单克隆抗体制备技术课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四节 单克隆抗体,第四节 单克隆抗体,1,理化性状高度均一、生物活性单一、只与一种抗原表位发生发应、具有高度的特异性,一、单克隆抗体的,概念及特点,概念：,特点：,指由B细胞杂交瘤产生的,只识别抗原分子上一种抗原决定簇的抗体分子,理化性状高度均一、生物活性单一、只与一种抗原,2,由一个B 细胞杂交瘤细胞分裂增殖，形成的单克隆所产生的抗体。,二、杂交瘤技术的,原理及流程,克隆：,由一个细胞进行无性分裂增殖，形成的均一细胞集团。,单克隆抗体：,由一个B 细胞杂交瘤细胞分裂增殖，形成的单克隆所产生的抗体。,3,B细胞杂交瘤,1.杂交瘤技术的原理,：,致敏B细胞,骨髓瘤细胞,B细胞杂交瘤,分泌抗体能力,无限繁殖能力,融合,B细胞杂交瘤1.杂交瘤技术的原理：致敏B细胞骨髓瘤细胞,4,是 B 细胞系恶性肿瘤，具有在体外长期增殖的特性。,免疫,脾细胞,是经过抗原诱导活化的脾细胞，主要是 B 淋巴细胞，它具有分泌抗体的能力。,骨髓,瘤细胞,是 B 细胞系恶性肿瘤，具有在体外长期增殖的特性。免疫,5,与B细胞融合后形成稳定的杂交瘤细胞，能无限增殖传代和分泌特异性抗体缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤转换酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）,的条件,该具备,骨髓瘤,细胞应,与B细胞有较高的融合率,本身不,合成Ig,与B细胞融合后形成稳定的杂交瘤细胞，能无限增殖传代和分泌特异,6,2.细胞融合的方法,融合剂融合法,聚乙二醇,（PEG）,（最常用）,仙台病毒,溶血卵磷脂,2.细胞融合的方法融合剂融合法 聚乙二醇仙台病毒溶血卵磷,7,3.选择性培养基的作用原理,HAT培养基是一种筛选B细胞杂交瘤的选择性培养基，含有：,次黄嘌呤（H）,氨基蝶呤（A）,胸腺嘧啶（T）,3.选择性培养基的作用原理 HAT培养基是一种筛选B细胞,8,辅助途径,主要途径,HGPRT,TK,次黄嘌呤+胸腺嘧啶,DNA,细胞DNA生物合成途径,氨基酸,核苷酸,DNA,叶酸,辅助途径 主要途径HGPRTTK次黄嘌呤+胸腺嘧啶DNA,9,TK缺陷细胞 +-,HGPRT缺陷细胞 +-,杂交瘤细胞 +,细胞类型 正常培养基 HAT培养基,HAT培养基作用原理,TK缺陷细胞 +,10,HAT培养基中的氨基蝶呤为叶酸拮抗剂，故所有细胞的DNA合成主要途径被阻断，只能由辅助途径合成DNA。,未融合的瘤细胞因缺乏HGPRT,和TK，不能合成DNA，即不能,生存而死亡。,HAT培养基中的氨基蝶呤为叶酸拮抗剂，故所有细胞的DNA,11,只有融合的杂交瘤细胞从B细胞中获得了HGPRT和TK，又能在体外培养繁殖，因而存活。,未融合的B细胞不能在体外长期生存,而自然死亡,只有融合的杂交瘤细胞从B细胞中获得了HGPRT和TK，又能在,12,4.制备单克隆抗体的技术流程,（一）杂交瘤技术流程,4.制备单克隆抗体的技术流程（一）杂交瘤技术流程,13,融合前应经过含有特殊成分的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT或TK的活性。,（二）技术要点,制备免,疫脾细胞,同一般血清的制备,采用脾内直接免疫,细胞,融合条件,筛选骨,髓瘤细胞,选择,阳性克隆,无菌、温度、瘤细胞与,脾细胞的比例、50%PEG,融合前应经过含有特殊成分的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复H,14,根据抗原的性质及所需单克隆抗体的功能，,常用方法有RIA、ELISA、免疫荧光等，鉴定,抗体的特异性、亲和力、纯度等。,根据抗原的性质及所需单克隆抗体的功能，,15,克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。要尽早进行、反复筛选。因初期杂交瘤细胞不稳定，有丢失染色体的倾向。反复克隆可获得稳定的杂交瘤。常用有限稀释法，按每孔一个细胞接种在培养皿中。,克隆化,克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。要尽早进行、,16,单克隆抗体,的制备,大量生产分,体内,和,体外,两种方法，目前以体内法为主。先给小鼠腹腔注射降植烷，造成无菌性腹膜炎，7天后将杂交瘤注入小鼠腹腔，1014天后从小鼠腹腔获得高浓度的单克隆抗体。,单克隆抗体大量生产分体内和体外两种方法，目前以体内法为主。