第八章荧光分光光度法与检测技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分析化学（第,2,版）,谢庆娟 李维斌,全国高职高专药品类专业卫生部“十二五”规划教材,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,1,某些物质吸收紫外-可见光后，可以发射其波长比吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这种发射光称为,荧光,（fluorescence）。,荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又称荧光光谱法,第一节 荧光分光光度法的基本原理,1某些物质吸收紫外-可见光后，可以发射其波长比吸收光更长的光,1,2,第一节 基本原理,一、荧光的产生过程,（一）单重态与三重态,A 单重基态,B 激发单重态,C 激发三重态,2第一节 基本原理一、荧光的产生过程,2,3,第一节 基本原理,（二）荧光的产生,电子由激发单重态基态单重态的跃迁,3第一节 基本原理（二）荧光的产生,3,4,第一节 基本原理,（二）磷光的产生,电子由激发三重态基态单重态的跃迁,课堂互动,您能比较荧光和磷光的主要区别吗？,4第一节 基本原理（二）磷光的产生课堂互动,4,5,第一节 基本原理,二、,激发光谱和荧光光谱（发射光谱）,5第一节 基本原理二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）,5,6,第一节 基本原理,任何荧光物质都具有两个特征光谱：,激发光谱和荧光光谱（发射光谱）,激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光波长而变化的关系曲线（以激发光波长,ex为横坐标，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。,6第一节 基本原理 任何荧光物质都具有两个特征光谱：,6,7,第一节 基本原理,荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让,物质,所产生的荧光通过发射分光系统(II)分光，测定每一发射波长荧光强度F，以发射光波长,em为横坐标，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。,7第一节 基本原理荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物,7,8,第一节 基本原理,三、荧光与分子结构,（一）荧光物质的特征,具有强的可见-紫外吸收，即具有K带强吸收,具有高的荧光效率,荧光效率,8第一节 基本原理三、荧光与分子结构荧光效率,8,9,第一节 基本原理,（,二）分子结构与荧光的关系,大的共轭键结构,9第一节 基本原理（二）分子结构与荧光的关系,9,10,第一节 基本原理,分子的刚性和共平面性,取代基的影响,联苯,F,=0.18,芴,F,=1.0,10第一节 基本原理分子的刚性和共平面性联苯F=0.18,10,11,第一节 基本原理,（三）影响荧光强度的外界因素,温度,溶剂,溶液酸碱性,荧光熄灭剂,散射光,激发光源,11第一节 基本原理（三）影响荧光强度的外界因素,11,12,第一节 基本原理,（四）荧光分光光度计,荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。,12第一节 基本原理 （四）荧光分光光度计,12,13,第一节 基本原理,（一）仪器类型,滤光片荧光计,滤光片-单色器荧光计,荧光分光光度计,13第一节 基本原理（一）仪器类型,13,14,第一节 基本原理,（二）荧光分光光度计的基本结构,1.,光源,2.4.7.9.,狭缝,3.,激发单色器,5.,样品池,6.,表面吸光物质,8.,发射单色器,10.,检测器,11.,放大器,12.,指示器,13.,记录器,14第一节 基本原理（二）荧光分光光度计的基本结构1.光源,14,15,第一节 基本原理,光源 目前最常用的是氙灯,单色器（分光系统）,激发单色器 发射单色器,样品池,测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英,检测器 光电倍增管,15第一节 基本原理光源 目前最常用的是氙灯,15,16,第一节 基本原理,（三）仪器校准,灵敏度校准,波长校准,激发光谱和发射光谱校准,16第一节 基本原理（三）仪器校准,16,17,课堂互动,请您比较荧光分光光度计与紫外,-可见分光光度计的主要区别,第一节 基本原理,17课堂互动第一节 基本原理,17,18,点滴积累,荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。,最强荧光波长,em和最强激发波长,ex是物质的定性依据，也是定量测定时的最适宜波长。,强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构，如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。