微生物基因工程培训讲义课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物基因工程,李刚副教授,微生物基因工程,1,教学内容,一、,PCR,引物的设计与实验操作技巧；二、基因组文库的建立与筛选；三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中,的应用；四、原核表达系统的选择和高效表达策略；,五、真核表达系统的选择和高效表达策略。,教学内容一、PCR引物的设计与实验操作技巧；二、基因组文库,2,四、原核表达系统的选择和高效表达策略,原核生物表达系统主要包括：,大肠杆菌表达系统,、,枯草芽孢杆菌表达系统,、,链霉菌表达系统,等,其中应用最广泛的是大肠杆菌表达系统。,四、原核表达系统的选择和高效表达策略 原核生物表达系统,3,原核表达系统的优点,1,、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格 低廉；,2,、外源基因表达产物的水平高,(,如大肠杆菌中目的蛋白的表达量可超过细菌总蛋白量的,80%),；,3,、基因背景和表达特性清楚。,原核表达系统的优点1、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格,4,大肠杆菌表达系统,自,20,世纪,70,年代以来,大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尤其是进入后基因组时代以来,有关蛋白结构以及功能研究的开展,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择,。,大肠杆菌表达系统自20 世纪70 年代以来, 大肠杆菌一直是,5,大肠杆菌表达系统的优缺点,优点：,大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、,可以高效表达不同外源基因产物等特点,是许多外源基因,表达系统中最好的一种,是目前研究最深入、发展也最完善的表达系统,大量的有价值的多肽和蛋白质已在大肠杆菌中获得了超量表达。,缺点：,大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比,也具有一些缺,点,: ,高效表达易形成包涵体。不能进行翻译后的加工修饰,如糖基化、磷酸化及酰基化等。,大肠杆菌表达系统的优缺点优点：,6,大肠杆菌表达系统的操作流程,大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下： 获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测。,大肠杆菌表达系统的操作流程大肠杆菌表达系统操作的一般程序,7,大肠杆菌表达系统的基本概念,首先讲述一些大肠杆菌表达的基本概念：,一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株,，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者,Tag,检测等等。,选择表达系统通常要根据实验目的来考虑,，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。,主要归结在表达载体的选择上,。,表达载体,：我们关心的质粒上的元件包括,启动子,，,多克隆位点,，,终止密码,，,融合,Tag,（如果有的话），复制子，,筛选标记,/,报告基因,等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。,但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景,？,MCS,是否还是原来那个,MCS,？是我们要特别注意的。,大肠杆菌表达系统的基本概念首先讲述一些大肠杆菌表达的基本概念,8,大肠杆菌表达系统的基本概念,复制子：,通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。,pSC101,类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，,pCoE1,，,pMBI(pUC),类的复制子的拷贝数高达,500,以上，是表达载体常用的。,通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关,，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。,如果碰巧需要,2,个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。,筛选标记和报告基因：,氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记,，卡那霉素或者是新霉素次之，四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。,在表达筛选中要注意的问题应该就是,LB,倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。,今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢？,大家“随便倒掉”已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？,从以前的一针,50,万单位到现在,100,多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。