蛋白酶类课件

5.2,、蛋白酶类,蛋白质：由,20,多种氨基酸通过肽键（,CO,NH,）连接成为多肽，再由多肽聚合成大分子庞大的蛋白质。,蛋白酶：催化蛋白水解，分解蛋白质生成胨、腙、多肽、氨基酸一类酶。,蛋白酶的分类：,1,、按蛋白酶作用方式分为,（,1,）内肽酶,(,endopeptidase)：从蛋白质或多肽内部切开肽键生成分子量较小的多肽。,（2）外(端)肽酶(exopeptidase)：又分为氨肽酶、羧肽酶。,氨肽酶：从蛋白质或多肽分子的氨基末端水解肽键，而游离出氨基酸。,羧肽酶：从蛋白质或多肽分子的羧基末端水解肽键，而游离出氨基酸。,2,、根据蛋白酶的活性中心分为四类：,（,1,）丝氨酸蛋白酶：酶的活性中心含丝氨酸。如胰蛋白酶、碱性蛋白酶。,（,2,）巯基蛋白酶：活性中心含巯基（,-SH,）。如木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶,。,（,3,）金属蛋白酶：活性中心含,Zn,2+,、,Ca,2+,等金属离子。如枯草杆菌中性蛋白酶。,（,4,）羧基蛋白酶：活性中心含天门冬氨酸等酸性氨基酸。如米曲霉、黑曲霉产生的酸性蛋白酶。,3,、按蛋白酶来源分为动物、植物和微生物蛋白酶,（,1,）动物蛋白酶,:,如胰蛋白酶（,Pancreatic Proteinases,）、胃蛋白酶（,Pepsin,）、凝乳酶（,Rennin,）,（,2,）植物蛋白酶：,木瓜蛋白酶,(Papain),：最适,pH5-7,，作用,pH,范围,3-9;,最适温度,65,，作用温度范围,30-70,，生成产物：氨基酸。,菠萝蛋白酶,(Bromelain),、无花果蛋白酶,(Ficin),：,（,3,）微生物蛋白酶,酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶,从猪、牛或羊胰脏中提取、精制的多酶混合物，含有胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。,pH,稳定性：,pH7.5-8.5,之间较稳定，作用最适,pH8.0,，低于,6.0,或高于,9.0,失活严重。,热稳定性：在,pH7-8,条件下，,40-50,较稳定，超过,55,酶活不稳定，,65,以上很快失活。作用最适稳定,45,。,金属离子对酶活的影响：,Mn2+,Ca2+,Mg2+,激活酶；,Cu2+,Hg2+,Al3+,抑制酶活。,胰酶,木瓜蛋白酶（,Papain,）,木瓜蛋白酶是从木瓜果实中提炼而得的纯天然生物酶，它是由,212,个氨基酸组成，分子量为,21000,，属于含巯基（,SH,）肽链内切酶，其活性受氧化剂氧化或重金属抑制。具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的酶解能力，同时还具有合成的能力，可把蛋白质水解物再合成蛋白质类物质，这种能力可用来改善动植物蛋白的营养价值或功能性质。,适用条件：,最适反应温度,50,65,，最适,pH,值,7.0,；添加量一般为,0.1-0.3%,以原料计。,木瓜蛋白酶具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，可广泛用于食品、医药、日化、饲料、皮革及纺织等行业，提高产品质量与档次，降低成本。,木瓜蛋白酶的应用,木瓜蛋白酶具有酶活高、热稳定性好、天然安全等特点，广泛用于食品、医药、日化、饲料、皮革及纺织等行业，提高产品质量，降低成本。,1,、食品工业：利用木瓜蛋白酶的酶促反应，可把食品中大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，可制成肉类嫩化剂、酒类澄清剂、饼干松化剂、保健食品、高级口服液等，提高食品的营养价值，更有利于消化吸收。,2,、医药工业：,含木瓜蛋白酶的药物，可起到消炎、利胆、止痛、助消化的功效，进一步研究表明亦可治疗妇科病、青光眼、昆虫的叮咬等。,3,、纺织工业：羊毛的防缩：用木瓜蛋白酶处理过的羊毛，其抗张度比常规方法高，毛线手感柔软，收缩性为,0,；还可用于蚕的脱胶和蚕丝的精炼。,4,、皮革工业：利用木瓜蛋白酶制成皮的脱毛剂，鞣制皮革，经本品鞣制的皮革，毛孔细致光亮。,5,、饲料工业：加入饲料配方中或直接与混合饲料混合饲喂，可提高蛋白质的利用率和降低饲养成本，还可利用本品水解蛋白，开发新的蛋白源。,6,、化妆品：加入含蛋白质和油脂的化妆品中，可起到保健、清洁皮肤、促进血液循环的作用。,7,、此外还可加入洗涤剂的配方中，辅助除去蛋白质为主的污点，加牙膏、漱口水、牙粉等配方中可清洁口腔，除去牙垢和牙结石，与其它溶剂配合可制成隐形眼镜的清洁消毒剂等。