儿科常见疱疹类毒分子诊断及其临床应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,儿科常见疱疹类病毒分子诊断,及其临床应用,磐安县人民医院,申屠桥民,儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用磐安县人民医院申屠桥民,一、儿科常见疱疹类病毒感染的病,原体种类、危害及诊治现状,一、儿科常见疱疹类病毒感染的病原体种类、危害及诊治现状,1,、儿科常见疱疹类病毒感染现状,全世界每年有,1300,万因感染性疾病而死,亡，其中,1000,万是,5,岁以下儿童，,99%,发生在,经济欠发达的发展中国家，其死因的,70%,是因,常见的感染性疾病引起。,1、儿科常见疱疹类病毒感染现状全世界每年有1300万因感染性,随着科技水平的不断提高，各种抗,生素、抗病毒药物日益增多，若能,早期快速明确诊断系何种病原体感,染，就能有效地控制儿童的病死率。,然而，目前感染诊断在我国还局限,于生化、培养、病原体分离等常规,方法，缺乏早期、快速、准确诊断,的方法,随着科技水平的不断提高，各种抗生素、抗病毒药物日益增多，若能,在常见感染性疾病中，细菌与病毒共占,了,90%,以上（其中细菌与病毒各占,45%,左右）。在,95,重大攻关项目中，成功地,创建了,16SrRNA,基因,PCR,基因芯片快,速、准确诊断不同细菌的感染，使细菌,诊断上了一新的台阶，其研究成果也列,入了全国新生儿败血症诊断标准。,在常见感染性疾病中，细菌与病毒共占了90%以上（其中细菌与病,但病毒的快速早期诊断方法仍未,见报道。儿童是祖国的未来，如,何早期明确诊断儿童病毒感染将,是能否治愈病毒感染的关键。,但病毒的快速早期诊断方法仍未见报道。儿童是祖国的未来，如何早,2,、儿科疱疹类病毒感染的危害,儿童病毒感染造成严重危害涉及儿科与围,产医学二大范畴。儿科领域中，病毒感染,致死的主要原因是中枢神经系统感染，典,型的感染为单纯疱疹病毒,型（,HSV,）,所致的脑膜脑炎（,HSE,）。,2 、儿科疱疹类病毒感染的危害儿童病毒感染造成严重危害涉及儿,HSE,是散发性病毒性脑炎中最常,见的病原。其次表现为发热、肝,脾淋巴结肿大等原因不明的病毒,感染，最具代表性的疾病是传染,性单核细胞增多症。目前已知主,要是由于,EB,病毒感染所致。,EB,病,毒还对神经系统危害严重，如引,起脑膜脑炎、格林巴利综合症、,Fishers,综合症等。,HSE是散发性病毒性脑炎中最常见的病原。其次表现为发热、肝脾,在围产医学中，病毒感染的危害在,于宫内感染，最具典型的是巨细胞,病毒（,CMV,），其次是单纯疱疹,病毒,型（,HSV,）。同时，,CMV,脑炎也是,AIDS,患者中最常见,的并发症。,在围产医学中，病毒感染的危害在于宫内感染，最具典型的是巨细胞,疱疹类病毒导致儿童中枢神经系统的感,染，不及时治疗往往造成智力低下、惊,厥发作、语言不清、神经性耳聋等中枢,神经系统严重后遗症，尤其是,HSV,引起,的脑炎，未经治疗死亡率高达,70%,，而,有效的抗病毒药物治疗后可明显改善,HSE,的愈合，使死亡率降至,20-30%,，,但要,确保早期用药,。,疱疹类病毒导致儿童中枢神经系统的感染，不及时治疗往往造成智力,3,、儿科感染疱疹类病毒的种类,造成儿童感染致死的主要病毒是,HSV,、,EBV,、,HCMV,、,HSV,。,这些病毒同属于疱疹类病毒，分别,是,疱疹病毒（,HSV,/,）、,疱,疹病毒（,HCMV,）、,疱疹病毒,（,EBV,）。,3 、儿科感染疱疹类病毒的种类造成儿童感染致死的主要病毒是H,疱疹类病毒尚包括水痘带状疱疹病,毒（,VZV,），常易致脑膜脑炎、脊,髓炎及神经炎；人疱疹病毒,6,型,（,HHV 6,）、,7,型（,HHV 7,），以及,最近发现的,HHV 8,，已有论据显示,坏死性脑炎和,Griscellis,综合症的病,儿脑组织中发现了,HHV 6,病毒。