高至,98-100%。,鉴于几乎所有的,T,系恶性肿瘤存在,TCRG,基因重排，而大部分存在,TCRB,基因重排，因此联合使用,TCRB,和,TCRG,在,T,系恶性肿瘤中有相当高的阳性检出率。 此外,TCRD,基因重排是不成熟,T,系恶性肿瘤和,TCR,-,T,系恶性肿瘤有用的分子标志。,多重PCR联合使用 IGH VH-JH 和 IGH DH-J,104,谢 谢！,谢 谢！,105,