结核分枝杆菌的核酸检测课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,结核分枝杆菌核酸及,血清学检测,唐媛媛,潍坊市第二人民医院 检验科,结核分枝杆菌核酸及血清学检测唐媛媛,结核分枝杆菌核酸检测是检测结核分枝杆菌特异的核酸序列；,阳性结果提示该检测结核分枝杆菌核酸的存在，在排除核酸污染的情况下，可确定该检测标本中存在结核分枝杆菌。,结核分枝杆菌核酸检测较常采用的目的片段有,16SrRNA,、,IS6110,、,MBP64,、,rpoB,、,hsp65,等,结核分枝杆菌核酸检测是检测结核分枝杆菌特异的核酸序列；,结核分枝杆菌核酸检测,增加分子生物学阳性可以作为确诊标准，及强调病原学检查的重要性。,3.4.2,分子生物学检查,结核分枝杆菌核酸检测阳性。,4,诊断原则,肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学、分子生物学）检查为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像、相关的辅助检查及鉴别诊断等，进行综合分析做出诊断。以病原学、病理学结果作为确诊依据。,5.3,确诊病例,结核分枝杆菌核酸检测阳性，及胸部影像学检查支持即可确诊。,结核分枝杆菌核酸检测增加分子生物学阳性可以作为确诊标准，及,常用技术,传统实时荧光定量,PCR,检测,半巢式全自动实时荧光定量,PCR,检测,环介导等温扩增检测,实时荧光核酸恒温扩增检测,交叉引物恒温扩增检测,基因探针检测,常用技术传统实时荧光定量PCR检测,抗酸染色,每张检查,3-5min,或更长时间,阳性率低,因素之一,荧光染色,1.,阳性率,30%,2.,无法区分,TB,or NTB,1.,假阳性率高,2.,结合抗酸染色,抗酸染色每张检查3-5min或更长时间阳性率低因素之一荧光,结核菌需要先培养出来（,2-6,周,）,再加入不同浓度抗菌药物的培养基中继续培养,4-8,周,报告药敏结果,结核菌需要先培养出来（2-6周）,2014,年,WHO,关于结核诊断的标准,肺结核,所有患者，包括儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送,2,份痰做涂片镜检 或,1,份痰做,Xpert MTB/RIF,检测,对于涂阴疑似肺结核患者，应当使用,Xpert MTB/RIF,或培养 进行诊断,耐药结核,当患者具有耐药结核的风险，或者合并,HIV,感染，或者病情严重时，应使用,Xpert MTB/RIF,做初始诊断；,肺外结核,所有患者，包括儿童，怀疑有肺外结核时，应当采集相应的样本进行微生物学和组织学检查；优先推荐使用,Xpert MTB/RIF,做初始诊断,2014年WHO关于结核诊断的标准肺结核,GeneXpert,Xpert MTB/RIF,一种半巢式实时荧光,PCR,体外诊断技术，可以检测结核分枝杆菌以及利福平耐药性；,针对,rpoB,基因,81bp,利福平耐药核心区间（,RRDR,）设计引物、探针。,5,个探针结合到野生型，而不是突变体目标。每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。,GeneXpertXpert MTB/RIF,痰标本与处理液,1,：,2,混合,吸取,2ml,处理样品,到反应盒,将反应盒放入检测模块（手工操作完成）,标本自动,清洗过滤,超声裂解,DNA,提纯,DNA,和,PCR,反应试剂混合,半巢式实时荧光定量核酸扩增检测,打印检测报告,获得检测结果时间：,1,小时,50,分钟,系统内自动完成,痰标本与处理液吸取2ml处理样品将反应盒放入检测模块（手工操,INH,单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对,RIF,单耐药的患者，无论,INH,是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案,1,。,约,90%,利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者,2,。,Sven O.Friedrich et al,.Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial.Journal of Clinical Microbiology.2011(49):2827-2831.,Xichao Ou et al.A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China.International Journal of Infectious Diseases.2015(31):41-46.,MTB/,RIF,检测对,MDR-TB,的防控,“结核,+,利福平耐药”对多耐结核控制产生的效果最为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升的效果有限。,INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对,环介导等温扩增仪（,TB-LAMP,）,体外定性检测结核分枝杆菌复合群；,在恒温条件下进行基因扩增反应；,4,种引物识别,6,个区域，特异性高；,扩增反应效率高，,67,，,40min,。,主要优点在于对实验室仪器的依赖程度较小，而且试剂成本较低,。,环介导等温扩增仪（TB-LAMP）,传统实时荧光定量,PCR,检测,目的：,定量,检测人标本中的结核分枝杆菌核酸,原理：,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累计实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的办法。,传统实时荧光定量PCR检测目的：定量检测人标本中的结核分枝杆,Xpert MTB/RIF,TB-LAMP,结核杆菌,DNA,目的基因片段,rpoB,gryB,及,IS6110,IS6110,方法,半巢式实时荧光,PCR,环介导恒温扩增,实时荧光定量,PCR,时间,2,小时,1,小时,2.5,小时,检测敏感度,131,菌条,/ml,100,菌条,/ml,1000,10000,菌条,/ml,优点,全自动、同时检测利福平耐药基因、特异性高，生物安全性高,67,恒温扩增，扩增时间短，特异性高，生物安全性高,适合大批量筛查，低费用,缺点,最多一次同时检测八个样本,标本用量较少，除痰标本以外的标本需进一步认证,假阳性，易污染，需专业人员操作,Xpert MTB/RIFTB-LAMP结核杆菌DNA目的,样本类型（一）,抗酸杆菌涂片镜检：,痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液、创伤标本、大便标本,分枝杆菌分离培养：,痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液、创伤标本、大便标本、,血液,结核分枝杆菌的核酸检测：,痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液、创伤标本、大便标本、,血液（,GeneXpert,除外）、病理切片,样本类型（一）抗酸杆菌涂片镜检：,样本类型（二）,分枝杆菌菌种鉴定,临床分枝杆菌分离培养物,结核分枝杆菌药物敏感性试验,：,临床分离结核杆菌纯培养物,结核抗体的检测：,血清,IFN-,释放试验（,T-SPOT.TB,）,：,肝素锂或肝素钠抗凝血,样本类型（二）分枝杆菌菌种鉴定,标本留取标准,1.,痰标本：,（,1,）可疑肺结核患者：初诊病人应收集,3,份标本（当日即时、夜间和次日晨痰），治疗中或随访病人应按期留取,2,份痰标本（晨痰、夜间痰），体积,3,5ml,，盛于广口和具有螺旋盖子的痰瓶中。,（,2,）即时痰采集后立即送检，夜间痰和晨痰采集后常温保存不应超过,12,小时，对当日不能进行涂片检查的标本，须置于,4,冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。,（,3,）对无法咳痰的患者：可使用高渗盐水（,3%NaCl,）诱导痰或收集清晨胃液标本，或使用支气管镜采集支气管灌洗液标本。,标本留取标准1.痰标本：,2,支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本,（,1,）对于不能留取痰标本的患者：推荐使用侵入性采集技术获取标本，比如纤维支气管镜检查、细针肺穿刺、肺活组织检查。,（,2,）严格器械清洁和消毒，避免引起交叉污染和感染。,（,3,）支气管镜不能接触自来水，通免污染环境分枝杆菌。