补体和细胞因子的检测课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,补体的检测,补体的检测,一、补体概述,二、,单个补体成分的测定,三、,补体总活性测定,四、,补体结合试验,五、补体测定的应用,一、补体概述,一、概 述,补体（,complement,C,）,：由,30,余种广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面蛋白质组成的、具有精密调控机制的蛋白质反应系统，其活化过程表现为一系列丝氨酸蛋白酶的级联酶解反应。,在机体的免疫系统中担负,着抗感染和免疫调节作用,并参与免疫病理反应。,补体是天然免疫（,Innate immunity,）的重要组成部分。,一、概 述补体（complement,C）：由30余种广泛,补体系统的组成,补体的固有成分,经典途径,:C1q,、,C1r,、,C1s,、,C4,、,C2,；,MBL,途径：,MBL,、丝氨酸蛋白酶、,C4,C2;,旁路途径,:B,因子、,D,因子；,三条途径的共同末端通路,:C3,、,C5-C9,。,调节蛋白,：,备解素（,P,因子）、,C1,抑制物、,I,因子、,H,因子、,C4,结合蛋白等；促衰变因子（,DAF,）、膜辅助蛋 白（,MCP,）、同种限制因子（,HRF,）。,补体受体,：,CR1-CR5,、,C3aR,、,C2aR,、,C4aR,等。,补体系统的组成补体的固有成分,由,肝,细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生,均为多糖蛋白，大多数电泳迁移率属,、,球蛋白,含量约占血清球蛋白总量的,10%,，其中,C3,含量最高、,D,因子含量最低,固有成份间的分子量差异较大，其中,C1q,最大、,D,因子最小。,对热,不稳定,，,56C,、,30min,即被灭活，,0,10 C,条件下活性只能保持,3,4d,。通常保存要,-20 C,。,种属间含量有差异。,豚鼠,含量较高。,多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加剂等均可破坏补体,补体系统的理化性质,由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生补体系统的,5,激活途径,经典激活途径（,classical pathway,）,MBL,（,mannan-binding lectin,）途径,旁路途径（,alternative pathway,）,补体活化的共同末端效应（膜攻击阶段）,补体系统各成分通常以非活性状态存在于血浆中，在活化物作用下，补体发生复杂的级联反应，表现出生物学活性,激活途径 经典激活途径（classical pathway）,补体的生物学功能,补体系统的功能可分为两大方面：,补体在细胞表面激活并形成,MAC,，介导溶细胞效应；,补体激活过程中产生不同的蛋白水解片段，从而介导各种生物学效应。,C5678(9)n,细胞毒作用,，溶菌、杀菌,C3b,C4b,调理,吞噬和免疫粘附作用,免疫黏附,炎症介质,作用,补体的生物学功能补体系统的功能可分为两大方面：,常作为单个补体成分的检测指标：,C3,、,C4,、,C1q,、,B,因子和,C1,酯酶抑制物,等,测定方法：,免疫溶血法（检测单个补体成分的活性）,免疫化学法（检测单个补体成分的含量）,二、单个补体成分的测定,常作为单个补体成分的检测指标：C3、C4、C1q、B因子和C,补体,成分,分子量,(kD),电泳,区带,血清含量参考值,（,g/ml,）,补体,成分,分子量,电泳,区带,血清含量参考值,（,g/ml,）,C1q,390,2,70,C9,79,240,C1r,95,35,B,95,210240,C1s,85,35,D,25,2,C2,117,1,2030,P,220,2,25,C3,190,1,1300,C1INH,150,180,C4,180,2,430600,C4bp,1100,250,C5,190,2,75,I,因子,93,50,C6,128,2,60,H,因子,159,400480,C7,120,2,55,S,因子,88,500,C8,163,1,200,补体分子量(kD)电泳血清含量参考值补体分子量电泳血清含量参,9,血清,C3,测定,无论经典途径还是旁路途径,C3,都参与，可反映出补体的活化情况。,、,C3,增高,各种急性炎症、传染病早期、某些恶性肿瘤（以肝癌最明显）及排异反应等。,、,C3,降低,肾炎的病因鉴别：链球菌感染肾炎血清,C3,减少，病毒性肾炎血清,C3,含量正常。,免疫性疾病进展期：,SLE,，膜增殖性肾炎等。,血清C3测定,补体受体：,存在于多种细胞,清除免疫复合物、净化机体内环境,检测补体受体，有助于判断机体抗感染能力和计数相应的细胞数量,目前已知的补体受体归为以下五类：,CR1,（,CD35,）,CR2,（,CD21,）,CR3,（,CD11b/CD18,）,CR4(gp150/95,，,CD11c/18),C3aR/C5aR,补体受体：目前已知的补体受体归为以下五类：,名 称,别 名,CD,分类,配 体,细 胞 分 