,疱疹类病毒尚包括水痘带状疱疹病毒（VZV），常易致脑膜脑炎、,4,、疱疹类病毒感染诊治现状,目前，对疱疹病毒感染仍缺乏快速、,敏感、特异的诊断方法。传统的诊,断“金标准”为病毒分离，培养一,般需要,5-21,天，费时费力，且敏感,性和特异性均欠佳。大多数情况下，,脑炎的特异性病毒检测率仅,30%,，,约,2/3,的感染者无法用病毒分离获,得明确诊断。,4、疱疹类病毒感染诊治现状目前，对疱疹病毒感染仍缺乏快速、敏,病毒特异性抗体,IgM,，在体液中要,达到有效浓度需,10,天左右，同时可,与其他病毒感染产生交叉反应，从,而使其诊断的敏感性和特异性大大,降低。,病毒特异性抗体IgM，在体液中要达到有效浓度需10天左右，同,而,IgG,抗体则有,95%,的患者将维持,终生，故,IgG,抗体的存在只能说明,有既往感染，不能说明是现时感,染，如要用,IgG,抗体作为现时感染,的诊断依据，必需动态观察其滴,度的变化，因而不能满足临床早,期诊断的需要。,而IgG抗体则有95%的患者将维持终生，故IgG抗体的存在只,聚合酶联反应（,PCR,）是近十几年来,发展起来的分子生物学技术，它可在,一定条件下，短时间内（数小时）使,病原体基因片段发生上百万倍的扩增，,然后用凝胶电泳、核酸杂交、限制性,酶切分析、序列检测。,聚合酶联反应（PCR）是近十几年来发展起来的分子生物学技术，,近几年来，,PCR,诊断技术已广泛地应用,于临床诊断疱疹类病毒感染，,Pozo,应用,多对引物的多重,PCR,来诊断疱疹类病毒,感染，虽然能区分不同的病毒，但因其,引物间可互相干扰，使其敏感性较低。,也有人用各种病毒基因的保守区设计不,同引物进行,PCR,扩增，但只能检测一种,病毒，易造成漏诊。,近几年来，PCR诊断技术已广泛地应用于临床诊断疱疹类病毒感染,因此，许多学者提出能否构建通用引,物来对所有疱疹类病毒进行,PCR,扩增，,从而达到能一次性检测所有疱疹类病,毒，以及它们的混合感染。,因此，许多学者提出能否构建通用引物来对所有疱疹类病毒进行PC,疱疹类病毒是由一组病毒组成，具有许,多相似的生物学特征及分子结构。具有,高度同源序列的基因为,DNA,多聚酶基因，,它所编码的蛋白质是,DNA,多聚酶，为病,毒复制所必需，该基因为所有疱疹类病,毒所共有，且有高度的保守性，理论上,可在此区构建通用引物同时对多种疱疹,类病毒进行检测。,疱疹类病毒是由一组病毒组成，具有许多相似的生物学特征及分子结,Yamamoto,曾在此区构建通用引物对,35,例临床怀疑疱疹病毒感染脑炎患者的脑,脊液（,CSF,）进行,PCR,扩增，然后进行,Southern,杂交，检测了,6,种疱疹类病毒，,但未能区分各自不同的病毒。,Yamamoto曾在此区构建通用引物对35例临床怀疑疱疹病毒,由于病毒的生物学特性比较复杂，各,种病毒差异很大，即使同属疱疹类病,毒，其抗病毒药差异甚大。如抑制,CMV,的更昔洛韦，对,EBV,无任何作用。,阿昔洛韦、泛昔洛韦对,HSV,、,VZV,有,效，但对,CMV,无效。因此，只有明确,具体的病毒感染才能指导临床用药。,由于病毒的生物学特性比较复杂，各种病毒差异很大，即使同属疱疹,国外在这方面也有过尝试，如在疱疹,类病毒基因组的保守区设计几对兼并,引物进行,PCR,扩增，虽能检测各种病,毒，但该方法操作繁杂、费时费力，,不能满足临床需要。