军团菌的分离培养与鉴定课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,军团菌的分离培养与鉴定,福建省疾病预防控制中心,原灵,2009,年,6,月,3,日,军团菌的分离培养与鉴定 福建省疾病预防控制中心,军团菌,革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径,0.3,0.5m,，长约,1.2,5m,或更长，菌体一端有鞭毛,.,在含,L,-,半胱氨酸和焦磷酸铁的,BCYE,琼脂培养基上生长，通常需要在,37,5%,CO2,培养箱,培养,2-10,天。,生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。,初步在,BCYE,琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样，具有多型性,.,军团菌革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，,军团菌,军团菌,军团菌,军团菌电镜图片,军团菌军团菌电镜图片,军团菌科、属、种、血清型,军团菌科,(Legionellaceae,）,Legionella/Fluoribacter bozemanii/Tatlockia micdadei,军团菌属：,16s rRNA,分析表明，在蛋白细菌系,亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起,Q,热病的,coxiella burneti(,贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。,军团菌种,：现已发现,50,个种（,species,），,70,多个血清型（,serogroups),，至少有,20,个种可引起人感染。,军团菌科、属、种、血清型军团菌科(Legionellace,种名,发现时间,种名,发现时间,种名,发现时间,Legionella pneumophila,1979,Legionella,maceachernii,1985,Legionella,geestiana,1993,Legionella,bozemanae,1980,Legionella,parisiensis,1985,Legionella,londiniensis,1993,Legionella,dumoffii,1980,Legionella,rubrilucens,1985,Legionella,nautarum,1993,Legionella,gormanii,1980,Legionella,santicrucis,1985,Legionella,quateirensis,1993,Legionella,micdadei,1980,Legionella,spiritensis,1985,Legionella,worsleiensis,1993,Legionella,pittsburghensis,1980,Legionella,steigerwaltii,1985,Legionella,lansingensis,1994,Legionella,jordanis,1982,Legionella,israelensis,1986,Legionella,lytica,1996,Legionella,longbeachae,1982,Legionella,birminghamensis,1988,Legionella,waltersii,1996,Legionella,oakridgensis,1983,Legionella,brunensis,1989,Legionella,taurinensis,1999,Legionella wadsworthii,1983,Legionella cincinnatiensis,1989,Legionella,beliardensis,2001,Legionella feeleii,1984,Legionella moravica,1989,Legionella,drozanskii,2001,Legionella sainthelensi,1984,Legionella quinlivanii,1990,Legionella,fallonii,2001,Legionella anisa,1985,Legionella tucsonensis,1990,Legionella,gresilensis,2001,Legionella cherrii,1985,Legionella adelaidensis,1991,Legionella,rowbothamii,2001,Legionella erythra,1985,Legionella fairfieldensis,1991,Legionella,busanensis,2003,Legionella hackeliae,1985,Legionella gratiana,1991,Legionella,drancourtii,2004,Legionella jamestowniensis,1985,Legionella shakespearei,1992,军团菌种,种名发现时间 种名发现时间 种名发现时间 Legionell,Species,No.of serogroups,No.associated with