,17,单克隆抗体制备技术课件,18,接种小鼠腹腔收集腹水,接种于微孔营养板，在HAT培养基中培养,免疫小鼠（融合前34周）,骨髓瘤细胞,强化免疫（融合前34天）,融合前24周复苏培养,取脾制成细胞悬液(融合当天）,收集对数增长期细胞,融合（PEG）,阳性孔再次克隆化,克隆扩大培养,收集上清收获抗体,杂交瘤细胞冻存于液氮,检测抗体,接种小鼠腹腔收集腹水接种于微孔营养板，在HAT培养基中培养免,19,三、,单克隆抗体的,应用,可大量生产且稳定性好,特异性强,纯度高,效价高,无血清交叉反应,1.McAb的优点：,三、单克隆抗体的应用可大量生产且稳定性好特异性强纯度高效价高,20,2.McAb的应用,（5）细胞因子测定,放射免疫,酶免疫,荧光免疫,免疫组化,试剂盒,（1）病原微生物抗原、抗体的检测,（2）肿瘤抗原的检测,（3）免疫细胞及其亚群的检测,（4）激素测定,医学检验,诊断试剂,2.McAb的应用（5）细胞因子测定 放射免疫酶,21,（2）放射免疫显像：将放射性标记物与McAb连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，以诊断早期肿瘤的小转移灶，或用于术前定位及术后追踪观察。,（1）导向治疗作用：用McAb或连接药物、毒素的McAb治疗肿瘤，称“免疫导弹”。目前在动物实验中已获满意效果。,蛋白质,的提纯,McAb 作为配体，用于分离纯化相应抗原,肿瘤导向治疗和,射免显像技术,（2）放射免疫显像：将放射性标记物与McAb连接，注入患者,22,第五节,基因工程抗体技术,基因工程抗体又称重组抗体，是指应用,NDA,重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。,第五节 基因工程抗体技术,23,目前临床上使用的单克隆抗体和多克隆抗体均为动物源性抗体，具有免疫原性，在反复使用时常会诱导机体的免疫应答而产生抗抗体，这大大限制了异源性抗体在人体内的应用。随着基因工程技术的发展，人们逐渐可根据需要制备各种特异性的抗体，通过降低抗体的免疫原性，获得更佳的生物学活性。,目前临床上使用的单克隆抗体和多克隆抗体均为动物源性抗,24,目前基因工程抗体技术主要包括两部分内容：,一是应用,DNA,重组和蛋白工程技术对已有的单抗进行改造，包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备；,二是用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。,目前基因工程抗体技术主要包括两部分内容：,25,一、人源化抗体,（一）嵌合抗体,嵌合抗体（,chimeric antibody,）又称人,-,鼠嵌合抗体，是从杂交瘤细胞中分离出鼠源单抗功能性,V,区基因，经基因重组与人抗体,C,区基因连接成嵌合基因后，插入适当的表达载体中，再共同转染宿主细胞，表达人,-,鼠嵌合抗体分子。,嵌合抗体保留了单抗对抗原的特异亲和性，又含有人抗体,C,区的成分及其功能。,一、人源化抗体,26,1,抗体,V,区基因的克隆,准确获得抗体可变区基因是制备嵌合抗体的关键所在。,鼠源单抗,V,L,和,V,H,基因可通过以下两种方法获得：,用适当的探针从其杂交瘤细胞系的基因组文库中筛选出,V,区基因；,用,PCR,方法从该细胞的,RNA,或,mRNA,中扩增所需的,V,区基因。,1抗体V区基因的克隆 准确获得抗体可变区基因是制备嵌合,27,2,抗体,C,区的选择,抗体恒定区基因的序列相对恒定，比较容易得到，可根据需要进行选择。如选择人,IgG1,或,IgG3,的恒定区可使嵌合抗体保留其介导抗体依赖性细胞毒作用（,antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC,）和增强激活补体的能力,如果抗体只是用于激活和阻断受体时，可选择人,IgG2,或,IgG4,恒定区。,2抗体C区的选择,28,3,表达载体的构建,为了产生具有功能活性的人,-,鼠嵌合抗体，需要将编码,V,区和,C,区的基因插入表达载体。,构建表达载体的方法主要有二种：分别构建表达,V,L,和,V,H,基因的载体，用两个载体分别带上不同的标记基因，通过二次转染（将载体,DNA,导入真核细胞称为转染）选择获得嵌合抗体基因的细胞；将,V,L,和,V,H,基因构建于同一载体中，这样虽然增加了重组体构建的难度，但可提高转染的成功率，同时增加表达量。,3表达载体的构建 为了产生具有功能活性的人-鼠嵌合抗体,29,4,表达,嵌合抗体的重组基因一般利用哺乳动物细胞等进行表达。因为抗体分子需要经过正确的装配和加工等过程才能维持其生物学功能，而原核细胞等往往不能表达完整的抗体，只有哺乳动物细胞能够表达具有良好功能的抗体。,4表达 嵌合抗体的重组基因一般利用哺乳动物细胞等进行表达,30,（二）改形抗体,改形抗体（,reshaped antibody,，,RAb,）是应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区的骨架区序列取代鼠源单抗,CDR,以外的骨架区序列，重新构成既有鼠源单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体，该抗体对人体几乎无免疫原性。