,菠萝蛋白酶（,Bromelin,）,是从菠萝水果茎、叶、皮等部分，经精制、提纯、超滤浓缩、低温冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。该酶已被广泛应用于食品、医药等行业。,生物技术制得的一种纯天然植物蛋白酶，其分子量为,33000,，等电点,pI,为,9.55,。,菠萝蛋白酶为富有菠萝香气浅黄棕色或浅灰色粉末，菠萝蛋白酶属于疏基蛋白酶，其活性中心为疏基（,SH,）能进行蛋白质水解等各种生化反应，它可广泛应用于食品、医药及生物等行业。,菠萝蛋白酶使用条件,最适反应温度,45,，最佳温度因底物的种类及浓度不同而有所改变。,最适,pH,值,6-7,，最适宜,pH,因底物的种类、浓度不同而有所改变。,添加量一般为,0.21.0%,，根据不同底物作适当增减，反应时间在,3-8hr,作相应缩短或延长。,到本世纪初，已经报导的微生物蛋白酶超过,900,种。目前我国生产的微生物蛋白酶主要有：,1,、,酸性蛋白酶,，由,黑曲霉,As3.350,，,宇佐美曲酶,537,生产，最适,pH2.5-3.0,，稳定,pH2-6,最适反应温度,47-55,，,55,失活。,2,、中性蛋白酶,由,枯草芽孢杆菌,1.398,生产，最适,pH7.0,稳定,pH5.5-8.5,；最适反应温度,45,，,60,易失活。,栖土曲霉,3.492,中性蛋白酶，最适,pH7.5,及,10,，稳定,pH5-10,；最适反应温度,45,，,50,以上迅速失活。,放线菌,166,中性蛋白酶，最适,pH 7.0-8.0,；最适反应温度,40,，,40,以上易失活。,微生物蛋白酶,3,、碱性蛋白酶,由短小芽孢杆菌,209,生产的碱性蛋白酶，最适,pH10,稳定,pH9-11,；最适反应温度,45-50,，,40,稳定。,由短小芽孢杆菌,289,生产的碱性蛋白酶，最适,pH10,稳定,pH9-11,；最适反应温度,45-50,，,40,稳定。,由,地衣芽孢杆菌,2709,生产碱性蛋白酶,，最适,pH10-12,稳定,pH7-12,；最适反应温度,45-50,，,50,稳定。,大豆多肽,Alcalase,2.4L FG,碱性内切蛋白酶,/Protamex,复合,蛋白酶,/Flavourzyme,500 MG,风味蛋白酶,将大豆蛋白,(,大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白等,),水为大豆多肽，提高大豆蛋白的溶解性及功能特性，用作饮料、奶制品、老年及婴幼儿食品的蛋白补充剂和营养补充剂。,动物来源蛋白抽提物及肉味香精基料,Protamex,复合蛋白酶,/Flavourzyme,500MG,对原料肉、肉渣、骨、血等动物加工副产品进行水解，生产功能,性骨、肉提取物（骨素）、水产提取物、蛋白胨、肽等，保证,原料较彻底的水解及最终产品度较高蛋白质利用率，产品风味醇,厚自然，毫无苦味之干扰。,酵母抽提物,Alcalase,2.4 L FG/Flavourzyme,500MG,水解酵母生产酵母精，提高最终产品的蛋白质利用率及风味。,Flavourzyme,500 MG,风味蛋白酶,风味蛋白酶 彻底水解动植物蛋白，祛除苦味肽，增加产品优良风味等。,酵母抽提酶,酵母水解专用酶制剂酵母抽提酶，它是一种含内切酶、外切酶、风味酶及,5,-,磷酸二脂酶的复合酶，其能将酵母中的,RNA,水解，产生,5-,核苷酸（,RNT,），生成呈味成份,5-,鸟苷酸（,GMP,），再在酶的作用下，将,S-,腺苷酸转化成,5-,肌苷酸（,IMP,），从而制得强呈味力的酵母抽提物。酵母抽提酶具有酶解速度快、分解率高、水解物氨基酸含量高、苦味小、呈味性强、使用方便等特点。,蛋白酶用于功能性肽的制造,由,2-3,个氨基酸构成的小肽，在肠道的吸收性甚至比氨基酸还要好。一些矿物元素通过与小肽的结合更容易被机体所吸收。,不少小肽类还具有特殊的生理功能，如降血压、降血脂、促进胰岛素分泌、活化巨噬细胞增强免疫力以及抑制血小板凝聚，控制食欲、镇疼、醒酒、抗疲劳、增强机体耐力等的功能。,用胰酶水解酪蛋白得到的一种,10,肽（,Arg.Glu.Ser.p.Leu.(Ser)4.4P.Glu.Arg,），叫酪蛋白磷酸肽（,CCP,），具有促进钙铁吸收的作用，是众所周知的补钙功能性食品配料。,由大豆蛋白、鱼肉蛋白、酪蛋白酶水解得到的一种可有,2-12,个氨基酸组成的抑制血管紧张素的小肽（,ACEIP,），可控制血压，因不像化学合成的血管紧张素抑制剂（,ACEI,）那样会对肾脏有损害。,从酪蛋白及小麦面筋蛋白的蛋白酶水解物中发现的另一种肽，阿片肽（,Opiate peptides,），能与阿片受体（,Opiate receptor,）结合，产生类似阿片的生理效应，例如情绪和食欲的调控、镇疼等功能。