disease,1.,L.pneumophila,15,15,2.,L.bozemanii,2,2,3.,L.dumoffii,1,1,4.,L.micdadei,1,1,5.,L.longbeachae,2,2,6.,L.jordanis,1,1,7.,L.wadsworthii,1,1,8.,L.hackeliae,2,2,9.,L.feeleii,2,2,10.,L.maceachernii,1,1,11.,L.birminghamensis,1,1,12.,L.cincinnatiensis,1,1,13.,L.gormanii,1,1,14.,L.sainthelensi,2,2,15.,L.tucsonensis,1,1,16.,L.anisa,1,1,17.,L.lansingensis,1,1,18.,L.erythra,2,1,19.,L.parisiensis,1,1,20.,L.oakridgensis,1,1,20,个种的军团菌可引起人疾病,SpeciesNo.of serogroupsNo.as,军团菌操作生物安全性,应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。,生物安全,级实验室，最好在安全柜中操作。,操作人员培训。,菌种保存。,军团菌操作生物安全性应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定,病原菌名称,危害程度分类,实验活动所需生物安全实验室级别,运输包装分类,学名,中文名,大量活菌操作,动物感染实验,样本,检测,非感染性材料实验,A/B,UN,编号,Legionella pneumophila,嗜肺军团菌,第三类,BSL-2,ABSL-2,BSL-2,BSL-1,B,UN 3373,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定,样本的采集和运输,（一）标本的种类,（二）标本的运输和相关生物安全要求,样本的采集和运输（一）标本的种类,标本的种类,环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水,加湿器水；,病人组织标本,:,如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。,1983,年新疆从一瘫患羔羊后肢中分离到军团菌。,标本的种类 环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋,标本的运输和相关生物安全要求,在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下,(21,+,3),贮藏在实验室或其他地方。,对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在,-20,冻存备用。,标本的运输和相关生物安全要求在周围环境温度下运送水样标本,不,水样标本中军团菌的分离方法,检测依据,:,1,、,ISO-11731,水质军团菌检测,2,、,公共场所集中空调通风系统,卫生规范,中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录,A,。,适用于各种环境标本军团菌检测，包括：饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀物、软泥等物质。,水样标本中军团菌的分离方法检测依据:1、IS,军团菌水质检测概括,采样,浓缩,培养,分离,鉴定,军团菌水质检测概括采样,军团菌检测所需准备基本试剂,培养基（,GVPC,，,BCYE,BCYE-CYS),试剂,(,生化试剂、甲醛的盐溶液）,酸缓冲液（,0.2mol/L KCL-HCL),，碱缓冲液（,0.03mol/L KOH,）,血清学试剂,军团菌检测所需准备基本试剂培养基（GVPC，BCYE,BCY,标本浓缩所需准备仪器设备,过滤,滤器及漏斗，过滤装置需能够承受高压。,正压膜蠕动过滤泵，能够控制流速。,尼龙或聚碳酸酯滤膜,硅胶管,离心机,离心力能够达到（,6000100,）,g,要有安全盖。,漩涡振荡器,转速至少能够达到（,2005,）,r/min,。,标本浓缩所需准备仪器设备过滤,培养检测所需准备材料,直径大约为,90mm,或,100mm,的无菌培养皿,培养箱，,CO,2,能够恒温保持在（,361,）。,水浴箱，能够保持在（,501,）,显微镜或荧光显微镜。,培养检测所需准备材料直径大约为90mm或100mm的无菌培养,样品采样准备材料,玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一般采集为,250-500ml,，收集在容器瓶中。,如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于,70,）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于,5,分钟。,小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。,广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。,灭菌棉拭子。,一般建议用塑料包装的容器,样品采样准备材料玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一,采样,后,样品,处理,方法与步骤,样品处理,1.,沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或,1000r/min,离心,1min,去除。,2.,过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径,0.22,0.45m,滤膜过滤，取下滤膜置于,15ml,灭菌水中，充分洗脱，备用。