,国外在这方面也有过尝试，如在疱疹类病毒基因组的保守区设计几对,二、浙江省医药卫生科研项目,儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其,临床应用,二、浙江省医药卫生科研项目儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床,（一）、国内外现状和发展趋势,（一）、国内外现状和发展趋势,检索国内外近,15,年有关疱疹类病毒的,文献，发现国内外传统的诊断“金标,准”病毒分离因时间需,1-3,周，敏感性,及特异性欠佳，达不到早期准确诊断,的目的。免疫、分子生物学诊断技术,一直是希望提高诊断准确性的方向。,检索国内外近15年有关疱疹类病毒的文献，发现国内外传统的诊断,特异性,IgM,、,IgG,的酶联免疫技术因其,出现的时间及维持时间的限制，加之,滴度的变化需重复检测，限制了该技,术的发展。近,10,年来，国内外研究的,重点主要集中在,PCR,技术的诊断,。,特异性IgM、IgG的酶联免疫技术因其出现的时间及维持时间的,病毒特异性引物建立高度敏感的,PCR,技术已经在临床应用，如我们的研究,团队于,90,年代末成功地建立了套式,PCR,加限制酶分析检测巨细胞病毒，,经实验证明具有高度的特异性与敏感,性。,病毒特异性引物建立高度敏感的PCR技术已经在临床应用，如我们,然而，疱疹类病毒感染其临床表现,相似，有时几种疱疹类病毒同时感,染需用多对引物进行多次,PCR,来检,测不同的疱疹类病毒，使得特异性,PCR,在临床实际诊断中受到限制。,然而，疱疹类病毒感染其临床表现相似，有时几种疱疹类病毒同时感,许多学者因此提出构建通用引物扩增所有,疱疹类病毒，从而达到一次即能检测所有,疱疹类病毒。,Bouquillon,用通用引物扩增,6,种疱疹类病毒，,Sakulwira,等用通用引物扩,增,5,种疱疹类病毒，并用,RFLP,区分不同的,病毒。,许多学者因此提出构建通用引物扩增所有疱疹类病毒，从而达到一次,我们的研究团队对儿童常见的疱疹类病,毒运用通用引物进行体外,DNA,扩增，,进一步用,RFLP,、测序等方法区分不同,病毒，取得较好结果,7,，但仍存在需,多种酶切、,Southern,杂交等的烦琐，使,得在临床常规使用时受到限制。,我们的研究团队对儿童常见的疱疹类病毒运用通用引物进行体外DN,（二）、研究内容、研究目标、拟,解决的问题和今后研究思路,（二）、研究内容、研究目标、拟解决的问题和今后研究思路,1,、,研究内容基础部分,1、研究内容基础部分,（,1,）、以临床常见疱疹病毒感染的诊断为目标，,经计算机查索核酸序列库，选取保守,DNA,区域设,计引物，建立能扩增所有,6-8,种疱疹类病毒的,PCR,方法。对标准毒株,HSV,（,F,株）、,HSV,（,G,株）、,CMV,（,169,株）、,EBV,（,B95-8,株）、,VZV,（,EF,株），以及,HHV6,（,GS,株）进行,PCR,扩增，并选择其他病毒如,HBV,、细菌（大肠杆菌、,金葡菌等）、真菌（新型隐球菌）作为对照，以,摸索出进行通用引物,PCR,所需的最小检出量，及,其各自反应体系的适宜条件。,（1）、以临床常见疱疹病毒感染的诊断为目标，经计算机查索核酸,（,2,）、在疱疹类病毒的可变区域设计特异,性引物，建立扩增对各自特异病毒,DNA,的,PCR,方法，包括,CMV,、,HSV,、,EBV,、,VZV,、,HHV6,、,HHV7,、,HHV8,等的,PCR,方法。并比,较各自特异,PCR,方法与通用引物,PCR,检测标,准毒株其敏感性、准确性等方面的差异。,（2）、在疱疹类病毒的可变区域设计特异性引物，建立扩增对各自,（,3,）、经核酸序列,GenBank,比较，设计各自,特异的,DNA,探针，并进一步分子克隆、序列分,析，明确,HSV,、,HHV6,的亚型基因，设计,HSV,/,、,HHV6A/6B,等的特异性探针。,（3）、经核酸序列GenBank比较，设计各自特异的DNA探,（,4,）、对设计的,DNA,探针末端修饰，,微阵列，制作基因芯片。