,高,F,值寡肽：用玉米蛋白酶水解生成的一些含亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等疏水性支链氨基酸和谷氨酸、脯氨酸多而含赖氨酸等碱性氨基酸少的肽（高,F,值低聚肽）可缓解肝病患者因芳香族氨基酸同化受阻引起氨基酸不平衡造成的肝昏迷。,从血红蛋白水解物中发现了可降低甘油三酯的肽类，其中以,Val-Val-Tyr-Pro,的效果最佳。,人们发现不少在动物体中与调节食欲有关的激素是称作神经传递肽（,Neuropeptides,）的物质，它可分为促进食欲和抑制食欲的两大类。从牛奶酪蛋白羧基端的一个由,64,个氨基酸构成的大肽（,Caseinomacropeptide,，,CMP,）通过诱发产生抑制食欲的激素,CCK,（缩胆半肽）而可能有抑制食欲的作用。,动物体中的,CHP,（环,-His-Pro,）是一种有抑制食欲作用的神经传递肽，也已从肉类、面粉制品、巧克力、牛奶、鱼类等食物中发现，如果能够制造成功则，对减肥人士是一个福音。,大豆肽是研究的最多的功能性肽，在日本已成为运动员、演艺人员和脑力劳动者普遍食用的保健食品。,研究表明大豆肽在小肠的吸收速度是大豆蛋白的,4,倍，是氨基酸的,1.5,倍，摄取后,20,分钟便达吸收的高峰，大豆肽可促进成长激素的生成，促进肌肉生长，对消除疲劳，缓解肌肉酸疼，增强体力十分有效，还具有增强免疫功能、降血脂、降血压等功能，大豆肽已广泛使用于饮料、点心、及各种食品中。推荐摄取量是每日,4g,。大豆肽在我国也已大量生产，应用试验表明生理效果良好，但使用尚不普及，产品的脱苦问题尚待解决。,角蛋白酶,角蛋白的特性,角蛋白存在于许多脊椎动物的外骨骼结构中，如毛发、鳞片、羽毛、蹄、角、鼻和爪等，是一种坚韧的不溶性蛋白。一般来说，,“,硬,”,角蛋白（如动物的蹄和角）含硫量较高（约占干重的,5%,），,“,软,”,角蛋白（如人的表皮）含硫量较低（约占干重的,1%,）。,角蛋白分为两类：未拉伸的羊毛纤维产生的重复间距,5.1A,，一种螺旋式卷曲的多肽，这类角蛋白称为,角蛋白。,拉伸的纤维给出间距为,3.3A,，多肽是充分伸展的，这类角蛋白称为,-,角蛋白。,角蛋白的特性,角蛋白所具有的不溶于水和抗分解的性质主要决定于以下几个方面：,胱氨酸残基所提供的分子间双硫键的高度交联；氢键的作用；分子间的相互疏水作用。,角蛋白化学结构稳定，它不能被一般的蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）水解，但能被角蛋白酶水解。,角蛋白酶（,Keratinase,）,角蛋白酶（,Keratinase,）：它是一种复合蛋白酶，含有二硫键还原酶和多肽水解酶等多种酶活性组分，其中，二硫键还原酶是分解角蛋白的关键酶，二硫键还原酶首先作用于角蛋白中的二硫键，使角蛋白高级结构解体形成变性角蛋白，然后变性角蛋白在多肽水解酶的共同作用下逐步水解成多肽，寡肽和游离氨基酸，使角蛋白彻底分解。,在角蛋白降解过程中，角蛋白中二硫键也随之转化成巯基化合物、硫化氢和硫酸盐,3,种含硫化合物形式存在于分解产物中。,角蛋白降解过程，其中巯基化合物是由二硫键还原酶裂解角蛋白中的二硫键而形成；硫化氢是由巯基化合物或巯基氨基酸在脱氢氧化酶作用下，脱氢、脱氨基而形成；硫酸盐的形成由硫化氢或巯基化合物,中硫通过氧化酶逐步氧化的结果。,角蛋白酶（,Keratinase,）,能产生角蛋白酶的菌种有：,放线菌主要是链霉菌类,弗氏链霉菌,221(Streptomyces fradie),，链霉菌,Streptomyces pactumDSM40530,Thermoactinomyces,candidus,白色嗜热放线菌。,地衣芽孢杆菌,(,Bacillus licheniformis),PWD-1,，,皮肤类真菌，如黄癣中分离的,Trichophyton mentageroghytes,，,癣毛癣菌、,Trichophyton simiiHN 50,、微孢长囊头孢霉菌等。,硫酸钠，亚硫酸钠和巯基乙醇对角蛋白酶具有强烈的激活作用，使角蛋白酶活力分别依次提高了,4,，,7,和,20,多倍，其主要表现作用于角蛋白酶中的二硫键还原酶。亚硫酸钠在,0.01mol/L,浓度下不仅作用于二硫键还原酶，而且还作用于多肽水解酶。,角蛋白酶的应用,角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性，其在生物医药、美容、废物处理及动物饲料生产等方面具有广阔的应用前景。,微生物产生的角蛋白酶能用于毛发的水解，废弃物的利用（如羽毛粉,皮革粉等），使角蛋白降解为多肽和氨基酸，既可用于畜禽的饲料蛋白又可饲料添加剂使禽兽增重。,角蛋白降解物还可以用于制造有机肥料，如用途广、肥效高的新型功能性氨基酸叶面肥。,角蛋白酶能改善皮肤外用药物在硬蛋白中的通透性，有助于伤口去痂、上皮再生和皮肤病的治疗。