蛋白免疫快速诊断应用技术讲课ppt课件

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level,*,蛋白免疫快速诊断应用技术文档ppt,蛋白免疫快速诊断应用技术文档ppt,1,前言：,1、个人所从事的行业和专业的限制,1）,医学专业、生物专业、化学专业（人）,2）临床免疫类检验试剂（人用）的开发,3）对客户,/,临床需求有所了解,2,、有可能找到的共同点,1,）所采用技术方法具有共同点,2,）为了共同的目标,为人类健康服务,前言： 1、个人所从事的行业和专业的限制,2,一、,免疫检测基础知识及免疫检测技术的进展综述,免疫学技术的范畴,1,、对具有免疫活性物质的定性、定量测定,2,、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定,一、免疫检测基础知识及免疫检测技术的进展综述 1、对具有免疫,3,一、,免疫检测基础知识及免疫检测技术的进展综述,免疫学技术的应用特点,1,、对象,“,包罗万象,”,2,、方法,“,兼容并蓄,”,一、免疫检测基础知识及免疫检测技术的进展综述1、对象“包,4,一、,免疫检测技术的进展综述,抗原的概念与属性,1,、免疫原性,可识别、可反应性,（诱导机体产生免疫应答的特性）,2,、免疫反应性,选择结合性,（和免疫应答产物特异性结合的特性）,一、免疫检测技术的进展综述 1、免疫原性可识别、可反应性,5,一、,免疫检测技术的进展综述,抗原抗体反应的特点,1,、特异性,2,、可逆性,3,、适合比例性,一、免疫检测技术的进展综述 1、特异性,6,一、,免疫检测技术的进展综述,免疫学检测技术评价标准,1,、,Specificity,（特异）,2,、,Sensitivity,（敏感）,3,、,Simplicity,（简便）,4,、,Safety,（安全）,5,、,Saving,（节约）,一、免疫检测技术的进展综述 1、Specificity（特异,7,尿妊娠试纸（HCG)的产品研发准备,NC膜的作用：,针对检验、我们能做什么,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来,需要一台荧光显微镜，且有熟练显微镜操作的人员,一、免疫检测基础知识及免疫检测技术的进展综述,3、Simplicity（简便）,尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制,尿妊娠试纸（HCG)的反应原理图,2、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定,3、Simplicity（简便）,尿妊娠试纸（HCG)部分材料的工艺和质量控制,硝酸纤维膜的分类标准(m和s),三、快速免疫层析技术的应用介绍,如何去开发一个胶体金层析产品,一、,免疫检测技术的进展综述,免疫检测技术的进展,1,、经典的免疫分析技术,凝集反应、沉淀反应、溶血反应、补体结合实验,特点：成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于实现自动化。,2,、现代的免疫分析技术,荧光免疫标记、放射性免疫标记、酶免疫标记、镧系（稀土）元素免疫标记、胶体颗粒标记、临床化学免疫分析技术、发光免疫标记、流式免疫微球技术及生物传感器技术等。,特点：灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。,尿妊娠试纸（HCG)的产品研发准备一、免疫检测技术的进展综述,8,二、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,POCT,概念的引入,POCT,Point of Care Testing,不需要固定的场地、不需要太多的时间、也不需要特定的地方、在没有实验室设备的条件下也能完成检测。检测可在患者身边或者靠近患者的地方完成。,Tests desgined to be at or near the site where the patient is located, that do not require permanent space, and that are performed outside the physical facilities of the clinical laboratory.,(,美国病理家学会,College of American Pathologists,）,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来POCTPoint,9,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,POCT,技术已使用了上千年,1,、约公元前,1500,年法老的私人医生注意到有些人的尿液吸引了很多蚂蚁，而另一些人的尿液则没有。,2,、后来发现这种现象与尿液中的葡萄糖浓度有关,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来1、约公元前1500年,10,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,美国,FDA,对简便实验的定义,1988,年美国临床实验室改良法案：临床豁免权,1,、全自动化仪器直接使用未处理过的标本,/,毛细管血（指尖血）、鼻拭子或尿液；,2,、对标本只需进行基本的、无技术要求的处理，包括去污；,3,、对试剂只需要进行基本的、无技术要求的处理，例如，将试剂,A,和试剂,B,混匀,4,、分析步骤不需要操作者干预,5,、不需要技巧或专门知识,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来1988年美国临床实验,11,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,美国,FDA,对简便实验的定义,6,、无需电子或机械设备保养,7,、所得结果不需要操作者校准、解释和计算,8,、结果易读，例如阳性或阴性，直接读出数值，线条很明显或无线条存在，即等级明显,9,、试验性能可与可溯源的参考方法相比较,10,、有用户可看懂的快速参考指南,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来6、无需电子或机械设备,12,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,POCT,的术语,1,、护理点,/,床边,/,即时检验（,Point