布,CR1,C3b,受体，,C4B/C3b,受体,CD35,iC3b,、,C3b,，,C4b,、,iC4b,，,C3c,红细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、,B,细胞、树突状细胞、肾小球上皮细胞,CR2,C3d,受体，,EB,病毒受体,CD21,iC3b,、,C3dg,、,C3d,、,EB,病毒、,IFN-,B,细胞、树突状细胞,CR3,iC3b,受体、,Mac-1,抗原,CD11b/CD18,iC3b,、植物凝集素、某些细胞多糖,中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、,NK,细胞,CR4,gp150/95,CD11C/CD18,iC3b,、,C3d,、,C3dg,中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板,C5aR/C3aR,CD88,C5a/C3a(,活化,G,蛋白,),内皮细胞、肥大细胞、吞噬细胞,名 称 别 名 CD分类 配 体 细 胞 分 布 CR1,12,定义,:,是根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应特征建立的单一补体成分检测法,指示系统,:,以,SRBC,（,sheep red blood cell,SRBC,）,-,抗,SRBC,为激活物和指示系统,参照体系,:,以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照,结果判读,:,若有溶血发生，表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分，且溶血程度与此补体成分的量呈正比，以,50,溶血,为终点,（一）免疫溶血法,定义:是根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应特征建立的,参照血清常称之,“,R,（,remove,）”试剂,，即去除某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人,C2,缺乏、豚鼠,C4,缺乏、小鼠,C5,缺乏和家兔,C6,缺乏的血清,免疫溶血法常用于,C2,、,C3,、,C4,、,C5,、,C6,等补体成分的检测。其中以,C3,、,C4,两成分的检测更为常见,检测的是某补体活性而非含量,操作简便、快速、灵敏；不足之处在于红细胞和溶血素的制备困难。,参照血清常称之“R（remove）”试剂，即去除某种补体成分,免疫化学法分类,1.,单向免疫扩散平板法,2.,火箭免疫电泳,3.,散射比浊法,4.,纳米金聚集复合物放大计时电位法,5.,基于银增强金标记物的阳极溶出伏安免疫分析法,前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差，已趋于淘汰,后三种方法：通过仪器对补体的,C3,、,C4,、,B,因子等单个成分进行自动化测定,（二）免疫化学法,免疫化学法分类（二）免疫化学法,散射比浊法,原理,补体和相应抗体反应的,IC,微粒引起液体浊度改变，激光照射到,IC,微粒上发生光线散射，散射光强度与,IC,量正相关建立的补体单个成分定量检测法。,评价,反映所测补体成分的绝对量,可进行标准化流程管理与质量控制,目前检测补体,最常用,的方法,散射比浊法 原理,CH50,测定法,速率溶血法,脂质体免疫检测法,：,操作简单快速，血清用量少，准确度、精密度、特异性均较高，稳定性好，可自动化分析,三、补体总活性测定,CH50测定法三、补体总活性测定,以,红细胞的溶解,为指示，以,50%,溶血为判断终点，称为,50%,溶血实验,（,50%complement hemolysis,）,即,CH50,。,应用绵羊红细胞,（,SRBC,）,和其相应的抗体（,溶血素,），作为能诱导补体活化经典途径的,指示物,和,激活剂,。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性相关。,将新鲜待检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血程度，以,50%,溶血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补体总溶血活性。,（一）,CH50,测定法的原理,以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，称为50%溶血,溶血程度与补体含量的关系,在适当、稳定的反应系统中，溶血反应与补体的剂量依赖关系呈现“,S,”,形曲线,在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变化对溶血程度的影响不大，即溶血对补体量的依赖不敏感。但在,30,70%,溶血时，补体含量仅出现较小的变动，溶血程度也会发生较大的改变,溶血程度与补体含量的关系 在适当、稳定的反应系统中，溶血反应,1.,红细胞浓度的调整,SRBC,采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或用阿氏（,Alsever,）血液保存液制成抗凝血，,4,保存备用。使用前，调制成,2%,5%,SRBC,悬液。为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，加入,20,30,倍的稀释液，在,542nm,波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。,（二）,CH50,测定方法,1.红细胞浓度的调整SRBC采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或,2.,溶血素滴定,溶血素可通过,SRBC,免疫家兔获得，一般无需纯化,试验前需先行加热,56 30min,或,60 3min,以,灭活,补体,溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用,自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补体活性测定中，大多使用,2,个单位。