,角蛋白酶还可用于皮革脱毛鞣制，配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容品。,应用于纺织的羊毛整理。,角蛋白酶可以强力分解导致疯牛病的变异,prion,蛋白,(,朊病毒蛋白,),，适合用来清洗被这种蛋白污染过的器具，对防止疯牛病传染大有帮助。,弹性蛋白,弹性蛋白,(Elastin),是结缔组织中的另一种蛋白质。它的最重要性质就是弹性，因此得名,。,弹性蛋白纤维主要存在于血管特别是,大动脉管以及韧带,等，使其具有伸展性。弹性纤维与胶原纤维共同存在,赋予组织以弹性和抗张能力。,弹性蛋白富含,Gly,甘氨酸、脯氨酸,Pro,、丙氨酸,Ala,、和,缬氨酸Val，但与胶原不同的是，弹性蛋白的羟基化程度不高，没有羟赖氨酸的存在。弹性蛋白分子间通过赖氨酸残基形成共价键进行相互交联，它们形成的交联网络可通过构型的变化产生弹性。,弹性蛋白拉伸与放松时状况,弹性蛋白酶,弹性蛋白酶（,Elastase,）：,是一种肽链内切酶,是一种以分解不溶性弹性蛋白,(Elastin),及弹性纤维蛋白的广谱蛋白水解酶，它可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得。,不同来源的弹性蛋白酶的特点、性质、分子量不尽相同。最适作用,pH,大于,7,，属于碱性蛋白酶。,弹性蛋白酶能降解弹性蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质，是一种广谱的肽链内切酶。,在动物体内,其含量水平与动脉粥样硬化症有关，因此该酶主要用作治疗高血脂症、防治动脉粥样硬化的药物。,弹性蛋白酶的用途,弹性蛋白酶是一种生化药物，对治疗高血脂症、防治动脉硬化症疗效甚佳，表现在（,1,）使动脉壁弹性、伸展性回复；（,2,）防止主动脉冠动脉斑块的形成；（,3,）分解乳糜粒，改善血清脂质水平；（,4,）改善脂蛋白代谢，,由于该酶能够高度专一水解结缔组织中的胶原蛋白和硬蛋白,而不破坏其它成分，达到肉类软化而不失其口味的目的，优于目前普遍使用的肉类软化剂，因此该酶在食品加工领域也有广泛的应用前景。,弹性蛋白酶添加到化妆品中，能增进、改善皮肤的血液循环，改善皮肤脂质代谢，增强皮肤弹性、毛发的弹性、柔性、延缓皮肤老化，防止脱发。用弹性蛋白酶生产弹性蛋白低分子量弹性蛋白水解物，此低分子量弹性蛋白水解物，与皮肤天然成分相似，营养成分高，具有消除皮肤皱纹、抑制皮肤老化，促进皮肤弹性纤维的新生，保持皮肤弹性效果的作用，效果显著。,弹性蛋白酶的产生,（,1,）从猪胰脏中提取，胰脏经捣碎后，得粗提液，经离子交换树脂吸附、洗脱后，沉淀干燥获得。,（,2,）由微生物生产，能生产弹性蛋白酶的微生物有：铜绿假单胞杆菌（,Pseudomonas aeruginosa,IFO3455,）、黄杆菌（,Flavobacterium immotum,9-35,Flavobacterium,sp.17-87,）,;,放线菌属的,Actinomyces rimosus,Actinomyces fadiae,；曲霉属的,Aspergillus versicolor,。但微生物来源的弹性蛋白酶在应用于医药工业和食品工业之前，需进行药理、毒理和药效试验后，证明是安全有效，才能得到应用。,应用,医药：可治疗高血脂、防治动脉粥样硬化、抑制脂肪肝发展、治疗慢性支气管炎及其他结缔组织纤维增生性疾病，也可外用于皮肤烧伤或皮肤溃疡等症。,食品：用于农副产品的深加工和高蛋白食品的制作和作为理想的肉类嫩化剂。,日用化工：加入化妆品中，可改善肤质，延缓衰老，防止色素沉淀和脱发。可制成低分子弹性蛋白水解物，保持皮肤弹性。并可取代传统的酸水解法。,产酶微生物,弹性蛋白酶活性测定,通过与染料偶联的不溶性底物被酶作用而溶解至水相。反应上清液的光密度反映底物被酶消化的程度。,称取,20 mg,刚果红,-,弹性蛋白。溶于,1 mL,水中，加,1 mL pH7.4,、,0.2moL,L,硼酸缓冲液，,1mL,稀释的酶液，,37,振荡反应,20min,。加入,2mLpH 6.0,、,0.7moL,L,磷酸钠缓冲液终止反应。过滤后测定上清液在,495nm,处的光密度值。以不加酶液和底物的反应液为空白。在此反应条件下溶解,1mg,刚果红,-,弹性蛋白底物所需的酶量定义为,1,个弹性蛋白酶活性单位,(U),。,中国科学院从西藏天然碱湖中筛选到一株产生胞外碱性弹性蛋白酶的嗜碱菌,Bacillus,sp.XE22-4-1,，酶活力达,300U/ml,，是目前报道的产弹性蛋白酶活力最高的菌株。通过系统发酵条件试验，获产酶最佳数据。,500,毫升摇瓶培养，酶活力达到,270u/ml,，,2,立升罐发酵，发酵周期,48,小时，,pH10.0,下连续四批发酵，酶活力稳定在,250-260u/ml,。急性毒性试验表明菌体和酸液样品均属无毒物质。