专题一《基因工程》复习ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题一 基因工程,第一节 基因工程的基本工具,一.“分子手术刀”限制性核酸内切酶,1.来源：,2.种类：,主要是从,原核生物中分离纯化出来,的一种酶。,约4000种。,3.特点:,能识别双链DNA 分子的,某种特定的核苷酸序列,，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,断开;,注:识别系列一般为48核苷酸系列,多为6核苷酸系列,均为回文系列,具有明显的中轴线.,coRI限制酶,SmaI限制酶,识别序列,切割位点,和之间,和之间,思考:原核生物体内该酶的作用是什么?,思考:为什么原核生物自己的DNA不会被切割降解?,专题一 基因工程第一节 基因工程的基本工具一.“分子手术,1,6.作用示例：,过程示例,结果示例,4.作用：,切取目的基因或切开运载体,5.结果：,形成两种末端:,粘性末端,(错位切割),平末端,(错位切割,),6.作用示例：过程示例结果示例4.作用：切取目的基因或切开运,2,二.“分子缝合针”DNA连接酶,1.作用：,2.种类：,DNA连接酶可,把两个双链DNA片段末端之间的缝隙“缝合”起来，,形成重组的DNA分子。,磷酸二酯键,T,4,DNA连接酶,Ecoli DNA连接酶,只能连接黏性末端之间,两种末端之间均可连接,但连平末端之间的效率更低.,3.与DNA聚合酶的比较：,都是蛋白质,均能催化磷酸二酯键的形成.,但又有以下不同:,组成和性质各不相同;催化对象不同;前者不需模板,后者需模板.,二.“分子缝合针”DNA连接酶1.作用：2.种类：D,3,三.“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,1.作用：,将外源基因送入受体细胞,使其能在受体细胞内稳定存在并复制.,2.条件:,（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。,（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。,（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。,（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。,（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,注:天然运载体都需人工改造后才能用于基因工程操作。,3.常用种类：,质粒、,噬菌体的衍生物、动植物病毒,三.“分子运输车”基因进入受体细胞的载体1.作用：将外源,4,第二节 基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,一.目的基因的获取,(一)目的基因的概念,是指编码蛋白质的基因,通常是人类所需的某些特定性状的基因或人类所需的特定蛋白质的基因.,如抗逆性基因,优质基因,药用蛋白基因,工业用酶的基因等.,(二)目的基因的获取途径,概括地分为两类方法:,一是直接从自然界获取,(如从基因组文库中获取),二是人工合成,(如反转录法合成、PCR技术扩增或DNA合成仪化学合成).常用的具体方法有以下三种:,1.从基因文库中获取目的基因,(1)基因文库的概念:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,这些分别含有这种生物不同基因的各个受体菌群体,称为该生物的基因文库,第二节 基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体,5,(2)基因文库的类型,基因组文库:,包含了一种生物所有基因的基因文库,叫做基因组文库.,部分基因文库(cDNA文库):,只包含了一种生物的一部分基因的基因文库,叫做该生物的部分基因文库.,(3)基因文库的构建,提取某种生物体的全部DNA,选用适当的限制酶切成一定范围大小的DNA片段,将这些DNA片段分别与载体连接起来,分别导入受体菌中储存。,通过这种方法获取目的基因称为,直接分离法（或鸟枪法）,基因组文库的构建:,cDNA文库,的构建:,提取某种生物某发育时期的mRNA,反转录产生其互补DNA（也叫cDNA）,将这些DNA片段与载体连接,分别导入受体菌中储存。