等位基因特异性PCR原理和应用课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PPT课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PPT课件,*,等位,基因,特异性,PCR,的,原理与应用,2015.1.16,1,PPT课件,等位基因特异性PCR 的原理与应用2015.1.161PPT,内容概要,基本原理,实验方法,临检项目,KRAS,、,EGFR,突变检测,科研应用,BSG,位点分型,2,PPT课件,内容概要基本原理实验方法临检项目KRAS、EGFR突变检测,等位,基因,特异性,PCR,的基本原理,3,PPT课件,等位基因特异性PCR的基本原理3PPT课件,单核苷酸多态性（,SNP,）检测方法,限制性酶切片段长度多态性（,RFLP,）,单链构象,多态性（,S,SCP,）,变性高效液相色谱（,DHPLC,）,异源双链分析（,HA,）,基质辅助激光解吸飞行时间质谱（,MALDI-TOF MS,）,动态等位基因特异性杂交（,DASH,）,基因芯片法,TaqMan,探针技术,焦磷酸测序法,4,PPT课件,单核苷酸多态性（SNP）检测方法限制性酶切片段长度多态性（,？,操作繁琐,耗时长,产物污染,灵敏度低,仪器昂贵,5,PPT课件,？操作繁琐耗时长产物污染灵敏度低仪器昂贵5PPT课件,等位基因特异性,PCR,等位基因特异性,PCR,（,Allele Specific-PCR,，,AS-PCR,）,又称扩增阻碍突变系统,PCR,（,Amplification Refractory Mutation System-PCR,，,ARMS-PCR,）,PCR,扩增过程中，引物从,3,末端开始延伸，要求,3,端碱基与模板完全配对,6,PPT课件,等位基因特异性PCR等位基因特异性 PCR（Allele,等位基因特异性,PCR,基本,原理,You F.M.2008,BMC Bioinformatics,Two Allele-Specific(AS)primers,one for each allele of a SNP are designed.The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end.Two sets of primers,either forward or reverse primers can be designed.If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction,the reaction is called allele-specific PCR(AS-PCR).,7,PPT课件,等位基因特异性PCR基本原理You F.M.2008,四引物法,ARMS-PCR,单管反应,8,PPT课件,四引物法ARMS-PCR单管反应8PPT课件,凝胶电泳,耗时长,开管操作,易污染,缺陷：,9,PPT课件,凝胶电泳耗时长开管操作易污染缺陷：9PPT课件,使用荧光定量,PCR,检测,10,PPT课件,使用荧光定量PCR检测10PPT课件,real time PCR,速度快,闭管操作,不易污染,11,PPT课件,real time PCR速度快闭管操作不易污染11PPT课,等位基因特异性,PCR,技术,特点,灵敏度高,（,0.1-1%,）,操作简便,周期短,不产生,PCR,产物污染,适用样本类型多,（如,FFPE,）,精确突变类型,方法建立需时较长,仅能检测已知突变,适用于临床检验,优点,缺点,12,PPT课件,等位基因特异性PCR技术特点灵敏度高（0.1-1%）操作简便,测序法与,等位基因特异性,PCR法比较,13,PPT课件,测序法与等位基因特异性PCR法比较13PPT课件,等位,基因,特异性,PCR,的,实验方法,14,PPT课件,等位基因特异性PCR的实验方法14PPT课件,操作流程及数据解读,15,PPT课件,操作流程及数据解读15PPT课件,实验操作,收到样本之后：,16,PPT课件,实验操作收到样本之后：16PPT课件,试剂盒,（以友芝友,EGFR,试剂盒为例）,突变探针：,FAM,荧光标记；内标探针：,VIC,荧光标记,17,PPT课件,试剂盒（以友芝友EGFR试剂盒为例）突变探针：FAM荧光标记,PCR,扩增,ABI7500,开机，仪器自检；,将准备好的,8,连管放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序；,信号采集：,EGFR,基因：,FAM,通道；内标：,VIC,通道；,PCR,反应条件：,37,：,10,分钟,95,：,5,分钟,95,：,15,秒,60,：,60,秒,核酸扩增区,40,循环,18,PPT课件,PCR扩增ABI7500核酸扩增区40循环18PPT课件,阴性对照和阳性对照,阴性对照（空白对照）,应无,FAM,荧光信号产生，或,Ct,值,38,阳性对照（弱阳性对照）,FAM,通道,Ct,值,32,，,VIC,通道,Ct,值,38,，,但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。,无,DNA,污染,验证,PCR,有效性,19,PPT课件,阴性对照和阳性对照阴性对照（空白对照）无DNA污染验证PCR,样品的外控和内控,待测样品的外控（,8,号管,FAM,信号曲线）应有,FAM,信号,以友芝友试剂盒为例：,FAM,通道,23Ct,值,30,；,待测样品的内控（,1-7,号管的,HEX/VIC/JOE,信号曲线）应有扩增曲线,以友芝友试剂盒为例：样品检测中,VIC,通道,Ct,值,38,。