第二章-微生物发酵产酶--课件

,ppt课件,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第二章 微生物发酵产酶,1,ppt课件,1,、,酶生物合成过程,2,、常见产酶微生物,3,、酶的发酵工艺条件及控制,4,、酶生产过程的动力学,2,ppt课件,第一节 微生物细胞中酶生物合成的调节,酶的生产方法,提取分离法,(Extraction),生物合成,(Biosynthesis),化学合成,(,chemicalsynthesis,),SOD-blood,Papain,-Papaya,Chymotrypsin-Pancrea,organ/tissue/cell,Amylase from Bacillus,Protease from Bacillus,Phosphatase,from Bacillus,Glucoamylase,from,Aspergillus,Plant cell culture,Animal cell culture,Few example,3,ppt课件,微生物发酵产酶,酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。,大多数酶的生产采用发酵生产原因：微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点,4,ppt课件,酶的发酵生产的方式：,固体培养发酵,液体深层发酵,固定化微生物细胞发酵,固定化微生物原生质体发酵,5,ppt课件,一、酶生物合成的基本过程,蛋白质,翻译,转录,逆转录,复制,复制,DNA,RNA,遗传信息传递的中心法则,6,ppt课件,（一）,RNA,的生物合成,转录,定义,以,DNA,为模板，以核苷三磷酸为底物，在,RNA,聚合酶（转录酶）的作用下，生成,RNA,分子的过程。,7,ppt课件,RNA,的转录过程,(,三步,),1.,起始,2.,延长,3.,终止,4,、,RNA,前体的加工,8,ppt课件,RNA,合成过程,起始,双链,DNA,局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,5,3,RNA,启动子（,promotor,),终止子,(terminator),5,RNA,聚合酶,5,3,5,3,5,5,3,离开,9,ppt课件,原核生物,RNA,聚合酶：大肠杆菌,RNA,聚合酶：,MW=5x10,5,RNA,聚合酶,起始因子,1,、转录起始,10,ppt课件,RNA,生物合成的起始位点在,DNA,的启动基因（启动子,),上,起始阶段的重要问题是,RNA,聚合酶与,DNA,的启动基因的相互作用，起始阶段包括：,全酶的形成,酶与模板结合,酶与启动基因结合,模板,DNA,局部变性,转录开始,1,、转录起始,11,ppt课件,2,、,RNA,链的延伸,3,5,RNA-DNA,杂交螺旋,聚合酶的移动方向,新生,RNA,复链,解链,有义链,模板链（反义链）,延长部位,12,ppt课件,T C G A G T A C,A G C T C A T G,C G A G U A C,G C A U,RNA,聚合酶,有意义链,反意义链,RNA,PPi,5,5,3,GTP,UTP,CTP,ATP,UTP,RNA,在,DNA,模板上的生物合成,3,3,5,13,ppt课件,3,、,RNA,链合成的终止,模板,DNA,分子上每个基因或每个操纵子都含有一个终止信号,终止子。当,RNA,聚合酶转录到达这个信号时，合成的,RNA,分子以及聚合酶与模板,DNA,分离，,RNA,链的合成便被终止。,5,ATPADP+Pi,RNA,聚合酶,终止子,14,ppt课件,4,、,RNA,的前体加工,1.,剪切反应,2.,剪接反应,3.,末端连接反应：,tRNA3,-,末端加上,CCA-OH,尾巴,在,mRNA,的,5,-,末端加上,“,帽子,”,结构,5,-m,7,G,ppp,N,mp,N,p,在,mRNA,的,3,-,末端连接,polyA,尾巴,tRNA5,-,末端加上甲基鸟苷酸,核苷修饰反应,15,ppt课件,（二）蛋白质的生物合成,翻译,定义,以,mRNA,为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种,tRNA,、,酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。,16,ppt课件,RNA,的种类,dsRNA,:,某些病毒遗传信息载体,催化活性,RNA,：催化作用,tRNA,：氨基酸载体,rRNA,：与蛋白质共同组成核糖体,mRNA,：蛋白质合成模板,sRNA,：分子修饰、代谢调节作用,RNA,的种类和主,a,要功能,17,ppt课件,蛋白质的合成过程 （大肠杆菌）,氨基酸活化生产氨酰,-tRNA,肽链合成的起始,肽链的延伸,肽链合成的终止与释放,蛋白质前体的加工,18,ppt课件,1,、氨基酸活化生产氨酰,-tRNA,aa,tRNA+ATP,aa-tRNA+AMP+PPi,大肠杆菌，肽链合成的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸：,Met,tRNA,F,+ATP,Met-,tRNA,F,+AMP+PPi,甲酰转移酶,fMet-tRNA,氨酰,-,tRAN,合成酶,19,ppt课件,1,、,30S,亚基与起始因子,IF3,结合，,形成,30S-mRNA-IF,3,复合物,2,、,30S,亚基与,mRNA,结合形成：,30S-mRNA-IF,3,复合物,3,、,fMet-tRNA,与起始因子,IF2,以及,GTP,结合形成：,fMet-tRNA-IF,2,-GTP,4,、在起始因子,IF1,的参与下，,fMet-tRNA-IF2-GTP,与,30S-mRNA-IF3,结合形成,30S,起始复合物。,5,、,50S,亚基与上述,30S,起始复合物结合，形成完整的,70S,核糖体。,2,、肽链合成的起始,20,ppt课件,30s,亚基,IF-3,mRNA,mRNA,GTP-IF-2-fMet-tRNA,fMRA,50s,亚基,IF-1+IF-2+IF-3,GDP+Pi,fMet,21,ppt课件,3,、肽链的延伸,1.,进位,:,氨基酰,-,tRNA,进入受位,;,2.,转肽,:,形成肽键,在转肽酶作用下,给位与,受位结合,;,3.,移位,:,核蛋白体向,3,端移动一个密码子的,位置,空出受位,不断地进位、转肽、,移位,使肽链延长。