,通过这种方法获取目的基因称为反转录法,(2)基因文库的类型基因组文库:包含了一种生物所有基因的基因,6,专题一基因工程复习ppt课件,7,(4)基因的结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,终止子,启动子,(RNA聚合酶结合位点),原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,终止子,启动子,(RNA聚合酶结合位点),内含子,外显子,真核细胞的基因结构,(4)基因的结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游,8,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成.,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,(5)两类基因文库的比较,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,小,大,基因中启动子,无,有,基因中内含子,无,有,基因多少,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,物种之间的基因交流,可以,部分基因可以,适用的目的基因范围,可用于真核基因,一般用于原核基因,原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_,9,(6).如何从基因文库中得到目的基因,依据目的基因的有关信息,(如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、,基因翻译产物蛋白质的特性等),，通过一定的方法从基因文库中检测并提取出目的基因。,(7)从基因文库中获取目的基因的特点,优点是操作简便，技术要求低。缺点是具有一定的盲目性，工作量大。,思考:什么情况下需要构建基因文库?什么情况下不需要?,以下情况一般需构建基因文库:,不知道目的基因的序列时;想从一种生物体内获得许多基因;想比较两种生物的基因组差异;想知道一种生物的不同个体发育时期基因的表达差异;想得到一种生物的全部基因组序列.,如果只需获取个别目的基因,且其序列巳知时,则不需构建基因文库.,可直接从含目的基因的生物体内提取出含目的基因的DNA片段(或提取出目的基因的mRNA进行逆转录获得其cDNA),通过PCR技术扩增获取目的基因.,(6).如何从基因文库中得到目的基因依据目的基因的有关信息(,10,2.PCR技术扩增目的基因,概念：,PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术.,双链DNA复制(碱基互补配对),模板DNA;原料,(四种脱氧核苷酸);,耐热的DNA聚合酶,(,Taq酶),;,一对引物,(根据目的基因的部分核苷酸系列制成的一小段单链),.,原理:,条件:,适用前提:,巳知目的基因的部分核苷酸系列(用于合成引物).,双链模板DNA在90-95热作用下,氢键断裂，解旋成两条单链,调节系统温度降低到55-60,引物与模板DNA解旋后的单链结合,形成局部双链。,调节系统温度到70-75,在Taq酶的作用下,合成与模板DNA单链互补的子链.,过程,a.DNA变性:,b.退火(复性):,c.延伸:,子代DNA不断重复循环上述过程,呈2n式增长。,2.PCR技术扩增目的基因概念：PCR全称为聚合酶链式反应,11,PCR扩增仪,PCR扩增仪,12,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原则,条件,不同点,解旋方式,场所,引物,酶,PCR技术扩增目的基因与细胞复制DNA的比较,碱基互补配对,模板、原料、能量、酶、引物等,解旋酶催化氢键逐步断裂,体外,主要在细胞核中,DNA,RNA,热稳定DNA聚合酶（,Taq,酶）,解旋酶、DNA聚合酶、,DNA,连接酶等,氢键在高温下断裂,双链全部解开,3.人工合成,过程:,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,仪器:,DNA合成仪,适用对象:,核苷酸系列巳知,且比较小的目的基因,PCR技术DNA复制相同点原则条件不同点解旋方式场所引物酶,13,二.基因表达载体的构建核心环节,1.目的(作用):,a.使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代;,b.同时使目的基因能表达和发挥作用.,2.基因表达载体的组成元件,目的基因,启动子,(首端),终止子,(尾端),标记基因,复制原点.,注:构建表达载体时,需人工插入的元件视目的基因的结构和运载体本身的条件不一而定.,3.过程:,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,二.基因表达载体的构建核心环节1.目的(作用):a.使目,14,三.将目的基因导入受体细胞,1.转化的概念:,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,2.受体细胞的种类和选择,微生物细胞:,动物细胞:,植物细胞:,主要用于培育具有特定优良性状的植物品种,少数用于生产基因产物.,主要用于获得“乳腺生物反应器”来生产珍贵的蛋白质产品,也可用于培育具有特定优良性状的动物品种.,多用其受精卵细胞,但也不绝对.,主要利用其快速繁殖和旺盛的代谢能力来生产目的基因产物,(高效、低成本、无污染),.,3.