,（二）改形抗体,31,二、小分子抗体,小分子抗体指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。它的优点表现为：,免疫原性低且分子量小，易于穿透血管或组织到靶细胞部位，可用于免疫治疗；,可在大肠杆菌等原核细胞中表达，降低生产成本；不含,F,C,段，不会与带有,F,C,段受体的细胞结合，副作用小；,半衰期短，有利于中和并及时清除毒素。,二、小分子抗体 小分子抗体指分子量较小但具有抗原结合,32,（一）Fab,Fab,段由一条完整的,L,链以及,H,链的,V,区和,C,H,1,区组成，具有与完整抗体相同的抗原结合特性，但只有一个抗原结合位点。,小分子抗体包括：,抗原结合片段（,Fab,）、可变区片段（,Fv,）单链抗体 （,single chain Fv,，,ScFv,）,等。,（一）Fab小分子抗体包括：抗原结合片段（Fab）、,33,（二）Fv和ScFv,Fv,和,ScFv,是用基因工程技术构建的抗体片段。,Fv,是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能性片段，,若将抗体,V,L,和,V,H,通过连接肽连接为单一的肽链则称为单链抗体（,ScFv,）。其特点为：分子量小、穿透力强、免疫原性低、能较好的保持亲和性并易于进行遗传改造。,（二）Fv和ScFv,34,（三）,单域抗体,又称V,H,结构域片段，由单个抗体,V,H,功能区构成。一般是将抗体,V,H,功能区基因通过基因工程技术在大肠杆菌中表达所得到的抗体片段。,它与相应抗原结合的亲密程度与完整抗体的作用相似，但单域抗体的亲和力比完整抗体下降了一个数量级。,（三）单域抗体,35,三、双特异性抗体,双特异性抗体（,bispecific antibody,，,BsAb,）又称双功能抗体。它不同于天然抗体，其两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性的抗原发生结合。,BsAb,可通过化学交联法或将两种杂交瘤细胞融合而制备，也可采用基因工程技术制备。,三、双特异性抗体,36,（一）化学交联BsAb,分别分离纯化两种不同抗原的单抗，先使,Ig,解离后，获得单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来。具体制备方法因实验室而异。此法易致抗体失活，其产物亦难以保证均质性。,（一）化学交联BsAb,37,（二）细胞工程BsAb,是将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行融合产生二次杂交瘤。但后者所分泌的并非均一产物，两套重链、轻链之间随机重新组合的形式可多达,10,种。可能仅分泌两种亲本单抗，而无,BsAb,形成，也可能既分泌亲本单抗又可分泌,BsAb,。,BsAb,在所有,Ig,形式中所占比例可为,10%,50%,不等。,（二）细胞工程BsAb,38,（三）基因工程BsAb,一般采用抗体分子片段，如,ScFv,或,Fab,等，经基因操作修饰后，或在体外组装成为,BsAb,，或直接导入受体细胞表达为分泌型的,BsAb,。,（三）基因工程BsAb,39,四、抗体融合蛋白,抗体融合蛋白是指将抗体分子片段与其他蛋白融合所得到的产物。这种抗体融合蛋白具有多种生物学功能。例如将抗体,Fab,段或,Fv,与其他生物活性蛋白融合，就可将特定的生物学效应导向靶部位；将,ScFv,与某些细胞膜蛋白融合，则可形成嵌合受体，赋予特定细胞以结合抗原的能力；若将非抗体蛋白与抗体分子的,Fc,段融合，可改善其药代动力学特性，并可使某些生物学活性与抗体的生物学功能相联。,四、抗体融合蛋白 抗体融合蛋白是指将抗体分子片段与其他,40,五、抗体库技术,抗体库技术是指用细菌克隆代替,B,细胞克隆来表达抗体谱。,抗体库技术的主要特点为：,方法简单快速，与单抗制备相比，既省去细胞融合之繁琐，又避免动物免疫之局限；,选择范围广泛，抗体基因库的抗原特异性可高达,10,8,10,10,；,可模拟体内免疫系统亲和力成熟过程制备高亲和力抗体；,无需人体免疫接种过程即可获得特异性人抗体；大规模生产方便。,五、抗体库技术,41,抗体库技术的主要步骤如下：,从经免疫或未经免疫的,B,细胞中克隆全套抗体的,V,L,和,V,H,基因；,用,PCR,方法扩增各种抗体轻链和重链基因片段后，将其随机克隆入相应的载体形成组合文库；,转化细菌，再从表达产物中通过与抗原特异性结合的方式筛选出所需抗体并大量生产。,抗体库技术的主要步骤如下：,42,思考题,1.名词解释:McAb，克隆,2.简述杂交瘤技术的原理及流程,3.简述HAT培养基的关键成分及其作用原理,思考题1.名词解释:McAb，克隆,43,