,22,ppt课件,AUG ACA,5,3,UAC,蛋,苏,UGU,AUG ACA,5,UAC,蛋,苏,UGU,GUU,AUG ACA,5,UAC,蛋,苏,UGU,GUU,AUG ACA,5,蛋,苏,UGU,GUU,3,3,3,GTP GDP+Pi,GDP+Pi,GTP,起始复合体,进位,转肽,移位,Mg,+,K,+,23,ppt课件,1.,出现终止密码并与终止因子结合,;,2.,肽键水解,多肽释放,;,3.tRNA,mRNA,大小亚基解离,.,终止密码子：,UAA,UAG,UGA,释放因子（,Release Factor,）,:,RF-1,：,UAA,UAG,RF-2,：,UAA,UGA,4,、肽链合成的终止,24,ppt课件,AUG,UAA,5,UAC,AUG,UAA,5,UAC,3,3,终,终,AUG,UAA,5,UAC,3,终,5,3,UAC,终,肽链,25,ppt课件,去除甲酰基,去除,N-,末端的氨基酸,肽链折叠,5,、蛋白质前体的加工,26,ppt课件,二、酶生物合成的调节,定义：,通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。,意义：,通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。,27,ppt课件,转录水平的调节,转录产物的加工调节,翻译水平的调节,翻译产物的加工调节,酶降解调节,组成酶：,DNA,酶，,RNA,酶，,糖酵解途径的酶,调节酶：适应酶，,-,半乳糖苷酶（诱导酶）,酶的类型,酶合成的调节控制,28,ppt课件,1960,年,Jacob,和,Monod,提出的操纵子学说,调节基因：产生阻遏蛋白,启动基因,操纵基因：与阻遏蛋白结合,结构基因：蛋白多肽链产物,操纵子,1.RNA,聚合酶结合位点,2.cAMP,及其受体蛋白复合物（,cAMP,-CRP,）结合位点,（一）操纵子学说,29,ppt课件,基因操纵子调节系统示意图,调节基因,启动基因 操纵基因 结构基因,DNA,转录,（,-,）,RNA,聚合酶,（,+,）,转录,翻译,mRNA,翻译,阻遏蛋白,蛋白质,诱导剂,控制区 信息区,操纵子,30,ppt课件,调节基因,(regulator gene),：,可产生一种组成型,调节蛋白,(regulatory protein),（,一种,变构蛋白），通过与效应物,(,effector,),（,包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。,调节基因常位于调控区的上游。,31,ppt课件,cAMP,-CRP,复合物的作用示意图,启动基因（,promotor,gene,）（,启动子）：,有两个位点：,（,1,）,RNA,聚合酶的结合位点,（,2,）,cAMP,-CAP,的结合位点。,CAP,：,分解代谢产物基因活化蛋白（,catabolite,gene activator protein,），,又称环腺苷酸受体蛋白,(,cAMP,receptor protein,，,CRP,）。,只有,cAMP,-CRP,复合物结合到启动子的位点上，,RNA,聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。,32,ppt课件,操纵基因（,Operater,gene,）,:,位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。,结构基因（,Structural gene,）,:,决定某一多肽的,DNA,模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为,mRNA,，,再翻译为蛋白质。,33,ppt课件,原核生物中操纵子的类型,1.,诱导型操纵子：乳糖操纵子,2.,阻遏型操纵子：色氨酸操纵子,34,ppt课件,（二）原核生物中酶生物合成的调节机制,1.,分解代谢物阻遏作用,2.,酶生物合成的诱导作用,3.,酶生物合成的反馈阻遏作用,35,ppt课件,1.,分解代谢物阻遏作用,是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。,cAMP,+H,2,O,AMP,磷酸二酯酶,葡萄糖过,量降解,ATP,ADP,AMP,cAMP,-CRP,启动基因上没有,cAMP,-CRP,结合,酶合成,例：葡萄糖阻遏,-,半乳糖苷酶的生物合成,36,ppt课件,2.,酶生物合成的诱导作用,加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程。简称为诱导作用，起诱导作用的物质，称为诱导剂。,举例：,乳糖诱导,-,半乳糖苷酶的合成,R P O S1 S2,DNA,无诱导物时：,添加诱导物时：,R P O S1 S2,DNA,诱导物,转录,翻译,mRNA,酶,乳糖 别乳糖,37,ppt课件,3.,酶生物合成的反馈阻遏作用,（产物阻遏作用）,是指酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程。引起反馈阻遏的物质，称为共阻遏物。,举例：无机磷酸阻遏碱性磷酸酶,无阻遏物时：,添加阻遏物时：,R P O S1 S2,DNA,翻译,mRNA,R P O S1 S2,DNA,共阻遏物,磷酸单酯,磷酸,+,醇,碱性磷酸酶,38,ppt课件,三、酶生物合成的模式,细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等,4,个阶段,通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为,4,种类型。即,同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。,39,ppt课件,同步合成型,酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为,生长偶联型。,属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。,大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。,例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（,tanase,EC3.1.1.20,）。,40,ppt课件,延续合成型,酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。,属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（,Polygalacturonase,，,EC3.2.1.15,）的生物合成。