,溶血素效价稳定，一般使用,3,个月后再作重新滴定,2.溶血素滴定溶血素可通过SRBC免疫家兔获得，一般无需纯化,3.,稀释缓冲液,:,磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液,4.50%,溶血标准管,5.50%,溶血总补体值的计算,3.稀释缓冲液:磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液,CH50,试验测定的是,经典途径总补体溶血活性,，所反映的是补体,9,种成分的综合水平。,方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比外，还与反应所用的缓冲液、,SRBC,的数量以及反应温度有关,总补体活性的参考范围为,50,100U/ml,CH50,增高,见于：急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等,CH50,降低,见于：统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎、急性肾小球肾炎；补体大量丢失：外伤、手术和大失血；补体合成不足：肝硬化、慢性肝炎和重型肝炎。,（三）方法评价与临床意义,CH50 试验测定的是经典途径总补体溶血活性，所反映的是补体,补体结合试验,(complement fixation test,，,CFT),将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法。,四、补体结合试验,补体结合试验(complement fixation tes,5,种成分，,3,个系统,检测系统,：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）,补体系统,：（补体的作用无特异性，既能与检测系统中的抗原抗体复合物结合，也能与致敏绵羊红细胞结合）,指示系统,：,SRBC,与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（,sensitized sheep red blood cell,，,SRBCS,）。,反应系统与指示系统,争夺,补体系统，,先,加入反应系统给其以优先结合补体的机会。,5种成分，3个系统,反应分两步进行,第一步,:,检测系统与补体的作用,第二步,:,指示系统利用剩余补体的反应,不溶血为补体结合试验,阳性,，而溶血为试验,阴性,反应分两步进行 不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性,（一）试剂的准备,1.,抗原或抗体,用于试验的抗原或抗体,:,需要纯化,纯度愈高，特异性愈强,抗原与抗体比例适当,:,确定抗原或抗体相应的使用单位,采用方阵或棋盘法进行抗原与抗体滴定,补体结合试验方法,（一）试剂的准备1.抗原或抗体补体结合试验方法,由于该试验基于指示和试验两对抗原抗体系统竞争补体，因此，补体必须恒量，且以满足指示系统的溶血为度，,过多会导致,假阴性,，,过少则引起,假阳性,。,2.,补体,采用豚鼠血清为补体,对补体进行滴定和确定其用量，以能产生完全溶血的最少补体用量为,1,个实用单位,正式试验时使用,2,个实用单位,补体的性质不稳定，每次试验前均应进行滴定,由于该试验基于指示和试验两对抗原抗体系统竞争补体，因此，补体,血清标本遇有抗补体现象时，,可作下列处理：,加热灭活时提高,12,20,冻融后离心去沉淀,以,3mmol/L,盐酸处理,加入少量补体后再行灭活,以白陶土处理,通入,CO2,以小白鼠肝粉处理,用含,10,新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清,3.,待测标本,采血并及时分离血清用于检测或,20,保存备用。,试验前，应先将血清,56,加热,30min,以灭活补体。,血清标本遇有抗补体现象时，3.待测标本采血并及时分离血清用于,（二）,正式试验,分类,:,小量法、微量法。以,小量法,常用,(,抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加,0.1ml,，补体,0.2ml),。,实验过程,:,稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、不同含量的补体温育,与指示系统共育,结果判度,:,对照管,:,阴性对照管,:,溶血,阳性对照管,:,不溶血,抗体或抗原对照管,:,完全溶血,待检血清对照管,:,完全溶血,绵羊红细胞对照管,:,不出现自发性溶血,（二）正式试验 分类:小量法、微量法。以小量法常用(抗原、抗,补体对照管：,受检血清,阳性,:,不溶血,阴性,:,溶血,注意,:,若上述各对照管不出现预期结果，则试验结果不可靠，其可能原因应根据出错的对照管进行分析。,2,个单位,:,全溶,1,个单位,:,全溶或略带少许红细胞,0.5,个单位,:,不发生溶血,2个单位:全溶,优 点,灵敏度高、所测定的抗体或抗原水平可达,0.05g/ml,，,出现交叉反应的机率较小，,可检测的抗原或抗体范围广泛，,无需特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高,现 状,影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等，,现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被遗弃,补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用,方法评价,优 点方法评价,图,1,抗原（,Ag,）与抗体（,Ab,）结合形成免疫复合物（,IC,）,图,2,免疫复合物与补体结合，使补体发生作用，失去活性。