硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法课件

,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,中山大学硕士研究生生物医学课程 转录调控基本方法,聪明出于勤奋，天才在于积累,中山大学硕士研究生生物医学课程 转录调控基本方法中山大学硕士研究生生物医学课程 转录调控基本方法聪明出于勤奋，天才在于积累基因组与蛋白质组学技术马珊珊,中山医学院药理教研室,中山大学蛋白质组学研究中心转录调控研究常用方法1. 检测基因的表达水平：,mRNA：RT-PCR,Protein：WB，ICC，IHC，IF,Transcription：报道基因,2. 证明转录因子的功能：,增强: overexpression, constitutively activate,抑制: inhibitor，dominant negative, siRNA，KO mice,3. 导入外源基因方法：,质粒转染，病毒感染，稳定细胞株,中山大学硕士研究生生物医学课程 转录调控基本方法聪明出于勤奋,1,硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法课件,2,硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法课件,3,硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法课件,4,硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法课件,5,意 义,神经元凋亡 ,AD,、,PD,等神经退行性疾病,信号转导与基因调控研究寻找调控凋亡的关键分子,揭示神经退行性疾病机制并确立新的防治靶点,6,意 义神经元凋亡 AD、PD等神经退行性疾病6,JNK/c-Jun,是神经元凋亡的关键通路,撤,NGF,处理交感神经元,撤钾处理小脑颗粒神经元,淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元,黑质多巴胺神经元凋亡,7,JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路 撤NGF处理交,8,8,c-Jun,的靶基因是什么？,Fas L,Mol Cell Biol 2019,Mol Cell Neurosci 2019,J Cell Biol 2019,Bim,Neuron 2019,Neuron 2019,Neurosci Lett 2019,9,c-Jun的靶基因是什么？Fas L Mol Cell,10,10,寻找,c-Jun,促凋亡靶基因 ,基因芯片方法,促凋亡靶基因：,1,凋亡时上调,2 Ad-,169,抑制,3,促凋亡作用,25K,5K,5K+ Ad-,169,提,RNA,cDNA,Affymetrix gene chip,寻找c-Jun促凋亡靶基因,11,169,结构示意图,169结构示意图,12,腺病毒技术,感染率,80,腺病毒技术感染率80,13,各类病毒比较见下表,病毒,表达系统,腺病毒,Adenovirus,慢病毒,Lentivirus,腺相关病毒,Ad-associated virus,病毒基因组,双链,DNA,病毒,RNA,病毒,单链,DNA,病毒,复制,自主复制,自主复制,复制缺陷,是否整合,病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达,病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达,病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达,感染细胞类型,分裂和不分裂细胞,分裂和不分裂细胞,分裂和不分裂细胞,表达丰度,高水平表达,中水平表达,高水平表达,表达时间,快（,1-2,天）,慢,(,2-4,天,),慢,滴度,滴度高达,10,12,pfu/ml,滴度最高可达,10,9,TU/ml,滴度最高可达,10,5,TU/ml,克隆容量,可插入高达,8kb,的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低,可插入不超过,10kb,的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低,可插入不超过,5kb,的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低,免疫原性,高免疫原性,低免疫原性,低免疫原性,各类病毒比较见下表病毒腺病毒慢病毒腺相关病毒病毒基因组双链D,14,c-Jun,靶基因：,dp5, puma, caspase-3, atf3, drak2,15,c-Jun靶基因：dp5, puma, caspase-3,JNK/c-Jun,介导,dp5,表达上调,16,JNK/c-Jun介导dp5 表达上调16,c-Jun,直接调控,dp5,直接调控,: c-Jun,结合,dp5,启动子,触发,dp5,表达,c-Jun直接调控dp5直接调控: c-Jun结合dp5,17,确立dp5启动子核心区,确立dp5启动子核心区,18,分析dp5启动子上的TF位点,TRANSFAC,：,gene-regulation/pub/databases.html,GenomatixSuite,：,需注册,ALGGEN,：,alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.html,alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3,分析dp5启动子上的TF位点TRANSFAC：,19,硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法课件,20,Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点,Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点,21,dp5,启动子上的,ATF,位点对其转录活性是否重要？