,大肠杆菌表达系统的基本概念复制子：通常表达载体都会选用高拷贝,9,大肠杆菌表达系统的基本概念,对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。,绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了,（注意选择适用原核表达版本的,GFP,），其他还有,半乳糖苷酶,，,荧光素酶,等等。一些融合表达,Tag,也有报告基因的功能。启动子、终止子和核糖体结合位点：启动子：,启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一,。,从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。,lac,和,Tac,，,PL,和,PR,，,T7,是最常用的启动子。,转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用,控制转录的,RNA,长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，分别是,Rho,因子作用下使,mRNA,转录终止的终止子和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止,mRNA,转录的终止子。,常见的是,rrnB,、,rRNA,操纵子的,T1T2,串连转录终止子。,大肠杆菌表达系统的基本概念对于做表达来说，如果不是要研究启动,10,大肠杆菌表达系统的基本概念,核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，,其中能与,rRNA16S,亚基,3,端互补的,SD,序列对形成翻译起始复合物是必需的,，多数载体启动子下游都有,SD,序列，也有些载体没有，适合自带,SD,序列的基因表达，要留意。,大肠杆菌表达系统的基本概念核糖体结合位点：启动子下游从转录,11,大肠杆菌表达系统的几种表达方式,组成型表达：,表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如,pMAL,系统。,持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。,因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。,诱导调控型表达：,表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。,这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。,另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。,大肠杆菌表达系统的几种表达方式组成型表达：表达载体的启动子为,12,大肠杆菌表达系统的几种表达方式,融合表达,：,表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（,Tag,），表达产物为融合蛋白（有分,N,端或者,C,端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。,对于特别小的分子建议用较大的,Tag,（如,GST,）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小,Tag,以减少对目的蛋白的影响。,His-Tag,是最广泛采用的,Tag,。,分泌表达：,在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包涵体，而且表达产物通常是可溶的活性状态，不需要复性。,通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的,周质空间,。,可溶性表达,：,大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包涵体颗粒,，,包涵体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合,Tag,有助于提高产物的可溶性,，比如,Thio,，,pMAL,系统。,大肠杆菌表达系统的几种表达方式融合表达：表达载体的多克隆位点,13,提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略,大致有八种策略：,（,1,）在细胞中表达分子伴侣（天然或异源），辅助新生,肽链折叠，避免肽链相互聚合（例如,Takara,的,Chaperone plasmid Set,）；,（,2,）共表达折叠酶，催化共价键形成；,（,3,）通过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度，以降低有聚,合倾向的中间体的浓度；,（,4,）选择中等强度或低强度的启动子代替强启动子，降低重组蛋白的合,成速度；,（,5,）选择适合的宿主菌株；,（,6,）表达含可溶性多肽或信号肽的重组蛋白，提高可溶性；,（,7,）蛋白质的可溶性往往与自身的氨基酸序列有关，因此可利用诱突,技术改变其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；,（,8,）诱导过程中加入化学物质，以增加渗透压或改变培养基的,pH,值。,提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略大致有八种策略：,14,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子,最早应用于大肠杆菌表达系统的是,Lac,乳糖操纵子,，由 启动子,Plac,、操纵基因,lacO,和结构基因组成。