可用于食品工业和日用化工，以上试验结果表明该酶生产工艺可进入中试扩大试验阶段。,前景展望,由于弹性蛋白酶价值高、应用广泛，因此微生物发酵法必然取代传统的脏器提取法,目前限制其大规模工业生产的因素主要有两个方面,1.,高产菌株的筛选：扩大筛选范围，广泛筛选高产和具有更好性质的弹性蛋白酶产生菌,2.,产生菌安全性的评估和相应改造：通过敲除造成毒性和不稳定、低表达的基因，引入具有相应优良性质的基因，可以构建高产安全的基因工程菌,通过对高产的安全菌株进行发酵工艺的优化，将会实现弹性蛋白酶高效的生产。,胶原蛋白酶,胶原是皮肤、肌腱和软骨的主要成分，组成哺乳动物总蛋白的,25,33,，在几乎所有器官的结缔组织中都有分布。,胶原蛋白酶,(Collagenase,，,E.C 3.4.24.3),是作用于胶原或其变性明胶而不作用其他蛋白质的酶类。它来源广泛，多种微生物以及动物的许多组织细胞都可以产生胶原蛋白酶。,至少从不同细菌和真菌中获得,40,余种胶原蛋白酶，目前已发现溶组织梭菌、溶藻弧菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、火神发光杆菌、铜绿假单胞菌等微生物能产生胶原蛋白酶，并不断发现新的产胶原蛋白酶的微生物。但由于它们大多来源于致病菌株，目前能够商业化生产的胶原蛋白酶的菌株很少。,胶原蛋白酶应用,1,）在医学研究中可用于治疗椎间盘突出症等。,2,）实验室研究中作为工具酶应用于细胞和器官的分离，基础研究中可应用于胶原结构的研究。,3,）工业开发中可应用于胶原分级降解以获得胶原多肽。,胶原蛋白酶测定方法,以,III,型酸溶性胶原为底物。,反应体系为,:1mg/mL,胶原,200,L，0.1moL/L pH 7.5 Tris-HCl(含50mM CaCL2)300L，酶液100L，37反应0.5h，1 0%三氯乙酸终止反应，以先加终止液的相同反应物为对照。,茚三酮显色法测定反应所释放的水溶性氨基酸、短肽，以甘氨酸显色制定标准曲线。,酶活力单位定义为:在37，pH7.5条件下，每分钟水解胶原产生相当于l g甘氨酸的酶量为1 个酶活力单位(U)。,工业蛋白酶的主要性质,酶 类型,pH,范围 特异性 应用,动物,Rennet,牛凝乳酶 天冬氨酸,3-6 Glu-Ala,牛奶凝结剂,Chymosin,凝乳酶,Leu-Val,很专一,Chymotrypsin,胰凝乳 丝氨酸,8-9 Phe,Tyr,分析用,蛋白酶,Trp-COOH,脱敏,Panceratin,胰酶 混合型,7-9,宽 一般水解,Pepsin,胃蛋白酶 天冬氨酸,1-4 Leu-Val,干酪，酪蛋白水解,Phe-Tyr,普通水解,Trypsin,胰蛋白酶 丝氨酸,7-9 Lys-Ala,皮革,Arg-Gly,临床,工业蛋白酶的主要性质,酶 类型,pH,范围 特异性 应用,细菌中性蛋白酶,B.subtilis,金属,6-8,宽 一般水解，,酿造，干酪,B.licheniformis,丝氨酸,6-10,宽 明胶,细菌碱性蛋白酶,B.thermo-proteolyticus,金属,7-9 Ileu-Phe,一般水解，热稳定,Leu-Val,Bacillus spp,.,丝氨酸,7-12,宽 皮革、洗涤剂,工业蛋白酶的主要性质,酶 类型,pH,范围 底物特异性 应用,霉菌酸性,-,中性蛋白酶,Aspergillus niger,天冬氨酸,2-5,纯化酶同胃蛋白酶 干酪,和一些羧基混合型 未纯化酶，底物宽,His-Leu,一般水解,Phe-Phe,，脱苦,Endothia parasitica,天冬氨酸,3-6,同牛凝乳酶 牛奶凝结剂,Mucor spp.,天冬氨酸,3-6,同牛凝乳酶 牛奶凝结剂,Penicillium spp.,羧基混合型,2-5,宽 一般水解,Gly-Phe,脱苦,Rhizopus,spp.,天冬氨酸,3-5,同牛凝乳酶 一般水解,Trametes sanguinea,天冬氨酸,2-4,很宽 一般水解,（,血红栓菌）,一些羧基型,工业蛋白酶的主要性质,酶 类型,pH,范围 底物特异性 应用,霉菌中性,-,碱性蛋白酶,Aspergillus oryzae,天冬氨酸型,4-8,很宽 一般水解,金属型,Leu-Tyr,脱苦,羧基型,Phe-Tyr,丝氨酸型,Streptomyces griseus,混合氨基酸,7-9,很宽 仅用于,和羧基型 研究与分析,工业蛋白酶的主要性质,酶 类型,pH,范围 底物特异性 应用,植物蛋白酶,(Fig latex,ficin),无花果蛋白酶 半胱氨酸,5-8 Phe-Tyr,(papaya fruit,papain),木瓜蛋白酶 半胱氨酸和,5-9,很宽 一般水解，,混合型,Asn-Gln,热稳定，,Glu-Ala,产生风味,Leu-Val,Phe-Tyr,(,Pineapple,，,Stem and fruit,Bromelain),菠萝蛋白酶 半胱氨酸,5-8 Lys-Arg,一般水解,Tyr-Phe,与木瓜蛋白酶,相似，但热稳定性稍差,国内微生物蛋白酶生产技术概要,我国微生物蛋白酶大批量工业化、商品化生产从,20,世纪,60,年代开始，我国微生物蛋白酶的应用，可追溯到古代各种传统发酵食品加工中,(,如酱油、醋、腐乳等,),，作为大批量工业化、商品化生产则从,20,世纪,60,年代开始。