导入不同受体细胞的方法,(1).将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法主要方法,原理：,双子叶植物和裸子植物的受损部位能分泌汾类化合物吸引农杆菌,农杆菌体内的Ti质粒上的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上.,三.将目的基因导入受体细胞1.转化的概念:目的基因进入受体细,15,双子叶植物和裸子植物,适用对象:,操作过程:,基因枪法多用于单子叶植物,花粉管通道法如我国的抗虫棉,双子叶植物和裸子植物适用对象:操作过程:基因枪法多用于,16,(2).,将目的基因导入动物细胞,显微注射法,(3).将目的基因导入微生物细胞,Ca,2+,处理吸收转化法,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,1.导入检测,利用标记基因进行检测和筛选,四.目的基因的检测与鉴定,是否导入原核细胞:,真核细胞染色体的DNA上是否插入了目的基因:,DNA分子杂交技术,2表达检测,转录水平检测,DNA分子杂交技术,翻译水平检测,抗原抗体杂交技术,分子检测法,个体水平检测法：,如抗虫鉴定，抗病鉴定.,(2).将目的基因导入动物细胞显微注射法(3).将目的基,17,第三节 基因工程的应用,一.植物基因工程的应用成果,1.提高农作物的抗逆能力,(2)抗病转基因作物,主要的杀虫基因有:,Bt毒蛋白基因,蛋白酶抑制基因,淀粉酶抑制基因,植物凝集素基因.,(1)抗虫转基因作物,常用的抗病基因是:,病毒的外壳蛋白基因,病毒的复制酶基因,几丁质酶基因,抗毒素合成基因.,(3)其他抗逆转基因作物:,耐盐碱,耐干旱,耐低温,抗除草剂等.,2.改良农作物品质:,高产,优质,耐储存等.,3.生产药物:,如紫草素,第三节 基因工程的应用一.植物基因工程的应用成果1.提高农,18,二.动物基因工程的应用成果,1.用于提高动物生长速度.,如转生长激素鲤鱼,2.用于改善畜产品的品质.,如低乳糖乳汁的转基因奶牛,3.用转基因的动物生产药物,动物乳腺生物反应器,原理：,将药用蛋白基因与哺乳动物的乳腺蛋白基因的启动子等调控基因重组在一起，导入哺乳动物受精卵，培育出的转基因动物会在乳腺细胞特异性表达出药用蛋白，从而可在其乳汁中提取。,4.用转基因的动物作器官移植的供体,选用猪作器官移植补充供源的原因：,猪的内脏大小、构造、血管分布与人极为相似，且携带人类致病菌少。,三.用于生物制药,如:胰岛素,干扰素等,四.用于环保领域,用于环境监测和环境污染的治理,二.动物基因工程的应用成果1.用于提高动物生长速度.如转生长,19,五.尝试用于基因治疗,原理:,功能上修复.结构上并未修复.,技术类型:,体内基因疗法和体外基因疗法.,困难:,伦理上,技术上,安全上都还有困难,仍处于实验阶段.,用于基因治疗的目的基因种类:,正常健康基因,反义基因,自杀基因,(编码可杀死癌细胞的蛋白酶基因),.,六.用于基因诊断,基因芯片技术,DNA分子杂交技术（碱基互补配对）,原理:,优点:,快速，高效，自动化,五.尝试用于基因治疗原理:功能上修复.结构上并未修复.技术类,20,第四节 蛋白质工程的崛起,是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。,一.蛋白质工程的概念:,二.蛋白质工程崛起的缘由,1.基因工程的不足:,只能生产自然界已存在的蛋白质,2.天然蛋白质的不足:,天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。,三.蛋白质工程的基本原理,1.目标：,改造或制造新的蛋白质，满足人类的生产或生活的需要.,2.原理:,蛋白质的结构决定功能,第四节 蛋白质工程的崛起是指以蛋白质分子的结构规律及其与生,21,3.实质:,对编码蛋白质的基因进行改造（基因修饰或基因合成）,4.蛋白质工程的流程,mRNA,基因,DNA,氨基酸序列多肽链,蛋白质,三维结构,预期功能,生物功能,转录,翻译,折叠,DNA合成,分子设计,四.蛋白质工程的主要步骤,1.从生物体中分离纯化目的蛋白；,2.测定其氨基酸序列；,3.借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋 白质的二维重组和三维晶体结构;,4.设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠 与去折叠等对其活性与功能的影响；,5.设计编码该蛋白的基因改造方案，,如定点诱变,；,6.分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,3.实质:对编码蛋白质的基因进行改造（基因修饰或基因合成）4,22,