内容包括固,相载体的选择、玻片表面修饰、探针,末端修饰、微阵列制备技术、核酸探,针的固定及杂交。,（4）、对设计的DNA探针末端修饰，微阵列，制作基因芯片。内,（,5,）、基因芯片杂交系统参数的确定及,检测，包括,DNA,固液相杂交、荧光标记与,检测方法，灵敏度及特异性测定等。,（5）、基因芯片杂交系统参数的确定及检测，包括DNA固液相杂,2,、,研究内容临床部分,2、研究内容临床部分,我院临床有中枢神经系统感染，包,括急性、散发性、局灶性脑炎，脑,膜脑炎等患儿，收取脑脊液及外周,静脉血，对全身不明原因发热、皮,疹、黄疸、肝脾肿大等患儿抽取静,脉血，进行,DNA,抽提、,PCR,扩增，,阳性结果进一步进行基因芯片分析。,我院临床有中枢神经系统感染，包括急性、散发性、局灶性脑炎，脑,同时对临床标本血清（血浆）进行,HSV,、,EBV,、,CMV,等的特异性,IgM,、,IgG,检测。,试图调查儿童疱疹病毒感染的实际情况，,研究儿童病毒感染的早期诊断价值，发现,特定疱疹病毒感染或混合感染情况，以阐,明,PCR-,基因芯片在诊断及区分不同病毒,感染时的实际意义。,同时对临床标本血清（血浆）进行HSV、EBV、CMV等的特异,在研究过程中，同时设立健康体检儿童的,对照组及非病毒感染的脑脊液标本，进行,PCR-,基因芯片检测，以排除假阳性、假阴,性等情况，拟在解决目前病毒感染缺乏早,期、快速、准确诊断的问题。,在研究过程中，同时设立健康体检儿童的对照组及非病毒感染的脑脊,3,、,研究目标,3、研究目标,在疱疹类病毒高度同源序列的,DNA,多聚酶基,因内设计通用引物扩增所有疱疹类病毒,DNA,，,对其,PCR,扩增产物进行分子克隆、序列测定，,通过序列分析找到各自特异的,DNA,序列及亚,型序列，设计特异探针，建立疱疹病毒,DNA,基因芯片区分不同病毒感染，为临床疱疹类,病毒感染的早期、快速诊断提供有效手段。,在疱疹类病毒高度同源序列的DNA多聚酶基因内设计通用引物扩增,4,、拟解决的问题,4、拟解决的问题,（,1,）、在疱疹病毒的高度同源,序列选择通用引物，建立能检测,CMV,、,HSV,、,VZV,、,HHV,等所,有疱疹类病毒的,PCR,方法。,（1）、在疱疹病毒的高度同源序列选择通用引物，建立能检测CM,（,2,）、在疱疹病毒的可变区选择,特异,DNA,探针，并对,HSV,型与,型、,HHV6A,与,HHV6B,等亚型进行,分子克隆、序列分析，找到各自特,异,DNA,序列，建立基因芯片，区分,不同疱疹病毒及其亚型。,（2）、在疱疹病毒的可变区选择特异DNA探针，并对HSV型,5,、今后研究思路,5、今后研究思路,不断成熟完善,PCR-,基因芯片技术在,临床疱疹类病毒诊断中的应用，研,发相关诊断试剂盒；同时探索该技,术在其他儿童常见病毒感染中的诊,断价值。,不断成熟完善PCR-基因芯片技术在临床疱疹类病毒诊断中的应用,6,、,研究方法,6、研究方法,（,1,）、在,PubMed,、,GenBank,中选取,通用引物建立能扩增所有病毒的通用引,物,PCR,方法。选取特异引物建立能扩增,特定疱疹病毒的,PCR,方法。引物合成由,上海生工有限公司,391,型仪合成。,（1）、在PubMed、GenBank中选取通用引物建立能扩,（,2,）、经计算机,GenBank,查阅，在疱疹类病,毒高度同源序列,DNA,多聚酶基因中，设计,6,种,疱疹类病毒特异,DNA,探针，对,HSV,、,HHV6,体外扩增、序列分析，选择亚型,DNA,片段，,区分不同的亚型。对以上所有,DNA,片段探针,经微阵列，建立基因芯片技术。特异性探针,合成及,Amino-link,修饰及,polydT,等由日本,TaKaLa,生物公司完成。,（2）、经计算机GenBank查阅，在疱疹类病毒高度同源序列,（,3,）、标准病毒株,DNA,提取采用分子,克隆二版的经典方法，血及,CSF DNA,抽,提采用我院自行建立的快速抽提,DNA,方,法,。