,Ct23：DNA加入过量,30Ct34：DNA,加入量,较低,Ct34：,需重新制备样本,20,PPT课件,样品的外控和内控待测样品的外控（8号管FAM信号曲线）应有F,结果判定,Ct=,突变检测,Ct,内控检测,Ct,以友芝友,EGFR,试剂盒为例,21,PPT课件,结果判定 Ct=突变检测Ct 内控检测Ct以友芝友,临检项目,KRAS,22,PPT课件,临检项目KRAS22PPT课件,KRAS背景,KRAS,是一种原癌基因，长约,35kb,，位于,12,号染色体，是,RAS,基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与,PI3K,、,PTEN,、,AKT,和,RAF,、,MEK,、,ERK,信号通路的调控；,EGFR,在通路中位于,KRAS,上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导致,KRAS,的活化和通路中信号传导；,KRAS,是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（,65%-90%,）、结直肠癌（,40%,）、肺癌（,20%,）、卵巢癌（,15%,）。,23,PPT课件,KRAS背景KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号,KRAS,基因突变影响结直肠癌药物疗效,KRAS,基因野生型的转移性结直肠癌患者能从,EGF,抗体（,西妥昔单抗、帕尼单抗,）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；,KRAS,突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于,KRAS,野生型患者,Karapetis CS,2008,N Eng J Med,24,PPT课件,KRAS基因突变影响结直肠癌药物疗效KRAS基因野生型的转移,结直肠癌患者检测,KRAS,突变相关指南,欧洲药品评估局（,EMEA,，,2008,）指出：,KRAS,野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。,美国临床肿瘤学会（,ASCO,，,2009,）推荐：,转移性结直肠癌患者应检测,KRAS,突变，如有,KRAS12,、,13,位突变，则不应进行,EGFR,单克隆抗体治疗,；,美国,FDA,指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须检测,KRAS,基因的基因型；,2012,年,7,月,6,日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（,Qiagen,），以判断西妥昔单抗是否有效；,美国国立综合癌症网络（,NCCN,，,2014,）指南说：,转移性结直肠癌患者均应进行,RAS,突变检测（,KRAS,和,NRAS,），至少应检测,KRAS,第二外显子的突变情况,。,KRAS,或,NRAS,突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。,中国卫生部于,2010,年,10,月,14,日发表了结直肠癌诊疗规范（,2010,版）。明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受,西妥昔单抗,、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的,K-ras,基因状态。在晚期,/,转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤,K-ras,基因状态，,EGFR,不推荐作为常规检查项目。,25,PPT课件,结直肠癌患者检测KRAS突变相关指南欧洲药品评估局（EMEA,KRAS,突变影响非小细胞肺癌药物疗效,KRAS,基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（,TKI,，如吉非替尼、厄洛替尼,）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗。,KRAS,突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中红线所示）,Anderson SM,2011,Expert Rev.Mol.Diagn,Eberhard DA,2005,J Clin Oncol,26,PPT课件,KRAS突变影响非小细胞肺癌药物疗效KRAS基因野生型的非小,非小细胞肺癌患者检测,KRAS,突变相关指南,美国国立综合癌症网络（,NCCN,，,2009,）指出，,KRAS,突变与非小细胞肺癌患者,TKI,抵抗有关，,KRAS,基因测序有助于确定哪些病人适合,TKI,治疗。当,KRAS,基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。,27,PPT课件,非小细胞肺癌患者检测KRAS突变相关指南美国国立综合癌症网络,KRAS,主要突变位点,在结直肠癌中，,KRAS,突变主要发生于,codon12(80%),、,codon13(15-20%),、,codon61,和,146(5%),；在肺癌中，约,97%,的,KRAS,突变发生于,codon12,、,13,，其余位于,codon61,和,146,。