,（,4,）对难以诊断的病例推荐使用其他侵入性技术采集标本，比如细针穿刺、开放肺活组织检查，无菌条件下采集的经支气管活检和其他活检标本，运输过程中，应加入,0.5,1ml,无菌的生理盐水。,（,5,）支气管分泌物至少,2,5ml,；支气管肺泡灌洗液至少,20-50ml,。,2支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本,3.,胃灌洗液,（,1,）婴幼儿、儿童和迟钝者诊断肺结核时，鉴于无法采集标本或支气管灌洗液，推荐采集胃液标本，通过胃灌洗咽下去的痰液。,（,2,）标本应在采集,4,小时内送到实验室，否则应置于一次性内含,100ml,碳酸钠酸他的无菌容器中。,（,3),胃灌洗液需连续采集,3,天，体积,5,10ml,，调节,pH,至中性。,4.,尿液,（,1,）采集标本前，应清洗外生殖器，推荐连续采集,3,天清晨中段尿于无菌容器中，用于培养的尿液标本至少需要,40ml,（,2,）只有在不能获得中段尿时，可以使用导尿术采集标本。,（,3,）标本运送不及时，应冷藏保存。,3.胃灌洗液,5.,无菌采集的体液（脑脊液、胸水、腹水、心包积液、关节液、骨髓）,（,1,）临床医生采用抽吸技术或外科操作无菌收集体液标本于无菌容器。,结核杆菌,DNA,及,Xpert,标本：为防止标本凝固，需加入,EDTA,抗凝处理（可注入于长紫管中颠倒混匀抗凝处理）。,IFN-,释放试验（,T-SPOT.TB,）标本：分离淋巴细胞需加入肝素抗凝，抗凝比例为,100ml,胸腹水加入,0.8ml,肝素，颠倒混匀。,（,2,）标本尽可能快的运送到实验室,（,3,）应提交足够量的样本，脑脊液,5ml,，胸水和腹水,5,10ml,。,5.无菌采集的体液（脑脊液、胸水、腹水、心包积液、关节液、,6,无菌采集的组织（淋巴结、皮肤和其他活检标本）,（,1,）采集标本尽可能无菌操作，放置到无固定剂或防腐剂的无菌容器中，不能浸泡在盐水或其他液体或用纱布包裹，重量不少于,1g,。应迅速运送到实验室，对于长时间的运输，为防止脱水可加入无菌盐水，保持温度在,4,15,（,2,）针对皮肤溃疡，宜从病变组织周边采集活检标本。,（,3,）,福尔马林溶液浸泡过的标本不能用于培养检查。,（,4,）极少量的活检标本可以浸泡在少量无菌盐溶液中。,6无菌采集的组织（淋巴结、皮肤和其他活检标本）,7.,血液,（,1,）如果血液标本接种培养基之前需要运输，肝素成柠檬酸盐可以用于抗凝。,EDTA,抗凝和凝固的血不能做培养。,（,2,）血液和脑脊液标本培养推使且,MYCO,FLYTIC,瓶（,BD,）血培养瓶。（暂时不做）,8.,大便标本,大便标本涂片的敏感性只有,32,34,，不能根据涂片的结果决定是否进行培养。,7.血液,9,、病理组织切片（核酸检测）,在一只干净的离心管中加入,6-12,片,5-10m,厚的,FFPE,，,勿切白片。,病理组织切片已固定，结核分枝杆菌已无活性，无法做培养。,9、病理组织切片（核酸检测）,DNA,扩增技术检测有哪些不足,相比DNA检测技术，RNA检测更适合判断病原体转录活性，DNA检测技术不能判断病原体转录活性，不能区分潜伏感染和活动性感染（活动性感染：指示RNA转录活跃，潜伏感染：指示RNA不转录）,交叉污染问题,变温检测，对仪器要求高,抑制反应（Taq酶）,DNA扩增技术检测有哪些不足相比DNA检测技术，RNA检测更,免疫斑点干扰素释放试验,结核菌感染的免疫应答反应主要是细胞介导免疫反应；,T-SPOT.TB,定量检测人外周抗凝全血中受结核杆菌特异混合多肽抗原（,ESAT-6,和,CFP-10,）刺激分泌细胞因子干扰素的效应,T,淋巴细胞数量。,结核特异性抗原,ESAT-6,和,CFP-10,由结核杆菌基因组,RD1,区相同的操纵子编码的蛋白；,所以的卡介苗菌株均丢失该基因序列,绝大多数环境分枝杆菌也不存在,RD1,区,免疫斑点干扰素释放试验结核菌感染的免疫应答反应主要是细胞介导,标本采集：肝素或柠檬酸钠抗凝的外周静脉血,分离单个核细胞，每个检测孔含有,25,万,个细胞。每个检测标本分,4,个孔：空白对照，阳性对照，两个样本孔,37,孵育,16-20,个小时,洗涤,-,抗体孵育,1h-,洗涤,-,显色,-,计数蓝色斑点,阴性结果：患者体内不存在结核杆菌特异的效应,T,细胞；排除结核感染（包括排除肺外结核感染）,阳性结果：患者存在结核感染，但是不能区别是否为活动性结核病。,标本采集：肝素或柠檬酸钠抗凝的外周静脉血,