of Care Testing),2,、近患者检验,(Near Patient Testing),3,、医务室检验,(Physicians Office Testing),4,、床边检验,(Beside Testing),5,、实验室外检验,(Extra-laboratory Testing),6,、分散检验,(Decentralized Testing),7,、机构外检验,(Offsite Testing),8,、辅助检验,(Ancillary Testing),9,、替换点检验,(Alternative Site Testing),二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来1、护理点/床边/即时,13,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来,不需要专业的操作者 需要专业的操作者,三、快速免疫层析技术的应用介绍,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来,前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。,调节样品等。,2、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定,调节样品等。,尿妊娠试纸（HCG)的产品研发准备,主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来,1、特异性的单克隆抗体,免疫学技术的应用特点,三、快速免疫层析技术的应用介绍,需要一段已知的DNA序列,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,看看发生了什么变化？,不需要专业的操作者 需要专业的操作者,不需要专业的装置 需要专业的装置,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来二、快速免疫检测技术的,14,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,POCT,产品都在哪里应用,日间病房,救护车,医生研究室,血库,社区卫生诊所,环境实验室,健康义诊,家庭康复机构,消防队,康复中心,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来日间病房,15,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,为什么要推动,POCT,产品？,护理过程最佳化,病人护理产出,灾难救助,测试平台,法规要求,工业吸引力,劳动力问题,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来护理过程最佳化,16,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,POCT,产品的优点,操作人员不需要技术背景,周转时间的改善,提高了治疗的忠诚度,检测越好，做的越频繁,样品量少,经济利益,减少住院天数,减少并发症,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来操作人员不需要技术背景,17,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,POCT,产品的优点：周转时间,摘自,Price, BMJ2001,的文章,试验,实验室,POCT,分钟（变化,%,）,尿液分析,40,4,-36,（,90,）,妊娠,78,5,-71,（,94,）,葡萄糖,10,6,-4,（,60,）,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来摘自Price, BM,18,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,POCT,产品的缺陷,操作者无技术背景,结果质量差，与实验室结果有一定差异,不经济,资料不便记录,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来操作者无技术背景,19,调研：我们要做采用什么平台技术,针对检验、我们能做什么,4、Safety（安全）,三、快速免疫层析技术的应用介绍,特点：成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于实现自动化。,POCT技术已使用了上千年,-吸附一定量的标结合物颗粒；,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（HCG)的产品研发准备,注入足够溶液到槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。,1、全自动化仪器直接使用未处理过的标本/毛细管血（指尖血）、鼻拭子或尿液；,美国FDA对简便实验的定义,免疫学检测技术评价标准,特点：灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,当前,POCT,的应用（,1,）,1,、乳胶凝集试验,实验时间为,10-15,分钟,快速、基本不需要仪器,试剂可以冷冻,敏感性差,8-10%,的反应结果不好解释,2,、直接荧光抗体试验,30-60,分钟，需要多个步骤,需要有昂贵的荧光显微镜及熟练的操作人员,调研：我们要做采用什么平台技术二、快速免疫检测技术的过去、现,20,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,当前,POCT,的应用（,2,）,3,、,FISH(,荧光原位杂交）,需要一段已知的,DNA,序列,需要一台荧光显微镜，且有熟练显微镜操作的人员,步骤多，实验时间为,1-2,小时,4,、免疫层析（渗滤）试验,敏感性高、特异性强,总实验时间,5-15,分钟,不需要仪器、也不需要基本的培训,样品不需要特殊处理,免疫层析（渗滤）产品是继尿试纸条和血糖试条之后，当前最为受欢迎的,POCT,产品,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来3、FISH(荧光原位,21,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,免疫渗滤试验,主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体,(,以双抗体夹心法测抗原为例,),的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。