其转录受,CAP,正调控和,lacI,负调控。,lacUV5,突变能够在没有,CAP,的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受,lacI,的调控，因而随后得到了更广泛采用。,lacI,产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因,lacO,上从而阻遏转录起始。,乳糖的类似物,IPTG,可以和,lacI,产物结合，使其构象改变离开,lacO,，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子最早应用于大肠杆菌表达系统,15,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子,tac,启动子,是,trp,启动子和,lacUV5,的拼接杂合启动子，且,转录水平更高,，比,lacUV5,更优越。,trc,启动子,是,trp,启动子和,lac,启动子的拼合启动子，,同样具有比,trp,更高的转录效率和受,lacI,阻遏蛋白调控的强启动子特性。,在常规的大肠杆菌中，,lacI,阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的,lac,操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，,能过量表达,lacI,阻遏蛋白的,lacIq,突变菌株常被选为,Lac/Tac/trc,表达系统的表达菌株,。,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子tac启动子是trp启动子,16,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子,现在的,Lac/Tac/trc,载体上通常还带有,lacIq,基因，以表达更多,lacI,阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。,IPTG,广泛用于诱导表达系统，但是,IPTG,有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替,IPTG,作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用,lacI,的温度敏感突变体，,30,度下抑制转录，,42,度开启转录。,热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且,热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定。,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子现在的Lac/Tac/tr,17,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子,以,噬菌体载体转录启动子,PL,、,PR,构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于,噬菌体,cI,基因产物。,cI,基因的温度敏感突变体,cI857(ts),常常被用于调控,PL,、,PR,启动子的转录。同样也是,30,度下阻遏启动子转录，,42,度下解除抑制开发转录。同样的，,PL,、,PR,表达载体需要携带,cI857(ts),菌株作为表达载体，现在更常见的做法是在载体上携带,cI857(ts),基因，所以可以有更大的宿主选择范围。,另外一种思路是通过严谨调控,cI,产物来间接调控,PL,、,PR,启动子的转录。比如,Invitrogen,的,PL,表达系统，就是将受,trp,启动子严谨调控的,cI,基因溶源化到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制,trp,启动子，抑制,cI,基因的表达，从而解除强大的,PL,启动子的抑制。,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子以噬菌体载体转录启动子P,18,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子,T7,启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流,，,这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以,Novagen,公司的,pET,系统为杰出代表。,强大的,T7,启动子完全专一受控于,T7 RNA,聚合酶，而,高活性的,T7 RNA,聚合酶合成,mRNA,的速度比大肠杆菌,RNA,聚合酶快,5,倍,当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过,T7,表达系统，,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白,；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的,50%,以上。由于大肠杆菌本身不含,T7RNA,聚合酶，需要将外源的,T7 RNA,聚合酶引入宿主菌，因而,T7 RNA,聚合酶的调控模式就决定了,T7,系统的调控模式,非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制,T7 RNA,聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子T7启动子是当今大肠杆菌表,19,常用的几种大肠杆菌表达系统,1,、,GE,（原安玛西亚）,-pGEX,系列，特点：使用该系列载体可以很方便进行下一步重组蛋白的纯化。