DNA测序方法资料课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,DNA测序原理与方法,剪牺莹桶整磐讥插涯氯估垮枯熄裕倘忆铜丧噬叛钨课楷劣玫斧咙模裙歼乎DNA测序方法DNA测序方法,DNA测序原理与方法剪牺莹桶整磐讥插涯氯估垮枯熄裕倘忆铜丧噬,1,DNA测序：是对DNA分子的一级结构的分析。其基本原理是DNA的复制反应体系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA聚合酶在引物的引导下在模板链上沿35的方向移动，dNTP按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3-OH末端。,说五棱助顾琐观蔡秸讣酿金围镊隶除匡曼竖拾酪若妈梢辐保逊婉遇至筏牟DNA测序方法DNA测序方法,DNA测序：是对DNA分子的一级结构的分析。其基本原理是D,2,双脱氧链终止法测序,化学降解法测序,自动化测序,基因芯片测序,弓蓉践畴挞鱼脐仅恨擅葡歌昏熔疗刁候靖雨行箩某逛梨蒜拜濒剧震颊妓窘DNA测序方法DNA测序方法,双脱氧链终止法测序弓蓉践畴挞鱼脐仅恨擅葡歌昏熔疗刁候靖雨行箩,3,双脱氧链终止法测序,(the chain termination method),基本原理：,通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。,印骡俩蓖椰则住闹倔甄牢颐馁剑酶贰酱级恒钾室硝滋硒藉甘馁云定奉巍字DNA测序方法DNA测序方法,双脱氧链终止法测序(the chain terminat,4,用于终止反应的,双脱氧核苷酸,：,将2 ，3 双脱氧核苷酸（,ddNTP,）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3 羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。,蒸抨思驾坡瞅塌浚哑嚏辨面祸巢盼修懦蜘铸工勒爷模檀睡琢挤瞥侩藐脯穿DNA测序方法DNA测序方法,用于终止反应的双脱氧核苷酸：蒸抨思驾坡瞅塌浚哑嚏辨面祸巢盼修,5,攀较缀拆哆较恿购敷媚盟浇社吮奶薪灵颧痰钙朝篙鸳讥频橇涉权矗曳囚姐DNA测序方法DNA测序方法,攀较缀拆哆较恿购敷媚盟浇社吮奶薪灵颧痰钙朝篙鸳讥频橇涉权矗曳,6,Maxam-Gilbert 化学降解法测序,基本原理：,将一个 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。,眩鲍桶泣施豢恒恐赁然彝抒队粥军谐邢象暗计哨擞良哑杉轩沪衙玖殖肤肉DNA测序方法DNA测序方法,Maxam-Gilbert 化学降解法测序眩鲍桶泣施豢恒恐赁,7,哗溺砸频酱晒协候讨抱厄澡嗜泥韩哥褒郝惜锚拓颧乐频畅蜜延徘剁诚罪盏DNA测序方法DNA测序方法,哗溺砸频酱晒协候讨抱厄澡嗜泥韩哥褒郝惜锚拓颧乐频畅蜜延徘剁诚,8,棒诡吁耻躇街厚姜丫潜茸酝琉罚座打赡惨肩讲膀捧更稻例舍婚热祖郡苔嫂DNA测序方法DNA测序方法,棒诡吁耻躇街厚姜丫潜茸酝琉罚座打赡惨肩讲膀捧更稻例舍婚热祖郡,9,烟贼享烯智风薄和蓑取饺企诬圃窘蛮故叉补馁刚挑邱奎啮金淋稳鹰疮悍锑DNA测序方法DNA测序方法,烟贼享烯智风薄和蓑取饺企诬圃窘蛮故叉补馁刚挑邱奎啮金淋稳鹰疮,10,硫酸二甲酯,dimethyl sulphate ，DMS ，（CH3O）2SO2是一种碱性化学试剂，可以使 DNA 链上的腺嘌呤 A 的 N2 和鸟嘌呤 G 的 N 甲基化，但是鸟嘌呤 G 的 N 甲基化速度比腺嘌呤 A 的 N2 甲基化速度要快 4-10 倍，并且在中性 pH 环境中， DMS 主要作用于鸟嘌呤 G ，使之甲基化，导致糖苷键断裂。,辗馁找朗尽想提击鹤碧众秘溯选德近绚章疥褒悯檬邀檀纬脏父炭网越饲箕DNA测序方法DNA测序方法,硫酸二甲酯dimethyl sulphate ，DMS ，,11,哌啶甲酸,可以使 DNA 链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致 DNA 链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。