,A,：金标记抗体,B,：标本中的抗原,C,：包被抗体,D,：,NC,膜,E,：吸水材料,F,：塑料盒,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来 主要由两部分,22,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,免疫层析试验,免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用,(,基于层析作用的横流 （,lateral flow,）,),向另一端移动。移动过程中被分析物 与固定在膜上某一区域的受体,(,抗原或者抗体,),结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来 免疫层析,23,二,、快速,免疫检测技术的过去、现状和未来,POCT,的未来,？,微流体技术？,纳米技术？,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来？,24,三、快速免疫层析技术的应用介绍,能用来做什么,传染病抗原或抗体测定,肿瘤标志物测定,激素测定,农药残留测定,抗生素测定,毒素测定,药物滥用（毒品）测定,三、快速免疫层析技术的应用介绍传染病抗原或抗体测定,25,三、快速免疫层析技术的应用介绍,针对检验、我们能做什么,传染病抗原或抗体测定,肿瘤标志物测定？,激素测定,农药残留测定,抗生素测定,毒素测定,药物滥用（毒品）测定,立足需求，充分考虑和整合各种优势资源！,三、快速免疫层析技术的应用介绍传染病抗原或抗体测定,26,三、快速免疫层析技术的应用介绍,我们要怎么去做,调研：我们要做采用什么平台技术,平台建设：我们建立快速免疫层析技术平台,项目：我们要做什么项目？,准备：我们拥有了哪些资源，我们还缺少什么资源？,三、快速免疫层析技术的应用介绍调研：我们要做采用什么平台技术,27,三、快速免疫层析技术的应用介绍,免疫层析技术平台,硬件：实验室；设备；生产车间？,软件：,SOP?,人员：专业培训、团队建设,三、快速免疫层析技术的应用介绍硬件：实验室；设备；生产车间？,28,三、快速免疫层析技术的应用介绍,如何去开发一个胶体金层析产品,以尿妊娠试纸（,HCG),为例,三、快速免疫层析技术的应用介绍,29,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),的反应原理图,双抗体夹心法,三、快速免疫层析技术的应用介绍双抗体夹心法,30,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),的产品研发准备,1,、生物材料的准备：,配对的单克隆抗体,（特异性针对,HCG-,亚基,),二抗,2,、主要生产材料,硝酸纤维素膜（特定孔径、流速）,样品垫,结合垫,吸收垫（吸水纸）、片材（,PVC,衬板）等,三、快速免疫层析技术的应用介绍1、生物材料的准备：,31,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),的研发准备,3,、主要设备,点膜仪,喷金仪,干燥设备,粘帖装置,切刀,三、快速免疫层析技术的应用介绍3、主要设备,32,步骤多，实验时间为1-2小时,需要一段已知的DNA序列,m: 指的是膜孔径，此说法实际上是沿用了一直以来的,针对检验、我们能做什么,美国FDA对简便实验的定义,需要一台荧光显微镜，且有熟练显微镜操作的人员,三、快速免疫层析技术的应用介绍,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来,去除样品中杂质颗粒；,三、快速免疫层析技术的应用介绍,8、结果易读，例如阳性或阴性，直接读出数值，线条很明显或无线条存在，即等级明显,POCT技术已使用了上千年,4、床边检验(Beside Testing),3、FISH(荧光原位杂交）,需要有昂贵的荧光显微镜及熟练的操作人员,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,1,、特异性的单克隆抗体,亲和力,特异性,稳定性,步骤多，实验时间为1-2小时三、快速免疫层析技术的应用介绍1,33,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,2,、标记物与蛋白偶联,颗粒大小,颗粒的均一性,颗粒的形状,标记物与蛋白的最佳比例,标记影响,影响因素考虑,三、快速免疫层析技术的应用介绍2、标记物与蛋白偶联,34,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,蛋白与胶体金的偶联：,最佳,pH,测定：取若干,1.5ml,的试管，分别加入,1ml,胶体金,用,K,2,CO,3,将,pH,分别调为,3,，,4,，,5,，,6,，,7,，,8,，,9,，,10,；加入过量待标记蛋白；,取,96,孔培养板，按,pH,从高到低分别将上述胶体金分别取,100l,加入孔中，重复三次；,每孔分别加入,20l,浓度为,10%,的,NaCl,溶液，混合，室温下放置,10min,；,观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低,pH,三、快速免疫层析技术的应用介绍蛋白与胶体金的偶联：,35,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,蛋白与标记物的偶联：,最佳偶联比例确定：,以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由,5g,45g,另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有,1ml,胶体金的试管中，,5min,后，在上述各管内分别加入,0.1ml 10%,氯化钠。