,常用的几种大肠杆菌表达系统1、GE（原安玛西亚）-pGEX系,20,GE,（原安玛西亚）,-pGEX,系列,GE（原安玛西亚）-pGEX系列,21,Invitrogen-,Champion pET Expression System,等四个系列,比起其它公司的原核表达系列来说,Invitrogen,有个非常突出的地方就是它的重组克隆技术。像之前,Novagen,大部分载体都是用传统的酶切、链接方式做重组质粒，但是,Invitrogen,的表达系统大量运用了它的,TOPO,技术和,Gateway,技术。,Invitrogen,公司总共有四个原核表达系统,它们分别是：,Champion pET Expression System,、,HisPatch ThioFusion System,、,pBAD Inducible Bacterial System,、,pL System,和,T7-based Systems,。这四个系列的载体可谓把原核表达的发展史中出现过的几种启动子都囊括进去了，包括,T7,、,pL,、,pBAD,和,trc,启动子，同时几种经典的调控方式也都出现了，包括有乳糖操纵子、色氨酸操纵子和阿拉伯糖操纵子。,Champion pET Expression System,之所以取了个冠军系统的称号是因为它结合了经典的,T7,表达系统和,Invitrogen,的王牌定向,TOPO,技术,及,Gateway,技术，这可谓是强强联手。,Invitrogen- Champion pET Expr,22,微生物基因工程培训讲义课件,23,微生物基因工程培训讲义课件,24,Invitrogen pET100/D-TOPO,载体图谱,Invitrogen pET100/D-TOPO载体图谱,25,Novagen,公司,-pET,表达载体序列,Novagen,公司,（,Merck,的子公司）出品了多种原核表达载体系列，其中的,pET,系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统,，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。,pET,系列载体是利用大肠杆菌,T7,噬菌体转录系统进行表达的载体。,Novagen公司-pET表达载体序列Novagen公司（M,26,Novagen,公司的,pET,表达载体系列,pET Vectors with unique features include:,pET-31b(+) for high yield bioproduction of peptides and small proteins,pET-32a-c for production of soluble, active target proteins in,E. coli,pET-33b for production of target proteins suitable for site-specific 32P-labeling,pET-39b and 40b using Dsb tags for export and periplasmic folding of target proteins,pET-41a-c and 42a-c with popular GST fusion tags for enhanced production and solubility,pET-43.1a-c designed for cloning and high-level expression of polypeptide sequences fused with the 495 aa NusA (NusTag) protein,pET-44a-c with NusTag sequence plus N- and C-terminal HisTag sequences,pET-45b(+) with amino-terminal HisTag sequence and minimal extraneous sequences,pET-46 Ek/LIC prepared vector for ligation-independent cloning, with amino-terminal HisTag sequence,pET-47b(+) through pET-50b(+) with HRV 3C Protease cleavage site for efficient fusion tag removal,Additional vectors in this table include:,pLacI,pLysE and pLysS,Novagen公司的pET表达载体系列pET Vectors,27,Novagen,公司的,PET32a,表达载体图谱,Novagen公司的PET32a表达载体图谱,28,Novagen,公司的,pET,表达载体选择,从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，,Novagen,公司仅提供三个载体：,pET-21(+),，,pET-24(+),和,pET-23(+),。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。,根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：,1.,与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽,S,转移酶（,glutathione Stransferase, GST,）、硫氧还蛋白（,thioredoxin, Trx,）和,N,利用底物,A,蛋白（,N utilization substance A, NusA,）。