,28,PPT课件,KRAS主要突变位点在结直肠癌中，KRAS突变主要发生于co,拟开发产品,特异性引物：,7,条,（已验证特异性）,参照引物：,1,条,（已验证特异性）,下游引物：,1,条,（已验证特异性）,Taqman,探针：,1,条,（已设计，待订购）,锁核酸阻滞探针：,1,条,（已设计，待订购）,阳性对照：包含,7,种突变的质粒,DNA,模板,（已制备并测序）,Taq,酶，最好为,Taq Gold,（,hot start enzyme),qPCR,混合反应液,29,PPT课件,拟开发产品特异性引物：7条 （已验证特异性）29PPT课,项目进展,-KRAS,第二批引物能较好区分质粒,DNA,突变（,SYBR green,染料，,ABI7500,）,516,位突变,517,位突变,30,PPT课件,项目进展-KRAS第二批引物能较好区分质粒DNA突变（SYB,项目进展,-KRAS,532,位突变,参照引物,31,PPT课件,项目进展-KRAS532位突变参照引物31PPT课件,临检项目,EGFR,检测,32,PPT课件,临检项目EGFR检测32PPT课件,EGFR,突变背景,EGFR(epidermal growth factor receptor),基因位于染色体,7p11.2,，大小,192kb,，是上皮生长因子（,EGF,）细胞增殖和信号传导的受体。,研究发现,EGFR,突变与吉非替尼、厄洛替尼的疗效密切有关。其中,EGFR,突变的患者对吉非替尼、厄洛替尼治疗敏感，有效率在,80%,以上；而,EGFR,野生型的患者的有效率在,10%,以下。,EGFR,酪氨酸激酶上外显子,18-21,为最常见的基因突变位点，也是靶向药物,吉非替尼,结合的位点，外显子,19,缺失和外显子,21,的,L858R,突变是最常见的与吉非替尼疗效相关的敏感突变。,33,PPT课件,EGFR突变背景EGFR(epidermal growth,EGFR,突变,影响,非小细胞肺癌药物疗效,研究表明,EGFR,突变型患者使用吉非替尼的疗效要优于卡铂与紫杉醇组合治疗，而在野生型患者中则相反，使用吉非替尼的疗效不如卡铂与紫杉醇组合治疗。,Mok T.S.2009,N Eng J Med,Maemondo M.2010,N Eng J Med,34,PPT课件,EGFR突变影响非小细胞肺癌药物疗效研究表明EGFR突变型患,EGFR,突变检测相关指南,美国国家综合癌症网络,(NCCN)2011,版的癌症治疗指南中明确指出：,EGFR,突变，尤其是外显子,19,的缺失突变和外显子,21,的,L858R,突变，与肿瘤对,TKIs,如吉非替尼治疗敏感性有重要关系。,而部分,EGFR-TKI,初始治疗有效的患者后期会发生耐药，与,EGFR,外显子,20,突变密切相关。,美国临床肿瘤学会（,ASCO,）在,JCO,上发表报告：,EGFR-TKI,是携带,EGFR,突变型的非小细胞肺癌病人的一线治疗药物，有益于进展期非小细胞肺癌患者的个体化治疗。,欧洲,EMEA,指出：,易瑞沙（吉非替尼）仅对携带,EGFR,突变型的非小细胞肺癌患者有效,，平均无进展生存期延长,3.5,月。,美国,FDA,（,2013,）批准对拟采用阿法替尼、厄洛替尼等,EGFR-TKI,治疗的患者进行,EGFR,突变检测的试剂盒（,therascreen EGFR RGQ PCR Kit,和,cobas EGFR Mutation Test,）；,我国,非小细胞肺癌临床实践指南,中也明确指出,EGFR,突变，尤其是,19,号外显子缺失突变与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂,(TKIs),的敏感度有重要关系,；对腺癌、大细胞癌、非小细胞肺癌等肺癌组织学类型，,EGFR,检测为一类推荐。,35,PPT课件,EGFR突变检测相关指南美国国家综合癌症网络(NCCN)20,EGFR,突变位点（常规检测,29,个）,36,PPT课件,EGFR突变位点（常规检测29个）36PPT课件,EGFR,突变与,EGFR-TKI,药物疗效关系,37,PPT课件,EGFR突变与EGFR-TKI药物疗效关系37PPT课件,EGFR,18-21,外显子突变位点检测,结果,19,外显子缺失,21,外显子,L858R,突变,38,PPT课件,EGFR18-21外显子突变位点检测结果19外显子缺失21外,科研应用,bsg,分型,39,PPT课件,科研应用bsg分型39PPT课件,Basigin,（,BSG,）及其功能,Basigin,（,BSG,，,CD147/EMMPRIN,）为单次跨膜糖蛋白，在体内多种细胞中广泛表达；,炎症与非炎症性心肌病患者心肌细胞,Basigin,表达水平升高；,充血性心力衰竭的患者中,MMP-9,和,Basigin,蛋白表达水平显著升高，且二者表达水平呈正相关；,目前无人类,BSG,基因多态性与慢性充血性心衰易感性,关系的研究。,40,PPT课件,Basigin（BSG）及其功能Basigin（BSG，CD,如何基因分型？,PCR-RFLP,4,个位点,800,样本,200,多块胶,数百小时,MALDI-TOF,800,样本,4,个位点,数万元,？,41,PPT课件,如何基因分型？PCR-RFLP4个位点MALDI-TOF80,ARMS,法设计引物,ARMS,引物：,野生型：,CTGAGTGGGGCCAGT,突变型：,CTGAGTGGGGCCAGC,下游引物：,CCCCGAATACTGAAG,产物,192bp,42,PPT课件,ARMS法设计引物ARMS引物：42PPT课件,总结,等位基因特异性,PCR,是一种操作简便、灵敏度高、无后续产物污染的,SNP,检测方法；,适用于临床检验和科研项目。,43,PPT课件,总结等位基因特异性PCR是一种操作简便、灵敏度高、无后续产物,Thank You,！,44,PPT课件,Thank You！44PPT课件,