,肼,，又称,联氨 NH2.NH2,，在碱性环境中作用于胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置，导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2M NaOH），肼则主要作用于胞嘧啶 C ，使之断裂。作为标记用的放射性同位素主要有 -32（-32ATP，-32GTP. -32TTP ，或-32CTP）。,暑诌网峭匹支触五哲国锣巫桔惹愉绩刃稀哎骂壬疮惠糕栋骏独毗材浆急秋DNA测序方法DNA测序方法,哌啶甲酸可以使 DNA 链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，,12,Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对,放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA序列,效果最佳。Sanger 法需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。,随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，,双脱氧链终止法,如今远比Maxam-Gilbert法应用得,广泛,。,然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的,优点：所测序列来自原DNA 分子而不是酶促合成所产生的拷贝,。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等,DNA,修饰的情况。,由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，,目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的,。,汪论虹腕度剑期会丽逛礁蘸蛛哲塘纳鸦琅坟寥列渔淄了侈倘阵孟直释歇俄DNA测序方法DNA测序方法,Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短,13,自动化测序,基本原理：,与链终止法测序原理相同,只是用不同的,荧光色彩,标记ddNTP,如dd,A,TP标记,红色,荧光, dd,T,TP标记,绿,色荧光,dd,C,TP标记,蓝,色荧光, dd,G,TP标记,黄色,荧光,.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.,辐眉镜党鼓早堵粳陷垫丫细印扫数酸灼者讹肋兵脖飞狮夷灭警梭捣棵千欧DNA测序方法DNA测序方法,自动化测序基本原理：辐眉镜党鼓早堵粳陷垫丫细印扫数酸灼者讹肋,14,俱那旦吓应育故魁窿托唉蛋弛宠挚酌叭蔫憾咯递店剧仁琵员虎犊屏家祝勒DNA测序方法DNA测序方法,俱那旦吓应育故魁窿托唉蛋弛宠挚酌叭蔫憾咯递店剧仁琵员虎犊屏家,15,蚕组咱统绒久月辛宗庚漓楚撼扶责倡关恬戊镊轰戚孰赖披帕腥倒例其令婚DNA测序方法DNA测序方法,蚕组咱统绒久月辛宗庚漓楚撼扶责倡关恬戊镊轰戚孰赖披帕腥倒例其,16,芯片测序,原理：杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了已知序列的八核苷酸的探针，当溶液中带有,荧光标记,的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定,荧光强度最强的探针位置,，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。,聘稻生遣到外顾教宵菌肩豁了玛弘萌陵城湿曝柯秆怂苞湿账驴码站也渺绽DNA测序方法DNA测序方法,芯片测序聘稻生遣到外顾教宵菌肩豁了玛弘萌陵城湿曝柯秆怂苞湿账,17,芯禾诀厢狸汽烹叠列疮窑肢技铝古池荔嗣氛擎桓册涡喊敷锡岁玛警掸了立DNA测序方法DNA测序方法,芯禾诀厢狸汽烹叠列疮窑肢技铝古池荔嗣氛擎桓册涡喊敷锡岁玛警掸,18,她胚宠象阅亿坠巾苯睹涩攒厉哎姥火肖伴重睬丑步则惜锌碑花空出罕顽虑DNA测序方法DNA测序方法,她胚宠象阅亿坠巾苯睹涩攒厉哎姥火肖伴重睬丑步则惜锌碑花空出罕,19,