,影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件,。,第一节 基本原理,18点滴积累第一节 基本原理,18,第二节 荧光定量分析,第二节 荧光定量分析,由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同，发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验,证明,，在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。,19,第二节 荧光定量分析第二节 荧光定量分析19,19,第二节 荧光定量分析,一、荧光强度与物质浓度的关系,当溶液中荧光物质的浓度为,c,，液层厚度为（吸收池内径）,L,时，由于荧光强度,F,正比于被荧光物质吸收光的强度：,F,（,I,0,I,），用线性方程表示为,：,F,=,K,（,I,0,I,）,20,第二节 荧光定量分析一、荧光强度与物质浓度的关系20,20,第二节 荧光定量分析,K,为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：,F,=2.303,F,I,0,c,L,入射光强度,I,0,在波长一定，光源稳定时为固定值，因此可以将2.303,F,I,0,L,视为常数,K,，故：,F,=,Kc,21,第二节 荧光定量分析 K为常数，称荧光比率，其大小取决,21,第二节 荧光定量分析,当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的依据。,但只有当荧光物质的浓度很小时，,即,c,L,0.05，这种关系才成立。,22,第二节 荧光定量分析 当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶,22,23,课堂互动,请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏度比紫外,-可见分光光度法要高？,第二节 荧光定量分析,23课堂互动第二节 荧光定量分析,23,24,第二节 荧光定量分析,二、定量分析方法,标准曲线法,配制一系列浓度为,c,1,、c,2,、c,3,对照品溶液，分别测其,F,1,、F,2,、F,3,值，用,Fc,作图绘制标准曲线。,然后在同样条件下测定试样溶液的,F,x,，在标准曲线上查找对应的浓度,c,x,。,24第二节 荧光定量分析二、定量分析方法,24,25,第二节 荧光定量分析,比例法,若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围用比例法测定。即配制一对照品溶液（,c,s,）测其荧光强度（,F,s,），再测定试样溶液（,c,x,）的荧光强度（,F,x,），然后进行比较。测定时同样要以空白（,F,0,）校正：,25第二节 荧光定量分析比例法,25,26,第二节 荧光定量分析,多组分混合物测定,与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外-可见分光光度法广泛。,26第二节 荧光定量分析多组分混合物测定,26,27,点滴积累,当其他条件（即,F,、,I,0,、,、,L,）一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强度,F,与浓度,c,成正比。,荧光分析的定量方法与紫外-可见分光光度法基本相同,。,第二节 荧光定量分析,27点滴积累第二节 荧光定量分析,27,28,第三节应用与发展,一、荧光分析的应用,（一）有机化合物的荧光分析,芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系在紫外光照射下很多能发射荧光。为提高测定灵敏度和选择性，可使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。,第三节应用与发展,28第三节应用与发展一、荧光分析的应用第三节应用与发展,28,29,第三节应用与发展,（二）无机化合物的荧光分析,直接荧光法,荧光猝灭法,催化荧光法,29第三节应用与发展（二）无机化合物的荧光分析,29,30,第三节应用与发展,二、荧光分析新技术,激光荧光分析,时间分辨荧光分析,同步荧光分析,胶束增敏荧光分析,三维荧光光谱分析,原油试样在环乙烷中的等角三维投影光谱图,30第三节应用与发展二、荧光分析新技术原油试样在环乙烷中的,30,31,第八章 荧光分析法检测技术与应用,一、选择题,(一)单项选择题,1.荧光光谱属于（）。,A、吸收光谱 B、发射光谱 C、红外光谱 D、质谱,2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（）。,A、能发射荧光的物质比较少,B、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱,C、荧光波长比相应的吸收波长稍长,D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰,目标检测,31第八章 荧光分析法检测技术与应用一、选择题目标检测,31,32,第八章 荧光分析法检测技术与应用,3.荧光量子效率是指（）。