,2.,转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，,DsbA,，,DsbC,。,3.,插入一个定位到周质空间的信号肽序列。,以上载体都是采用抗生素抗性筛选，如果你希望用蓝白斑筛选可以使用,pETBlue,系列载体。,在重组技术上，,Novagen,除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式,：,Ligation-Independent cloning,，简称,LIC,。采用,LIC,方法的,pET,载体是线性化的，在末端有,12-15,个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计,PCR,扩增引物时加入与,LIC,载体互补的序列，,PCR,产物用,35,的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入,LIC,载体上。,Novagen公司的pET表达载体选择从开始涉及表达的时候可,29,Novagen,公司的大肠杆菌菌株选择,Novagen,提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改造，它们大致分为以下几个种类：,1.,蛋白酶缺陷型,所有,B,菌株的衍生株都是,lon,蛋白酶和,ompT,蛋白酶缺陷型的,，这包括有,B834, BL21, BLR,Origami B, Rosetta,和,Tuner,。因此在纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。,BL21(DE3),是应用最多的表达的表达菌株,。,另外它的衍生株,BLR(DE3),是,recA,，,RecA,是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。它的缺失，可以保证质粒的稳定。,2.,保证所有细胞以同样量进行表达,Tuner,株及它的衍生株（,Origami B,和,Rosetta,）是,BL21,菌株的,lacY1,缺失突变型，,在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。,Lac,渗透酶的突变使进入每个细胞的,IPTG,量都是一致的，这样使蛋白表达浓度可以随着,IPTG,浓度而改变。,通过对,IPTG,浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。,一般说来，低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。,Novagen公司的大肠杆菌菌株选择Novagen提供多种表,30,Novagen,公司的大肠杆菌菌株选择,3.,二硫键形成与溶解性增强,二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而,Novagen,也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（,gor,）和,/,或硫氧还蛋白还原酶（,trxB,）缺陷型的，包括,AD494,，,BL21trxB,，,Origami,，,Origami B,和,Rosetta-gami,。在这些菌株中表达蛋白，,可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。,4.,稀有密码子的补给,不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。,Rosetta,是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子,tRNA,，包括,AUA,，,AGG,，,AGA,，,CUA,，,CCC,和,GGA,。它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。,Rosetta,系列是来自,BL21lacY1,，所以它具有,BL21lacY1,的所有特性。,5.,硒蛋氨酸标记,B834,是来源于,BL21,的蛋氨酸（,met,）营养缺陷型菌株。它在高度特异活性,35S-met,标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。,Novagen公司的大肠杆菌菌株选择3. 二硫键形成与溶解性,31,原核表达需要考虑的问题,在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑,3,大因素：,表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。,原核表达需要考虑的问题在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适,32,大肠杆菌表达系统的高效表达策略,1,、采用高强度启动子,-,如,T7,启动子；,2,、将目的基因所有密码子都换成大肠杆菌,偏好的密码子（需要重新合成基因），,或采用含有大肠杆菌稀有密码子,tRNA,的,Rosetta,系列菌株。,3,、采用丰富培养基（如,TB,）代替普通的,LB,培养,基；,4,、优化大肠杆菌的生长条件和目的基因的诱导表,达条件。