,41,ppt课件,中期合成型,该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。,例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（,Alkaline,phophatase,，,EC 3.1.3.1),的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样，在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间，培养基中的磷几乎被细胞用完（低于,0.01mmol/L,）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的,mRNA,不稳定，其寿命只有,30 min,左右，所以当细胞进入平衡期后，酶的生物合成随着停止。,42,ppt课件,滞后合成型,此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为,非生长偶联型,。,许多水解酶的生物合成都属于这一类型。,属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是,由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。,若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的,mRNA,稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。,43,ppt课件,理想的酶合成模式,酶所对应的,mRNA,的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。,其中，,mRNA,稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；,mRNA,稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。,在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，,最理想的合成模式应是延续合成型。,因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。,对于,其他合成模式的酶，可以通过基因工程,细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株,并通过工艺条件的优化控制,使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。,回本节,44,ppt课件,第二节 产酶微生物的特点,用于酶的生产微生物所具备的特点：,酶的产量高,容易培养和管理,产酶稳定性好,利于酶的分离和纯化,安全可靠、无毒性,45,ppt课件,细菌属于真细菌纲,(,Schizomycetes,),，是单细胞，横分裂或二分裂繁殖，依细胞的形状和分裂后的集合状态而给予各种名称。按形状分为球菌、杆菌、螺旋菌等。球菌又有单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌等。,一、细菌,46,ppt课件,球菌,链球菌,47,ppt课件,四联球菌,葡萄球菌,48,ppt课件,大肠杆菌,特征：,细胞成杆状，,0.5,m*,（,13,）,m,，无芽孢，,G,-,，菌落从白色到黄色，光滑闪光，扩展。,产酶种类：一般生产胞内酶,谷氨酸脱羧酶，天冬氨酸酶，苄青霉素酰化酶，基因工程研究用酶等,49,ppt课件,特征：,细胞成杆状，（,0.70.8,）,m*,（,23,）,m,，单个，无荚膜，周生鞭毛，运动，,G,+,，菌落粗糙，不透明。污白色或微带黄色。,产酶种类：,-,淀粉酶、蛋白酶、,-,葡聚糖酶、碱性磷酸酶等,枯草杆菌,50,ppt课件,二、放线菌,放线菌,(,actinomycetes,),放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌,(,Streptomyces,),。,链霉菌菌落呈放射状，具有分枝的菌丝体，菌丝直径,0.2,1.2m,。革兰氏染色阳性。菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子链。,链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的,16,羟化酶，可用于甾体转化。,51,ppt课件,放线菌,链霉菌属,诺卡氏菌属,52,ppt课件,诺卡氏菌属,链霉菌属,53,ppt课件,霉菌是一类丝状真菌。用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。,三、霉菌,54,ppt课件,黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。例如，糖化酶，,-,淀粉酶,酸性蛋白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纤维素酶，橙皮苷酶，核苷酶等。,55,ppt课件,米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强，这使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用。此外，米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶,P,等。,56,ppt课件,红曲霉可用于生产,-,淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。,57,ppt课件,青霉菌种类很多，其中产黄青霉（,Penicillium chrysogenum,）用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素）果胶酶、纤维素酶等。桔青霉（,Penicillium cityrinum,）用于生产,5,-,磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶,S1,、核酸酶,P1,等。