,3.,热处理：取,1ml,洗脱样品置,50,水浴加热,30min,。,4.,酸处理：取,5ml,洗脱样品，调,pH,至,2.2,，轻轻摇匀，放置,5min,。,采样后样品处理方法与步骤,ISO-11731,水质军团菌检测,浓缩标本酸处理,酸缓冲液：仔细地量取,17.4ml,浓盐酸加到,1L,蒸馏水中，配成,0.2mol/L,的盐酸缓冲液；称,14.9gKCl,加到,1L,蒸馏水中，配成,0.2mol/L,的,KCl,溶液。将,3.9ml 0.2mol/L,的盐酸溶液和,25ml 0.2mol/L,的,KCl,溶液混合，用,1mol/L,的,KOH,溶液调,pH,至,2.20.2,，装在一个带塞的玻璃瓶内，于室温暗处贮存，不要超过,1,个月。,将,1,10ml,样品（浓缩或未浓缩的）放入带有螺旋帽的容器中，再将其,6000g,离心,10min,或,3000g,离心,30min,。,用无菌吸管吸取上清，使体积变为原来的一半。用振荡器或用力混合，使沉淀重悬。,加入酸缓冲液使体积和原来相同,并轻晃摇匀静置,5min,。,ISO-11731水质军团菌检测浓缩标本酸处理酸缓冲液：,样品浓缩,离心,过滤,接种,酸处理 热处理,样品浓缩离心接种酸处理 热处理,水样的正压膜过滤法,安放滤膜；,过滤；,取膜；,洗膜。,水样的正压膜过滤法安放滤膜；,水样的离心,将,200ml,左右样品倒入容积为,300,500ml,的无菌离心瓶中；,6000g,离心,10min,，或者,3000g,离心,30min,，离心温度在,15,25,之间；,无菌操作去除上清；,用,5,20ml,溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。,水样的离心将200ml左右样品倒入容积为300500ml的,水样浓缩物的贮存,最好对样品立刻进行分析；,标本于（,62,）储藏最多不超过,14,天。,对于军团菌来说，如果储藏于,0,6,，这种损失是最明显的。而且，温度在,20,或,20,以上时，异养生物的生长速度就会变快。,水样浓缩物的贮存最好对样品立刻进行分析；,浓缩标本热处理,向无菌容器中放入（,10.5,）,ml,（浓缩或未浓缩）的标本。,在（,501,）水浴中放置（,302,）,min,。,浓缩标本热处理,军团菌培养基,Muller-Hinton,琼脂,第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基,活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵母抽提物替代,CYE,琼脂,CYE,琼脂加入,-,酮戊二酸,BCYE,琼脂,BCYE,琼脂中含有选择性抗生素,GVPC,琼脂,军团菌培养基Muller-Hinton琼脂第一次分离出嗜肺军,军团菌培养基,军团菌培养基,酵母浸出物（细菌级）,10.0g,琼脂,12.0g,活性炭,2.0g,-,酮戊二酸,1.0g,ACES (2-,乙酰基,-2-,氨基乙烷磺酸,)10.0g,KOH,（颗粒型）,2.8g,L,-,半胱氨酸盐酸盐,0.6g,焦磷酸铁,0.4g,蒸馏水 补充至,1000ml,BCYE,培养基,酵母浸出物（细菌级）,L,-,半胱氨酸和焦磷酸铁溶液,称取,0.6g,L,-,半胱氨酸盐酸盐和,0.4g,焦磷酸铁分别溶解于,10ml,蒸馏水中，制备新鲜的,L,-,半胱氨酸盐酸盐溶液和焦磷酸铁溶液。,分别通过,0.22m,的滤膜过滤除菌。贮存于无菌容器中，,-20,左右储存不得超过三个月。,L-半胱氨酸和焦磷酸铁溶液称取0.6g L-半胱氨酸盐酸盐和,BCYE-,培养基配制,将颗粒状,ACES,放入,500ml,蒸馏水中溶解。量取,480ml,蒸馏水，加入全部,2.8gKOH,颗粒，轻摇至溶解。将以上两种溶液混合，制成,ACES,缓冲液,用,0.1mol/L KOH,和,0.1mol/L HCl,溶液调节,PH,至,6.9-7.0,ACES,缓冲液中加入活性炭、酵母浸出物、,-,酮戊二酸。摇匀。,加入琼脂，微波稍化后，,121,高压,15min,。,高压后，室温或水浴中冷却至,50,左右。,在无菌条件下加入,L-,半胱氨酸溶液和焦磷酸铁溶液。,按,20ml,量倒入直径为,90,100mm,的平板中，培养基的最终,pH,值大约为,6.9,左右。,待平板中的湿气干燥后，,4,左右储存于闭光的密闭容器中，最多可储存,4,周。,BCYE-培养基配制将颗粒状ACES放入500ml蒸馏水中,GVPC,选择性培养基,BCYE-,琼脂培养基中添加下列抗生素,万古霉素,0.001g/L,多粘菌素,B,80000iu/L,放线菌酮,0.08g/L,无胺甘氨酸,3g/L,GVPC选择性培养基BCYE-琼脂培养基中添加下列抗生素,BCYE-Cys,培养基,为不含,L-,半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。按照配制,BCYE,培养基的方法配制，不加,L-,半胱氨酸。,BCYE-Cys培养基 为不含L-半胱氨酸的酵母浸出,标本,肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物,水源,血清,处理与制备,水样处理与制备,血清学检测方法：,*间接荧光抗体染色法,*试管凝集试验,*微量凝集试验（参考）,*,DOT-ELISA,法,*间接血凝试验（参考）,*,ELISA,法,接种军团菌,BCYE,培养基,接种军团菌选择性,GVPC,培养基,37,，,5%CO,2,，培养,3-14,天,挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检,37,5%CO,2,培养,3-14,天,革兰氏染色阴性杆菌,革兰氏染色阳性杆菌,纯培养,弃去,确认试验,血清玻片凝集试验,PCR,检测,生化试验,标本肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物水源血清,选择培养基的接种,一个,GVPC,培养基平板上可以接种,0.1,0.5ml(,浓缩或未浓缩,),未经处理的样品。