,（3）、标准病毒株DNA提取采用分子克隆二版的经典方法，血及,（,4,）、血特异性,IgM,、,IgG,检测，采用,德国欧蒙公司,ELISA,试剂盒，按说明书,操作。,（4）、血特异性IgM、IgG检测，采用德国欧蒙公司ELIS,（,5,）、收集临床怀疑疱疹病毒感染的血,及,CSF,标本约,100,例进行临床验证。标本,采集前告知患儿监护人该标本将用于科研,研究，并与患儿监护人签署临床研究知情,同意书。,（5）、收集临床怀疑疱疹病毒感染的血及CSF标本约100例进,（,6,）、统计学分析，比较,PCR-,基因芯片,技术在实际应用中的敏感性、特异性、似,然比、正确诊断指数等。,（6）、统计学分析，比较PCR-基因芯片技术在实际应用中的敏,7,、,技术线路,7、技术线路,（一）,基础部分：,设计疱疹类病毒通用引物,CMV,、,HSV,、,EBV,等,特异引物,HHV,分子克隆,HSV,引物合成,设计,CMV,、,HSV,、,VZV,、,EBV,、,HHV,特,异探针,序列分析,通用引物,PCR,扩增,特异引物,PCR,扩增,微阵列,阳性结果,基因芯片,HSV,/、,HHV6A/6B,亚型特异性,探针,明确系何种,疱疹病毒,比较结果,（一）基础部分：设计疱疹类病毒通用引物CMV、HSV、EBV,（二）,临床部分：,临床血标本,白细胞层,DNA,抽提,临床血标本,基因芯片,CSF,标本,血浆,特异性,IgM,、,IgG,比较结果,统计分析,灵敏度、特异性、假阳性率、假,阴性率、似然比、正确诊断指数,（二）临床部分：临床血标本白细胞层DNA抽提临床血标本基因芯,8,、,主要创新点,8、主要创新点,（,1,）、目前临床疱疹类病毒感染缺乏早期、快,速、准确的诊断方法。既有的,PCR,技术在区分,病毒种类时需要多种酶切、,Southern,杂交、测,序等诸多烦琐，限制了其临床应用。本项目将,PCR,与基因芯片技术相结合，针对疱疹类病毒,的共同序列设计通用引物，扩增所有疱疹类病,毒；在可变区域设计特异探针制作芯片，区分,不同病毒，达到早期、快速、明确诊断疱疹类,病毒感染，从而为临床治疗提供依据，具有很,大的社会效益和经济效益,。,（1）、目前临床疱疹类病毒感染缺乏早期、快速、准确的诊断方法,（,2,）、虽然已明确疱疹类病毒感染率与社会经济状,况的相关性，但目前国内有关经济发达与欠发达地,区儿童疱疹类病毒感染率比较的研究较少。本项目,选择磐安县和杭州市这两个浙江省内社会经济状况,有较大差异的地区，比较两地儿童疱疹类病毒的感,染率，可为浙江省经济不同地区儿童疱疹类病毒感,染的流行病学研究填补空白。,（2）、虽然已明确疱疹类病毒感染率与社会经济状况的相关性，但,9,、,项目预期成果,9、项目预期成果,（,1,）、建立通用引物扩增所有疱疹类病,毒的,PCR,技术，达到快速（,4,小时内完,成）、敏感（扩增产物拷贝数达,10,5,以,上）、重复性好的要求。,（1）、建立通用引物扩增所有疱疹类病毒的PCR技术，达到快速,（,2,）、建立扩增特异疱疹类病毒的,PCR,技术，在混合病毒感染时其通用引,物,PCR,相互间的扩增抑制率控制在,20%,以下。,（2）、建立扩增特异疱疹类病毒的PCR技术，在混合病毒感染时,（,3,）、建立疱疹类病毒的基因芯片诊断,技术，经,PCR,扩增产物与基因芯片杂交，,可区分何种疱疹类病毒感染，并进一步明,确系何亚型。,（3）、建立疱疹类病毒的基因芯片诊断技术，经PCR扩增产物与,（,4,）、,PCR-,基因芯片技术与传统,ELISA,方法进行临床应用比较，明确其敏感性、,特异性、假阳性率、假阴性率、似然比、,正确诊断指数。,（4）、PCR-基因芯片技术与传统ELISA方法进行临床应用,谢谢！,谢谢！,