,30,余年来，国内各种类型微生物蛋白酶 在生产技术及品种方面，都有了很大的进展。以下就目前几个主要品种的情况作一概述,:,一酸性蛋白酶,该品种国内采用黑曲霉,3.350,、宇佐美曲霉,537,菌株进行生产。酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，活性中心含天门冬氨酸，等电点在,pH3-5,，稳定,pH2-6(,黑曲酶,3.350,为,pH2-3),，分子量,30000-40000,，主要应用于皮毛软化、酱油生产、啤酒防止混浊、饲料添加剂，目前在酒精工业中也加以应用，以利于酵母繁殖。,酸性蛋白酶,酸性蛋白酶热稳定性较差，,50,以上很不稳定，黑曲霉,3.350,酸性蛋白酶在,pH2.5,、,60,处理,20min,，即完全失活。另外有些酸性蛋白酶在冷冻干燥时会引起失活，加入少量多糖可起稳定作用。,目前国内有一些厂家采用固体发酵法，生产酸性蛋白酶，作为饲料酶，在饲料中的应用效果还比较令人满意。,一酸性蛋白酶,新疆土壤生物所和中科院微生物所合作，用宇佐美曲霉,B1,作为出发株，经化学、物理方法诱变后，得到高产株,537,，酸性蛋白酶活力比出发株提高,2.5,倍，目前国内生产千吨左右，主要在浙江海宁等地生产，近年又有上升趋势。,537,酸性蛋白酶生产工艺大致为,:,豆饼粉与玉米粉总浓度,7%,NH4Cl,、,CaCl2,、,Na2HPO4,适量，,pH5.2,，接种量,5%,（种龄为,27-30h,），,31,土,1,培养,(0-20h,，,0.3vvm,、,20-25h 0.5vvm,、,25h-,终了,0.8vvm),，培养,80h,左右，酶活在,5000-6000u/ml,，添加,55%(NH4)2S04,盐析、过滤，滤饼,40,烘干，收率在,65%,左右。以酪蛋白为底物时，该酶作用最适,pH,为,3.0,，最适反应温度,55,，,40,，,pH2-4,间稳定，,pH3,时，,60,，,40min,完全失活。,二中性蛋白酶,中性蛋白酶是国内较早生产的品种，目前主要生产菌株是枯草杆菌,1398,，栖土曲霉,3942,，放线菌,166,，主要用于皮革工业、食品保健品加工、啤酒糖化、医药等，生产厂家主要有北京房山、湖南衡阳、云南陆良、浙江海宁、河北保定、河南濉县等。,中性蛋白酶分子量,35000-40000,，等电点,8-9,，细菌中性蛋白酶最适作用,pH7.0,左右，,pH6-9,稳定。而霉菌中性蛋白酶最适作用,pH6-7,，,pH5-10,稳定。中性蛋白酶是金属酶，,Ca2+,是必不可缺的，,Mg2+,、,Zn2+,、,Mn2+,对其生成量亦有促进作用。,中性蛋白酶,A.S1398,种子培养基：,酵母浸粉,0.5%,，胰蛋白胨,0.5%,，葡萄糖,1%,，,KH2PO4 0.05%,，,Na2HPO4 0.4%,。,发酵培养基：,玉米粉,3.5%,，麸皮,5.5%,，豆饼粉,1.5%,，,KH2PO4 0.03%,Na2HPO4 0.3%,pH 7.0,中性蛋白酶,-,枯草杆菌,A.S1398,枯草杆菌,A.S 1398,中性蛋白酶发酵活力己由原来的,5000-6000u/mL,上升到,19000U/mL,，主要采取以下几个工艺措施,:,1,、菌种诱变选育高产菌株，孢子悬浮液经,80,水浴加热,1,小时。,2,、发酵固形物浓度提高到,15-16%,，麸皮添加量亦有所增加，从而提高了植酸盐等促进剂含量。,3,、发酵采用小风量，延长产酶期，而且酶活到高峰后，不致急剧下降。,4,、采取变温发酵工艺，从,10h,起将发酵温度从,32,逐小时升至,40,，然后再逐小时降至,30,，之后到,42h,温度保持恒定。,5,、消前,pH,调到,8.0,，在实消过程中对有机氮源进行部分碱解，从而提高了前期菌体浓度有利于中后期大量产酶。,二中性蛋白酶,-,枯草杆菌,A.S1398,食品级中性蛋白酶在珍珠水解、水产类保健品及化妆品的酶解工艺中得到应用,;,其简要工艺为,:,发酵液滤去粗渣加入,5%,海藻酸钠及,1%,的,CaCl,2,絮凝离心，上清液超滤浓缩加,0.5%,的,CaCl,2,，加,5,乙醇达终浓度,70%,（,v/v,）压滤酶饼,40,干燥，总收率,50-55%,。