,用无菌的涂抹器将液体均匀的涂抹在培养基表面。,用同样的方法尽可能快地将经过热处理的,0.1,0.5ml,标本接种在另外一块,GVPC,培养基平板上。,再用同样的方法尽可能快地将经过酸处理的,0.1,0.5ml,标本接种到第三块,GVPC,培养基平板上。,选择培养基的接种一个GVPC培养基平板上可以接种0.10.,500,ml,水样,过滤浓缩法,将,500ml,水样于,0.22um,滤膜过滤然后放于,5ml,无菌水中超声波振动,3,分钟,=,浓缩样本,或,高速离心浓缩法,将,200ml,水样置于离心机,6000g,离心,10,分钟，,15-25,=,浓缩样本,直接涂布法,于,GVPC,（,2,个平板）上分别涂布,0.2ml,原液用,PBS,缓冲液,0.01mol/L,（,PH7.2,）稀释,1,：,10,的样本,酸处理法,2ml,浓缩液,+2ml,酸缓冲液（,PH2.0,）摇匀,50.5,分钟,热处理法,2ml,浓缩液于,501,水浴,301,分钟,直接涂布法,于,GVPC,平板上涂布,0.1ml,浓缩液，用,PBS,缓冲液稀释,1,：,10,的样本,涂布：,0.2ml,于,GVPC,平板,涂布：,0.2ml,于,GVPC,平板,孵育、平板观察及确认,500ml水样过滤浓缩法或高速离心浓缩法直接涂布法酸处理法热,接种标本培养,接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（,361,）培养,7-10,天。,为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子。在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）。,在含,2.5-5.0%CO2,的环境下培养有利于军团菌的生长。,接种标本培养接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平,孵育,6,个,GVPC,平板,/,每份样本,37,，,5%CO2,，培养,3-10,天,菌落验证：从每一个平皿上挑取,2,个可疑菌落，接种血平板,及接种,BCYE,和,L,半光氨酸缺失的,BCYE,琼脂平板，,3537,培养,2,天，凡在,BCYE,琼脂平板上生长,而在,L,半光氨酸缺失的,BCYE,琼脂平板及血平板不生长的则为军团菌菌落。,孵育6个GVPC平板/每份样本 菌落验证：从每,平板的检查,观察结果：,在,3-10,天的培养期间内，每,2,4,天至少观察,3,次，因为,军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖。,平板的检查观察结果：在3-10天的培养期间内，每24天至少,军团菌菌落特点（,1,）,军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色。,一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。,在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光。,军团菌菌落特点（1）军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰,军团菌菌落特点（,2,）,嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅黄色。,为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定时间。,值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别。,军团菌菌落特点（2）嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅,军团菌菌落特点,军团菌菌落特点,可疑军团菌菌落的进一步鉴定,BCYE,或其他培养基上传代培养,革兰染色镜检,生化鉴定,PCR,检测军团菌特异性基因片段,免疫荧光的方法确定军团菌的种类,可疑军团菌菌落的进一步鉴定BCYE或其他培养基上传代培养,BCYE,或其他培养基上传代培养（,1,）,至少从每块,GVPC,平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在,BCYE,和,BCYE-Cys,培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。,在（,361,）至少培养两天。,凡是在,BCYE,培养基上生长而在,BCYE-Cys,培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌。,BCYE或其他培养基上传代培养（1）至少从每块GVPC平板上,BCYE,或其他培养基上传代培养（,2,）,营养琼脂或血琼脂培养基可以代替,BCYE-Cys,培养基。如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养。,橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要,L-,半胱氨酸和铁离子，但随后在,L-,半胱氨酸缺失时生长微弱。