,大肠杆菌表达系统的高效表达策略1、采用高强度启动子-如T7启,33,使用,pET,表达系统的常见问题分析,几个常见问题如下表：,使用pET表达系统的常见问题分析 几个常见问题如下表：,34,原核表达常见的几个问题及回答（,1,）,1,、目的蛋白总是以不可溶的形式出现。,解决办法：采用以下八种策略提高目的蛋白的可溶性。,原核表达常见的几个问题及回答（1）1、目的蛋白总是以不可溶的,35,提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略,大致有八种策略：,（,1,）在细胞中表达分子伴侣（天然或异源），辅助新生肽链折叠，避免,肽链相互聚合；,（,2,）共表达折叠酶，催化共价键形成；,（,3,）通过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度，以降低有聚,合倾向的中间体的浓度；,（,4,）选择中等强度或低强度的启动子代替强启动子，降低重组蛋白的合,成速度；,（,5,）选择适合的宿主菌株；,（,6,）表达含可溶性多肽或信号肽的重组蛋白，提高可溶性；,（,7,）蛋白质的可溶性往往与自身的氨基酸序列有关，因此可利用诱突,技术改变其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；,（,8,）诱导过程中加入化学物质，以增加渗透压或改变培养基的,pH,值。,提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略大致有八种策略：,36,原核表达常见的几个问题及回答（,2,）,2,、必须去除融合多肽或蛋白质标签才能使目的蛋白获得活性吗？,回答：大多数情况下目的蛋白带有,His- Tag,S-Tag,11,个氨基酸的,T7-Tag,或,HSV-Tag,等小肽时仍能表现出完全的活性。这些肽段都较为亲水，理论上都不会干扰蛋白的三维结构。我们建议首先测试蛋白活性，再看是否一定要去除前导序列才能适合特定的应用要求。,原核表达常见的几个问题及回答（2）2、必须去除融合多肽或蛋白,37,原核表达常见的几个问题及回答（,3,）,3,、如果目的蛋白包含信号序列，它会不会被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在？还是目的蛋白甚至可以被分泌到生长培养基中？,回答：如果目的蛋白包含,ompT,或,pelB,这样的前导序列，理论上它应该被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在。如果在生长培养基中发现目的蛋白的话，多半是因为细胞壁受到破坏，而并不代表蛋白是被分泌到培养基中的。除了信号肽对蛋白质的运输有影响，现在发现蛋白质的成熟区对蛋白质的运转也有影响。因此在细胞质、细胞周质及其它区域发现目的蛋白都很正常。某些情况下降低诱导时的培养温度至,25-30 ,，可能提高蛋白运输的比例。,原核表达常见的几个问题及回答（3）3、如果目的蛋白包含信号序,38,原核表达常见的几个问题及回答（,4,）,4,、,IPTG,诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？,回答：,T7RNA,聚合酶非常活跃，,T7,转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，,细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化,。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。,但也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体,/,宿主菌组合,(,比如含有,plysE,的宿主菌,),等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。,原核表达常见的几个问题及回答（4）4、IPTG诱导后细胞停止,39,原核表达常见的几个问题及回答（,5,）,5,、除了毒性和降解，还有些什么因素会影响目的蛋白的表达水平？,回答：,（,1,）,mRNA,转录子中的二级结构会干扰,AUG,翻译起始密码子和,/,或核糖体结合位点。所有,pET,载体的转录产物都是下列两种之一：,Rbs NdeI/NcoI,5AAGAAGGAGAUAUACAUAUG3,5AAGAAGGAGAUAUACCAUGG3,如果发现表达很差，你可以通过检查编码插入序列的链上的与上述序列互补的序列：,5-CATATGTATATCTCCTTCTT-3,或,5-CCATGGTATATCTCCTTCTT-3,以确定是否因为存在潜在的二级结构造成麻烦。,原核表达常见的几个问题及回答（5）5、除了毒性和降解，还有些,40,原核表达常见的几个问题及回答（,5,）,（,2,）目的基因中稀有密码子比较多也是常见的表达水平低的原因。,如果稀有密码子集中出现在氨基端情况更为严重。,应该注意，根据现有对大肠杆菌高表达的基因研究发现的有限的稀有密码子，已经观察到由于其对应的,tRNAs,水平很低，直接导致了翻译延伸的困难。,（,3,）,序列中的意外的终止密码子可能造成突变，这在,PCR,克隆产物的情况下较为突出。,可以通过测序发现此类问题，也可以用体外翻译的方法确认重组子的表达能力。,原核表达常见的几个问题及回答（5）（2）目的基因中稀有密码子,41,原核表达常见的几个问题及回答（,6,）,有时除了全长的目的蛋白以外，还能看到截短的产物，这时怎么回事？,回答：,一个最直接原因就是蛋白水解了。然而第二点翻译起始也非常有可能。,起始密码子,AUG,（,Met,）的上游在,RNA,编码区有类似于核糖体结合位点序列（,AAGGAGG,）的间隔序列（通常是,5-13,个核苷酸）时，容易出现这种问题。截短蛋白在纯化全长蛋白的操作时往往造成麻烦。