,1398,蛋白酶液体制剂，在浓缩液中加入,2%,乙醇,(,或丙二醇、甘露醇、山梨醇,),，并加入,l%CaCl2,及,15%NaCl,冬季室温下，,1,个月失活,10%,3,个月失活,30%,夏季室温下，,1,个月失活,70%,，加入少量多糖类物质，保存期有所延长。,二中性蛋白酶,-,栖土曲霉,A.S3942,3.942,中性蛋白酶生产菌是栖土曲霉，由于皮革工业及医药工业（猪脑水解物）需要，在停止生产数年后，近年来又恢复生产。其主要原料为麸皮、米糠、玉米浆及磷酸盐，发酵酶活力约,4000-5000u/ml,。,栖土曲霉,A.S 3.942,中性蛋白酶,该品种生产中应注意,:,1,、麦芽汁或查氏培养基斜面培养时，应在,33-35,。如在,31-32,培养，则不易形成孢子。,2,、发酵开始,2-8,小时，加入,0.1%,表面活性剂洗净剂,LS,，可使酶活提高,50%,。,3,、风量低时，菌丝生长旺盛但产酶低，风量大时，菌丝滚球，但产酶高，所以应采取,前期风量小，后期风量加大,(,在,1,：,0.25-1:0.3),。,此品种也可固体培养，可达,10000u/g,，但培养基中应添加,Na2CO3,，使培养基,pH,在,l0-11,左右，可提高酶活,30%,，同时抑制了杂菌生长，但产碱性蛋白酶含量较多。,二中性蛋白酶,-,放线菌,166,166,中性蛋白酶生产菌为,转化微白色放线菌变种,，由于该酶角蛋白酶活力较高，而胶原蛋白酶活力相对较低，故十分适合于制革工业。以玉米粉、豆饼粉、磷酸盐及,Ca2+,盐作为培养基，发酵,50h,左右，酶活可达,8000-10000u/ml,。该品种生产特点为,:,l,、菌种平板分离时出现三种形态,:,馒头型、梅花型中间陷落、不产孢子突变株。以,馒头型产酶能力强,。,2,、本品种为典型金属蛋白酶，,Ca2+,、,Zn2+,、,Co2+,、,Mn2+,，均能显著提高酶活，,EDTA,、明矾可致使失活，培养基中必须含,CaCO3,，,缺,Ca2+,则不能产酶,。,3,、发酵温度严格控制在,28-29,，高温季节不宜生产。,三、碱性蛋白酶,在蛋白酶生产中，此品种是产量最大的，其用途主要是洗涤剂工业，另外皮革、饲料工业中，也少量使用。国内生产菌有短小芽孢杆菌,209,、,289,，地衣型芽孢杆菌,2709,、,553,，短小芽孢杆菌低温碱性蛋白酶等。但大多均以地衣型芽孢杆菌,2709,突变株作为生产菌株，该品种发酵单位己达,25000-30000u/ml,左右。,碱性蛋白酶,-,地衣芽孢杆菌,2709,以下简述其生产技术要点,:,l,、该菌种稳定性较差，存放过程及传代均易引起产酶能力下降，应经常分离，上罐的克氏瓶为第二代，而且保存期不宜过一个月。,2,、发酵的浓度适当增大，固形物的总浓度在,12.5-13%,，添加少量玉米浆可使发酵酶活提高。,三、碱性蛋白酶,-,地衣芽孢杆菌,2709,3,、该菌种对溶氧需求较大，菌种筛选时应注意减少摇瓶填装量,(,为,8%,），增加转速,(280-300,转,/,分,)36-38h,即可取样，否则易发生,漏筛,。同时在发酵时，后期风量在,1,：,0.6-0.7,左右，发酵罐直径与搅拌器之比应在,1,：,0.37-0.4,左右。,4,、噬菌体污染一直是困扰,2709,菌株发酵的大问题，除平日注意减少环境含菌量之外，将空压机进口升高到,25-30m,及发酵排气处理特别有效。,碱性蛋白酶,-,地衣型芽孢杆菌,2709,在提取工艺方面，国内进行了许多工作，目前比较成型的工艺为,:,发酵液加铝盐，调,pH8.5,，再加适量聚丙烯酰胺絮凝过滤滤液浓缩加,55%,（,NH4,）,2SO4,或,36%,元明粉盐析过滤滤饼加元明粉、粘合剂、染料等造粒沸腾干燥过筛，成品为绿色颗粒，酶活为,20000u/g,。,在此工艺中，明矾效果比碱式氯化铝或硫酸铝稍佳，聚丙烯酰胺添加量应适宜,(50-80ppm),，否则过滤困难。盐析剂夏季可用元明粉，添加量为,36%,（,w/v),，冬季则可用,(NH4)2SO4,。一般情况下，一次滤液收率约,90%,，酶泥总收率为,70%,，从发酵液到,KL,酶总收率约,54-56%,。,风味蛋白酶,风味蛋白酶是一类能水解苦味肽的酶（外切酶，使蛋白质彻底水解，释放出游离氨基酸），通过切除结合在氨基或羧基端的疏水性氨基酸，从而解除苦味，改善食品风味。,已发现苦味是由一些末端含有等疏水性氨基酸的肽段,或中间含脯氨酸残基的肽所引起，,苦味肽的苦味不但同其疏水度有关，而且与氨基酸序列有关，若将这些氨基酸用适当的肽酶切去，苦味才得以消失。,在蛋白水解过程中，随着水解度的增加，苦味增加，但若水解度超过,60%,以上，苦味会减弱或消失，一般内切酶难以达到这个水解度，需要肽酶参与作用。,从蛋白水解物中分离到的苦味肽,风味蛋白酶商业化情况,目前，日本已经成功地开发出了改善风味的呈味蛋白酶，丹麦的,NOVO,公司也已经生产出复合风味蛋白酶（,Flavourzyme,500 MG,）,并有商品酶出售。