,A、荧光强度与吸收光强度之比,B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比,C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比,D、激发态的分子数与基态的分子数之比,4.一种物质能否发出荧光主要取决于（）。,A、分子结构 B、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性,32第八章 荧光分析法检测技术与应用3.荧光量子效率是指,32,33,第八章 荧光分析法检测技术与应用,5.下列叙述中，错误的是（）。,A、荧光分析的待测物应含有大键,B、紫外分光光度法待测物应含有键,C、质谱法待测物应含离子,D、气象色谱分析物的沸点应较低,6.下列因素会导致荧光效率下降的有（）。,A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小,C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子,33第八章 荧光分析法检测技术与应用5.下列叙述中，错误,33,34,第八章 荧光分析法检测技术与应用,7.荧光波长与相应激发光波长相比（）。,A、前者较长 B、后者较长,C、两者相等 D、关系不确定,8.荧光光谱分析的主要优点是（）。,A、准确度高 B、操作简便 C、仪器简单 D、灵敏度高,9.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于（）。,A、光源 B、单色器 C、光路 D、检测器,34第八章 荧光分析法检测技术与应用7.荧光波长与相应激,34,35,第八章 荧光分析法检测技术与应用,（二）多项选择题,1.下列关于分子荧光分析特点的叙述正确的是（）。,A、检测灵敏度高 B、用量大，分析时间长,C、用量少，操作简便 D、选择性强,E、应用广泛,2.分子中有利于提高荧光效率的结构特征是（）。,A、双键数目较多 B、共轭双键数目较多,C、含重金属原子 D、分子为平面刚性,E、苯环上有给电子基团,35第八章 荧光分析法检测技术与应用（二）多项选择题,35,36,第八章 荧光分析法检测技术与应用,3.下列跃迁方式属于无辐射跃迁的有（）。,A、振动弛豫 B、内转换,C、体系间跨越 D、荧光发射,E、磷光发射,4.分子荧光法与紫外-可见分光光法的主要区别为（）。,A、分析方法不同 B、仪器结构不同,C、灵敏度不同 D、光谱带个数不同,E、光源不同,36第八章 荧光分析法检测技术与应用3.下列跃迁方式属于无,36,37,第八章 荧光分析法检测技术与应用,二、填空题,1.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为,；荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为,。,2.荧光分光光度计的主要部件有,、,、,、,四大部件组成。,3.荧光分析法进行定量分析的依据是,。,三、简答题,1何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？,2哪些因素会影响荧光波长和强度？,3请设计两种方法测定溶液Al,3+,的含量。（一种化学分析方法，一种仪器分析方法）,37第八章 荧光分析法检测技术与应用二、填空题,37,38,第八章 荧光分析法检测技术与应用,二、填空题,1.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为,；荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为,。,2.荧光分光光度计的主要部件有,、,、,、,等四大部件组成。,3.荧光分析法进行定量分析的依据是,。,38第八章 荧光分析法检测技术与应用二、填空题,38,39,第八章 荧光分析法检测技术与应用,四、实例分析题,1用荧光法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量时，取供试品20片（每片含炔雌醇应为31.538.5,g），研细溶于无水乙醇中，稀释至250ml，滤过，取滤液5ml，稀释至10ml，在激发波长285nm和发射波长307nm处测定荧光强度。如炔雌醇对照品的乙醇溶液（1.4,g/ml）在同样测定条件下荧光强度为65，则合格片的荧光读数应在什么范围内？,39第八章 荧光分析法检测技术与应用四、实例分析题,39,40,第八章 荧光分析法检测技术与应用,2.用荧光分析法测定食品中维生素B,2,的含量：称取2.00g食品，用10.0ml氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2.00ml，再用氯仿稀释为10.0ml。维生素B,2,氯仿标准溶液浓度为0.100g/ml。测得空白溶液、标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：,F,0,=1.5，,F,s,=69.5，,F,x,=61.5，求该食品中维生素B,2,的含量（g/g）。,40第八章 荧光分析法检测技术与应用2.用荧光分析法测定,40,41,本章结束！,谢谢！,41本章结束！,41,