,三、快速免疫层析技术的应用介绍蛋白与标记物的偶联：,36,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,3,、样品垫,玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。,样品垫的作用：,减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布；,去除样品中杂质颗粒；,调节样品等。,样本垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂,/,追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。,三、快速免疫层析技术的应用介绍3、样品垫,37,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,4,、结合垫,玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。,结合垫的作用主要为：,-,吸附一定量的标结合物颗粒；,-,吸附并持续不断的将样品转移到,NC,膜上；,-,保持标结合物颗粒的稳定性；,-,保证标结合物颗粒定量完全释放等。,三、快速免疫层析技术的应用介绍4、结合垫,38,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,5,、硝酸纤维素膜,( Nitrocellulose),：,推荐使用,Millipore,，,S&S,等国外公司的硝酸纤维素膜。,NC,膜的作用：,-,在检测线和对照线条带区域固定抗体；,-,样品在,NC,膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；,-,反应在,NC,膜上显色，读检测结果,NC,膜的重要参数：,孔径、对称性、层析速度、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。,三、快速免疫层析技术的应用介绍5、硝酸纤维素膜( Nitro,39,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,5,、硝酸纤维膜,硝酸纤维膜的分类标准,(m,和,s),m:,指的是膜孔径，此说法实际上是沿用了一直以来的,一个形象称呼。,s:,以秒为单位的定义为，每,4cm,膜，水的层析时间是*,s.,换算情况大致为：,8m=135s,；,6m=180s,不同秒数的膜对反应的影响,通过速度越快和包被在,T,线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。,135s,一般用在双抗体夹心法，,180s,一般用在竞争法,.,三、快速免疫层析技术的应用介绍5、硝酸纤维膜,40,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,5,、硝酸纤维膜,如何选择,物理性能,膜的物理性能主要是,2,个参数，膜厚度和宽度,厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的,C/T,线宽窄不一，另外也影响爬速；,宽度,(,检测区的长度,),和爬速及灵敏度的关系,跑水性能,注入足够溶液到槽内，将不同批次膜每隔,1cm,做一次标记（总长大于,4cm,）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。,点样测试,C/T,线出线时间和灵敏度,三、快速免疫层析技术的应用介绍5、硝酸纤维膜如何选择,41,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,6,、吸收垫,(Absorbent Pad),：,提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸收纸；,吸收纸的作用：,主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。,三、快速免疫层析技术的应用介绍6、吸收垫(Absorbent,42,-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；,30-60分钟，需要多个步骤,换算情况大致为：8m=135s；,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来,跑板时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。,5ml的试管，分别加入1ml胶体金,通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。,三、快速免疫层析技术的应用介绍,8-10%的反应结果不好解释,前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。,膜的物理性能主要是2个参数，膜厚度和宽度,二、快速免疫检测技术的过去、现状和未来,尿妊娠试纸（HCG)的产品研发准备,5、硝酸纤维素膜( Nitrocellulose)：,美国FDA对简便实验的定义,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,7,、喷（点）膜,-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；三、快速免疫,43,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,8,、喷金,三、快速免疫层析技术的应用介绍8、喷金,44,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,8,、组装、切割,三、快速免疫层析技术的应用介绍8、组装、切割,45,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,9,、试纸条（卡）的形成,三、快速免疫层析技术的应用介绍9、试纸条（卡）的形成,46,三、快速免疫层析技术的应用介绍,尿妊娠试纸（,HCG),部分材料的工艺和质量控制,10,、试纸条（卡）的使用,三、快速免疫层析技术的应用介绍10、试纸条（卡）的使用,47,谢谢观看！,谢谢观看！,48,