,乳酸菌,生产的氨基肽酶商品名脱苦酶（,Debitrase,），,黑曲霉,的酸性羧肽酶,A,对脱苦极为有效。,日本天野公司的风味酶（,Umamizyme,），、,protease A,、,protease M,，新日本化学的,Sumizyme FP,以及,Novozymes,公司的风味酶（,Flavourzyme,）均是由,米曲霉,生产的复合蛋白酶，富含酸性羧肽酶和亮氨酸氨基肽酶，用其水解蛋白质水解度高，基本上不产生苦味。广西大学生产的风味酶也是由木瓜酶同米曲霉蛋白酶的混合物，蛋白质的水解度高而不发生苦味。,我校、广西大学也开展了风味蛋白酶的研究，并有用木瓜蛋白酶和曲霉蛋白酶复合制成风味蛋白酶。但仍需加强研究，特别是高活力的菌种。开发新型的食品工业风味蛋白酶对于我国食品工业发展非常必要。,风味蛋白酶产生菌,产气单孢菌,Aeromonas caviae,（,产氨肽酶）,乳 酸 菌,Lactobacillus lactis,Lactobacillus helveticus,（,产氨肽酶）,曲 霉 菌,Aspergillus oryzae,Aspergillus sojae,（内肽酶和肽酶）,氨肽酶的酶活测定方法,N,O,NH2,NO2,+H2O,LNAase,40,，,pH7.5,NH2,NO2,+,NH2,HOOC,采用,LNA,法（,L-,亮氨酸对硝基苯胺法），通过反应生成的硝基苯胺为黄绿色，比色测定酶活大小。,脯氨酸蛋白酶,啤酒的非生物稳定性即冷浑浊来源于冷藏时多酚和脯氨酸的结合沉淀，脯氨酸蛋白酶包含一种特效的内切蛋白酶，特定的分解脯氨酸，从而阻止非生物稳定性即冷浑浊的发生。该酶确保不会发生其他的水解，不降低泡沫产生。,脯氨酸蛋白酶由曲霉菌经深层发酵技术制得。其高效抗冷性在啤酒工业中可以有效防止混浊现象的发生。另外，该酶可以用于食品工业，有效去除小麦面筋蛋白中的杂质和不良成分。,产品外观,:,浅白色,-,奶油色；,气味,:,发酵气味；,酶类型,:,内切酶,应用范围及方法,1,、该酶在氨基酸工业的应用中，可以减少蛋白质和多酚的结合，其高效抗冷性在啤酒工业中有效防止混浊现象发生。,2,、在麦芽加工过程中，如添加该酶，会增加麦芽汁的得率。,3,、该酶在食品工业的应用中，可有效去除小麦面筋蛋白中的杂质和不良成分。,应用和加工条件温度范围：,有效温度为：,60-70,pH,范围：有效,pH,：,4.5-10,；最适宜,pH,：,5.0-6.0,添加量：建议使用前以实验来确定添加量。特别提醒：在酿造中使用本产品，防止啤酒冷混浊，推荐剂量为,0.5-2g/,百升。,纳豆激酶,(Nattokinase),纳豆是,利用纳豆菌（,Bacillus natto,）将蒸煮大豆快速发酵而成，在发酵期间，纳豆菌所分泌之蛋白质分解酵素，可将大豆蛋白质适当的水解，使发酵后的大豆较易被消化与吸收。,纳豆含,优质小分子蛋白质（肽）、纳豆激酶、超氧化物歧化酶、生物多糖、异黄酮、皂甙、卵磷脂、吡啶二羧酸、维生素,K2,等多种生理活性物质。,纳豆可预防和改善高血压、高血脂、高血黏、高血糖、血栓症、癌症、静脉曲张、失眠、骨质疏松、老年痴呆、便秘、腹泻、流感等病症，增强体质。,1,、纳豆菌：调节肠道,/,消除便秘,/,防止腹泻,2,、纳豆激酶：溶解血栓、溶解血脂,纳豆激酶是唯一具有溶解血栓的食物，而且能激活体内溶栓因子,3,、纳豆丝：聚谷氨酸，溶解油脂、吸收包裹分解物，分子具有疏水亲水基团，能溶解在水里吸附油脂，并且吸附膨胀大便变软，成形，小腹缩小，腰围变细。,4,、大豆异黄酮：补充植物性雌性荷尔蒙,经过纳豆菌分解后，分子变小，纳豆中大豆异黄酮比普通黄豆中大豆异黄酮容易，内分泌趋向正常,5,维生素,K2,：补钙，增加骨密度。骨质是由维生素,K2,和优质蛋白质先形成骨元蛋白，再与钙生成骨质，向骨中蓄积，吃纳豆的小孩骨头硬。,6,优质蛋白质：保肝护肝、解酒、增加抵抗力,大豆蛋白含量高，经过纳豆菌发酵后，变成小分子物质，容易被人体吸收。,保健食品：,納豆菌,+,酵素,納豆菌,：,幫助消化、健腸整胃,分泌維他命,K2,，防止骨質疏鬆症,降低血脂肪及膽固醇,納豆酵素,：,減低血液粘度,降低中风及心脏病發生風險,溶解血栓試驗：,N,=Nattokinase,U=Urokinase,P=Streptokinase,保健食品：,納豆菌,+,酵素,天竺鼠試驗結果,NC=,正常飲食,PC=,豬油飲食,NTK=,豬油飲食,+,納豆酵素,N+B=,豬油飲食,+,納豆菌,+,酵素,降血压乳,瑞士乳杆菌可产蛋白酶，作为新型的酸乳发酵菌种，具有一定的保健功能，尤其是在降高血压方面研究较多，它能够水解乳蛋白产生多种对人体有益的生物活性肽，体外实验证明具有抑制引起高血压的血管紧张素酶（,ACE,）活性的作用从而有降血压功效。,有待开发的蛋白酶品种,1,、角蛋白酶,2,、高温蛋白酶,3,、脯氨酸蛋白酶,4,、风味蛋白酶,