,BCYE或其他培养基上传代培养（2）营养琼脂或血琼脂培养基可,BCYE,培养基上传代培养,BCYE培养基上传代培养,革兰染色镜检,军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径,0.3,0.5m,，长约,1.2,5m,或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。,短杆状,长丝状,革兰染色镜检军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.3,军团菌生化鉴定,军团菌生化特性,生化试验,结果,触酶,/,弱,+,氧化酶,-/+,硝酸盐还原,-,尿素酶,-,明胶液化,+,水解马尿酸,+,淀粉水解,弱,+,军团菌生化鉴定 军团菌生化特性生化试验结果触酶/弱+氧,尿素酶试验,阴性：培养基不变色,阳性：培养基由黄色变为红色,尿素酶试验阴性：培养基不变色,硝酸盐还原试验,阴性：无红色出现,阳性：呈现红色,进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。,-,萘胺具有致,癌性、故使用时应加注意。,硝酸盐还原试验阴性：无红色出现,明胶液化试验,将待试菌培养物穿刺接种于明胶高层约,2/3,深度。于,361,2.5-5.0%CO,2,培养,2-3,天后将培养基置于,4 30,分钟，取出观察。,阴性：凝固,阳性：不凝固,明胶液化试验 将待试菌培养物穿刺接种于明胶高层约,马尿酸水解试验,将待鉴定菌株，于,0.4mL,马尿酸钠溶液中，制成浓厚菌悬液，于,361,水浴培养,2h,后，沿管壁加入,3.5,水合印三酮试剂，形成两层，如果产生蓝紫色至深紫色，为阳性反应。,阳性,阴性,马尿酸水解试验将待鉴定菌株，于0.4mL马尿酸钠溶液中，制成,氧化酶试验,阴性,阳性,氧化酶试验阴性阳性,触酶试验,取细菌至载玻片上涂抹，加,1-2,滴,3%,过氧化氢水溶液。若会迅速冒出气泡，则表示此细菌含有触酶，属于阳性反应。,触酶试验取细菌至载玻片上涂抹，加1-2滴3%过氧化氢水溶液。,淀粉酶水解试验,阳性反应：（淀粉被分解）琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培,养物周围出现无色透明环,阴性反应：菌落周围无透明环,淀粉酶水解试验阳性反应：（淀粉被分解）琼脂培养基呈深蓝色、菌,确定军团菌的种型,Oxoid,的乳胶试剂盒可以鉴定出：,嗜肺军团菌血清,1,型,;,嗜肺军团菌血清,2-14,混合型；,L.longbeachae1,和,2,型，,L.bozemanii1,和,2,型，,L.,dumoffii,，,L.gormanii,，,L.jordanis,，,L.micdadei,，,L.anisa,混合型。,确定军团菌的种型 Oxoid 的乳胶试剂盒可以鉴定出：,确定军团菌的种型,-1,在进行鉴定试验前，要保证在,BCYE,培养基上生长的菌落是经过形态学检查的纯菌。,属的鉴定，,16sRNA,。,确定军团菌的种型-1在进行鉴定试验前，要保证在BCYE培养基,嗜肺军团菌的确定,应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。有条件的可做嗜肺军团菌特异的,PCR,检测。,生化培养：氧化酶（,/,弱,+,），硝酸盐还原，尿素酶，明胶液化，水解马尿酸,淀粉酶水解弱,+,血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。,PCR,：,mip,dnaJ,嗜肺军团菌的确定 应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团,军团菌血清鉴定,日本生研所,Lp1-6,Lb,Lg,Lm,Ll,军团菌血清鉴定日本生研所Lp1-6,Lb,Lg,Lm,Ll,结果表述,为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（,CFU/ml,），从三块,GVPC,平板培养基中挑选出已确定军团菌生长最多的平板。根据浓缩倍数推算出原始水样中的细菌数。,计算三个,GVPC,平板培养基上菌落生长的平均数是不适宜的，因为这是不能累加的。,结果表述为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（CFU/ml）,检验报告,实验报告应包括以下信息,国际标准的参考,鉴定该标本的全部必需的细节，包括采样部位、采样时的操作、样品性质、水系统或植物的种类、采样点的类别。,被检测标本的体积和数量,采样日期,样品收集日期,实验室接收日期,实验室检测日期,分析过程中所观察到的任何情况都可能影响最后的结果。,检验报告实验报告应包括以下信息,菌株保存,（一）短期保存,将军团菌接种在,BCYE,斜面培养基上，可以在,4,保存数周。,（二）长期保存,如要长期保存军团菌，最好用冻干保存法或低温,冷冻保存法。而冻干保存法因为在,4,或,20,保,存时间更长，且运输过程中不受影响，因此是最好的,保存方法。,菌株保存（一）短期保存,低温冷冻保存法,1,、将军团菌接种在,BCYE,平板上，,361,，,2.5%-5%CO,2,培养箱或烛缸中培养，确定没有污染。,2,、将已灭菌的含有,ACES,、,L-,半胱氨酸和,15%-20%,甘油的保存液分装至,2ml,的螺帽冻存管中，每管,1ml,。,3,、用灭菌棉签从,BCYE,平板上刮取适量细菌。放入以上装有保存液的冻存管中。注意，使用的冻存管必须能耐受低温。,4,、将冻存管放入,-70,冰箱保存。也可以放于,-20,冰箱，但是菌株存活率可能受影响。,低温冷冻保存法1、将军团菌接种在BCYE平板上，361,谢 谢,谢 谢,