,Ag,Ag,Ag,Ag,图,1,图,2,Ab,补体（,complement,）,摘自 张晓延老师,图1 抗原（Ag）与抗体（Ab）结合形成免疫复合物（IC,SRBC,图,1,绵羊红细胞与溶血素（,hemolysin,）即抗绵羊红细胞结合，形成致敏绵羊红细胞（,SRBCs,）。,图,2,致敏绵羊红细胞与补体结合，使其激活，补体发生溶细胞作用，引起红细胞肿胀，发生溶血。,图,1,图,2,SRBC,SRBC,补体,(complement),SRBC,SRBC,hemolysin,SRBCs,SRBCs,SRBC图1 绵羊红细胞与溶血素（hemolysin）即,检测系统,Ag,Ag,Ab,未知,未知,不存在,未生成,Ag,检测系统AgAgAb未知未知不存在未生成Ag,检测系统,已知,已知,检测系统已知已知,指示系统,SRBC,SRBC,hemolysin,SRBCs,指示系统SRBCSRBChemolysinSRBCs,补体系统,SRBC,SRBC,SRBC,complement,SRBCs,Ag,Ag,complement,补体系统SRBCSRBCSRBCcomplementSRBC,补体系统,Ag,Ag,SRBC,SRBC,SRBCs,无溶血现象,补体系统AgAgSRBCSRBCSRBCs无溶血现象,待测物存在,待测物不存在,在反应的第一阶段，抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物与补体结合。,在反应的第二阶段，没有游离补体，致敏绵羊红细胞不溶解，不发生溶血现象。,在反应的第一阶段，抗原没有与抗体结合，没有形成抗原抗体复合物，反应液中有游离补体存在。,在反应的第二阶段，补体与致敏绵羊红细胞结合，使其溶解，发生溶血现象。,待测物存在待测物不存在在反应的第一阶段，抗原与抗体结合形成抗,第一阶段,待测物存在,第一阶段待测物存在,第二阶段,指示系统未与补体结合,第二阶段指示系统未与补体结合,第一阶段,待测物不存在,第一阶段待测物不存在,第二阶段,指示系统与补体结合,第二阶段指示系统与补体结合,反应不发生溶血，证明待测物存在，试验结果,阳性,。,反应发生溶血，证明待测物不存在，试验结果,阴性,。,结果,反应不发生溶血，证明待测物存在，试验结果阳性。反应发生溶血，,临床应用,补体结合试验最早应用于梅毒的检测。,补体结合试验曾广泛的应用于临床微生物学检验中，比如：细菌、病毒、衣原体、立克次体等微生物所致疾病的血清学诊断。,在对,SARS,的诊断中，补体结合试验的灵敏度要高于直接做病毒的分离培养。,临床应用补体结合试验最早应用于梅毒的检测。,应用于补体含量和活性检测的试验,CH50,试验，速率溶血法脂质体免疫检测法,:,反映总补体活性,免疫溶血试验,免疫化学试验,免疫荧光技术,检测补体单个成分及其裂解产物（,C1q,、,C3SP,、,C3,、,C4,、,B,因子等）和补体受体,补体检测方法小结,应用于补体含量和活性检测的试验检测补体单个成分及其裂解产物（,1,、诊断病原体感染,2,、检测补体的功能,3,、补体单个成分及其裂解产物的测定,4,、相关疾病时补体的检测,（,1,）免疫性疾病,（,2,）与补体有关的遗传性疾病,（,3,）补体含量显著降低的疾病,（,4,）高补体血症,5,、补体参与的试验,6,、流行病学调查,7,、补体应用于临床治疗后的检测,五、补体测定的应用,五、补体测定的应用,补体含量和活性相关的疾病,1,免疫相关性疾病：,如自身免疫性疾病时，,C1,、,C2,、,C3,、,C4,和,Hf,等缺陷；,超敏反应时（,III,型超敏反应），,C3a,、,C5a,等过敏毒素的产生。,2,与补体有关的遗传性疾病：,C2,、,C3,缺陷导致的严重感染；,与,C1,抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿,SLE,患者出现的细胞表面,CR1,缺陷与,C1C,清除障碍,涉及,I,因子、,H,因子缺陷的肾小球肾炎；,DAF,缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；,C1q,缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及,C1q,、,C1r,、,C4,、,C2,缺陷造成的免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。,(,图,),血管神经性水肿,补体含量和活性相关的疾病1免疫相关性疾病：(图)血管神经性,49,3,补体含量显著降低的疾病,：,消耗增多,:,免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多,.,如,SLE.,补体的大量丢失,:,主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者,补体合成不足,:,常见于肝脏疾病患者或营养不良的病人。,4,高补体血症：,偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。,补体和细胞因子的检测课件,1,、掌握,CH50,试验的原理及方法学评价,2,、掌握补体结合试验的原理及结果解释,3,、熟悉补体检测方法的分类,要 求,1、掌握 CH50 试验的原理及方法学评价 要 求,