,dp5启动子上的ATF位点对其转录活性是否重要？,22,报道基因,报道基因,23,ATF,位点是,dp5,上调的关键位点,24,ATF位点是dp5上调的关键位点24,c-Jun,是否直接结合在,dp5,启动子的,ATF,位点上？,25,c-Jun是否直接结合在dp5启动子的ATF位点上？25,Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA),26,Electrophoretic Mobility Shift,c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合,c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合,27,Chromatin Immunoprecipitation (ChIP),Chromatin Immunoprecipitation,28,c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合,29,c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合29,dp5,上调是神经元凋亡所必需,30,dp5上调是神经元凋亡所必需30,siRNA,siRNA,31,32,32,Jonathan Ham Lab,Jonathan Ham Lab,33,34,34,硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法课件,35,ATF,位点介导,c-Jun,靶基因上调,反式作用因子,c-Jun/ATF2,ATF site TTACCTCA,36,ATF位点介导c-Jun靶基因上调反式作用因子 c-J,c-Jun,异二聚体的靶序列,37,c-Jun异二聚体的靶序列37,38,38,39,39,40,40,41,41,c-Jun/ATF2,形成二聚体,42,c-Jun/ATF2形成二聚体42,Immunoprecipitation (IP),Immunoprecipitation (IP),43,c-Jun/ATF2,介导,ATF,活性,c-Jun/ATF2介导ATF活性,44,抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡,45,抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡45,干扰,c-Jun,、,ATF2,抑制神经元凋亡,46,干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡46,atf-decoy,抑制神经元凋亡,p12ATF -( TTACATCA )- c-Jun/ATF2,p12ATF -(GGACATCG)-mut,47,atf-decoy抑制神经元凋亡p12ATF -( TTAC,c-Jun 、ATF2协同促凋亡,c-Jun 、ATF2协同促凋亡,48,constitutively activate,constitutively activate,49,c-Jun/ATF2,二聚体促进神经元凋亡,c-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡,50,51,51,51,BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation Assay),Chang-Deng Hu et al. 2019,Mol Cell,BiFC (Bimolecular Fluorescence,52,凋亡时BiFC增多,凋亡时BiFC增多,53,Fos,BiFC,Fos,BiFC,54,FosBiFC, FosBiFC54,Fos,抑制,c-Jun/ATF2,二聚体形成,55,Fos抑制c-Jun/ATF2二聚体形成55,Fos,保护神经元,56,Fos保护神经元56,57,57,硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法课件,58,转录调控研究常用方法,1.,检测基因的表达水平：,mRNA,：,RT-PCR,Protein,：,WB,，,ICC,，,IHC,，,IF,Transcription,：报道基因,2.,证明转录因子的功能：,增强,: overexpression,constitutively activate,抑制,: inhibitor,，,dominant negative, siRNA,，,KO mice,3.,导入外源基因方法：,质粒转染，病毒感染，稳定细胞株,转录调控研究常用方法1. 检测基因的表达水平：,59,转录调控研究常用方法,4.,从源头寻找差异基因方法：,gene chip, ChIP on chip, ChIP sequence,5.,启动子分析：,确立启动子核心区,预测启动子上的转录因子结合位点,6.,证明转录因子结合在启动子上：,EMSA,，,ChIP,7.,蛋白质与蛋白质相互作用,Co-IP, GST-pull down, BiFC, FRET,，,PLA,转录调控研究常用方法4. 从源头寻找差异基因方法：,60,谢谢！,谢谢！,61,66,、节制使快乐增加并使享受加强。,德谟克利特,67,、今天应做的事没有做，明天再早也是耽误了。,裴斯泰洛齐,68,、决定一个人的一生，以及整个命运的，只是一瞬之间。,歌德,69,、懒人无法享受休息之乐。,拉布克,70,、浪费时间是一桩大罪过。,卢梭,66、节制使快乐增加并使享受加强。德谟克利特,62,