,解决途径之一即是选用两端都带有融合标签的,pET,载体,，例如,pET28,和,pET30,序列载体。这样，全长蛋白就可以通过提高咪唑浓度，在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。另外,pET29,和,pET30,系列载体在,N,端融合有,S-Tag,，而,C,端有,His-Tag,，因此可以先后用固定化,S-,蛋白和,His Binding,树脂亲和纯化以获取全长蛋白。,原核表达常见的几个问题及回答（6）有时除了全长的目的蛋白以外,42,重组质粒和菌株的保存建议,在实验室里保存重组菌株的时候，为了挑菌和传代方便，我们常用,LB,平板保存在,4,冰箱中，需要提质粒和表达接种的时候，就直接从平板上挑菌，但是这种方法对于重组质粒的稳定性不利，容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。 我们建议：,1,、 长期存放菌株和,pET,重组子应该在菌液中加入甘油并放置于,70,保种。但是要注意高浓度甘油,( 10%),会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度为,8,左右。（,15%,浓度的甘油保种液和新鲜菌液,1:1,就行）,2,、重组质粒不宜长期保存于表达菌株（带,DE3,的大肠杆菌）中，请尽量使用带有,recA endA,突变的克隆菌株（比如,C600,，,DH5a,）进行质粒抽提和保存质粒。表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题。特别是在大量抽提过程中。,重组质粒和菌株的保存建议在实验室里保存重组,43,thank you!,thank you!,44,1,、想要体面生活，又觉得打拼辛苦；想要健康身体，又无法坚持运动。人最失败的，莫过于对自己不负责任，连答应自己的事都办不到，又何必抱怨这个世界都和你作对？人生的道理很简单，你想要什么，就去付出足够的努力。,2,、时间是最公平的，活一天就拥有,24,小时，差别只是珍惜。你若不相信努力和时光，时光一定第一个辜负你。有梦想就立刻行动，因为现在过的每一天，都是余生中最年轻的一天。,3,、无论正在经历什么，都请不要轻言放弃，因为从来没有一种坚持会被辜负。谁的人生不是荆棘前行，生活从来不会一蹴而就，也不会永远安稳，只要努力，就能做独一无二平凡可贵的自己。,4,、努力本就是年轻人应有的状态，是件充实且美好的事，可一旦有了表演的成分，就会显得廉价，努力，不该是为了朋友圈多获得几个赞，不该是每次长篇赘述后的自我感动，它是一件平凡而自然而然的事，最佳的努力不过是：但行好事，莫问前程。愿努力，成就更好的你！,5,、付出努力却没能实现的梦想，爱了很久却没能在一起的人，活得用力却平淡寂寞的青春，遗憾是每一次小的挫折，它磨去最初柔软的心智、让我们懂得累积时间的力量；那些孤独沉寂的时光，让我们学会守候内心的平和与坚定。那些脆弱的不完美，都会在努力和坚持下，改变模样。,6,、人生中总会有一段艰难的路，需要自己独自走完，没人帮助，没人陪伴，不必畏惧，昂头走过去就是了，经历所有的挫折与磨难，你会发现，自己远比想象中要强大得多。多走弯路，才会找到捷径，经历也是人生，修炼一颗强大的内心，做更好的自己！,7,、“一定要成功”这种内在的推动力是我们生命中最神奇最有趣的东西。一个人要做成大事，绝不能缺少这种力量，因为这种力量能够驱动人不停地提高自己的能力。一个人只有先在心里肯定自己，相信自己，才能成就自己！,8,、人生的旅途中，最清晰的脚印，往往印在最泥泞的路上，所以，别畏惧暂时的困顿，即使无人鼓掌，也要全情投入，优雅坚持。真正改变命运的，并不是等来的机遇，而是我们的态度。,9,、这世上没有所谓的天才，也没有不劳而获的回报，你所看到的每个光鲜人物，其背后都付出了令人震惊的努力。请相信，你的潜力还远远没有爆发出来，不要给自己的人生设限，你自以为的极限，只是别人的起点。写给渴望突破瓶颈、实现快速跨越的你。,10,、生活中，有人给予帮助，那是幸运，没人给予帮助，那是命运。我们要学会在幸运青睐自己的时候学会感恩，在命运磨练自己的时候学会坚韧。这既是对自己的尊重，也是对自己的负责。,11,、失败不可怕，可怕的是从来没有努力过，还怡然自得地安慰自己，连一点点的懊悔都被麻木所掩盖下去。不能怕，没什么比自己背叛自己更可怕。,12,、跌倒了，一定要爬起来。不爬起来，别人会看不起你，你自己也会失去机会。在人前微笑，在人后落泪，可这是每个人都要学会的成长。,13,、要相信，这个世界上永远能够依靠的只有你自己。所以，管别人怎么看，坚持自己的坚持，直到坚持不下去为止。,14,、也许你想要的未来在别人眼里不值一提，也许你已经很努力了可还是有人不满意，也许你的理想离你的距离从来没有拉近过,.,但请你继续向前走，因为别人看不到你的努力，你却始终看得见自己。,15,、所有的辉煌和伟大，一定伴随着挫折和跌倒；所有的风光背后，一定都是一串串揉和着泪水和汗水的脚印。,16,、成功的反义词不是失败，而是从未行动。有一天你总会明白，遗憾比失败更让你难以面对。,17,、没有一件事情可以一下子把你打垮，也不会有一件事情可以让你一步登天，慢慢走，慢慢看，生命是一个慢慢累积的过程。,18,、努力也许不等于成功，可是那段追逐梦想的努力，会让你找到一个更好的自己，一个沉默努力充实安静的自己。,19,、你相信梦想，梦想才会相信你。有一种落差是，你配不上自己的野心，也辜负了所受的苦难。,20,、生活不会按你想要的方式进行，它会给你一段时间，让你孤独、迷茫又沉默忧郁。但如果靠这段时间跟自己独处，多看一本书，去做可以做的事，放下过去的人，等你度过低潮，那些独处的时光必定能照亮你的路，也是这些不堪陪你成熟。所以，现在没那么糟，看似生活对你的亏欠，其实都是祝愿。,1、想要体面生活，又觉得打拼辛苦；想要健康身体，又无法坚,45,微生物基因工程培训讲义课件,46,