,58,ppt课件,木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉生产的纤维素酶中包含有,C1,酶、,Cx,酶和纤维二糖酶等。此外，木霉中含有较强的,17-,羟化酶，常用于甾体转化。,59,ppt课件,60,ppt课件,61,ppt课件,酵母是一群属于真菌的单细,胞微生物。它分为两大类,:,一类能产生子囊孢子，称为,真酵母；另一类不能生成子,囊孢子，称为类酵母。通常,以出芽方式进行无性繁殖，,也有少数酵母进行有性繁殖。,细胞形状因菌株而异，有球,形、卵园形、柠檬形、梨形、,腊肠形、也有丝状。大小一,般为,1,30m,。,四、酵母,62,ppt课件,啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。,63,ppt课件,假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。具有较强的,17-,羟基化酶，可以用于甾体转化。,64,ppt课件,第三节 发酵工艺条件及控制,保藏细胞,细胞活化,细胞扩大培养,发酵,分离纯化,酶,原生质体,培养基,固定化原生质体,固定化细胞,预培养,无菌空气,65,ppt课件,一、细胞活化与扩大培养,细胞活化：保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的生命活力，这就叫细胞的活化。,种子培养基：用于细胞扩大培养的培养基。,氮源丰富,碳源少,温度、,pH,、溶解氧,接种量：,110%,66,ppt课件,二、培养基的配制,培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。,水,碳源,氮源,无机盐,生长因素,67,ppt课件,碳是构成细胞的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。,碳源可作能源，为生命活动提供能量,不同微生物对碳源的利用有所不同，在酶发酵生产中还要注意某些碳源对酶生物合成具有代谢调节作用（诱导和阻遏）,常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物,水是微生物最基本的组成分（,）,水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）,水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动,调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）,水,碳源,选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制,68,ppt课件,构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源）,氮源,有机氮源,蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,无机氮源,铵盐、硝酸盐,参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性,维持细胞结构的稳定性,调节细胞渗透压,控制细胞的氧化还原电位,有时可作某些微生物生长的能源物质,常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。,氮源,无机盐,需要注意合适的碳氮比,69,ppt课件,生长因子,生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。,分类：,化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类,功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应,实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子,70,ppt课件,培养基,各种生物对营养的需求,71,ppt课件,1,、选择适宜的营养物质,2,、营养物的浓度及配比合适,3,、物理、化学条件适宜,4,、经济节约,5,、精心设计、试验比较,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；,培养目的不同，原料的选择和配比不同；,不同阶段，培养条件也有所差异。,培养基的设计原则,72,ppt课件,实验室的常用培养基：,细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；,放线菌：高氏,1,号合成培养基培养；,酵母菌：麦芽汁培养基；,霉菌：查氏合成培养基；,例如枯草芽孢杆菌：,一般培养：肉汤培养基或,LB,培养基；,自然转化：基础培养基；,观察芽孢：生孢子培养基；,产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,73,ppt课件,枯草杆菌,BF7658-,淀粉酶发酵培养基,：,玉米粉,8%,，豆饼粉,4%,，磷酸氢二钠,0.8%,，硫酸铵,0.4%,，氯化钙,0.2%,，氯化按,0.15%,（自然,pH,）。,枯草杆菌,AS1.398,中性蛋白酶发酵培养基：,玉米粉,4%,，豆饼粉,3%,，麸皮,3.2%,糠,1%,磷酸氢二钠,0.4%,磷酸二氢钾,0.03%,（自然,pH,）。,黑曲霉糖化酶发酵培养基：,玉米粉,10%,，豆饼粉,4%,，麸皮,1%,（,pH4.4,5.0,）。,地衣芽孢杆菌,2709,碱性蛋白酶发酵培养基：,玉米粉,5.5%,豆饼,4%,磷酸氢二钠,0.4%,磷酸二氢钾,0.03%(pH 8.5),。,黑曲霉,AS 3.350,酸性蛋白酶发酵培养基,:,玉米粉,6%,豆饼粉,4%,玉米浆,0.6%,氯化钙,0.5%,氯化铵,1%,磷酸氢二钠,0.2%(pH 5.5),。,游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：,糖蜜,2%,，豆饼粉,2%,，磷酸氢二钠,0,。,1%,，硫酸镁,0,。,05%(pH 7.2),。,桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：,淀粉水解糖,5%,，蛋白胨,0.5%,硫酸镁,0.05%,氯化钙,0.04%,磷酸氢二钠,0.05%,磷酸二氢钾,0.05%(,自然,pH),。,黑曲霉,AS3.396,果胶酶发酵培养基,:,麸皮,5%,果胶,0.3%,硫酸铵,2%,磷酸二氢钾,0.25%,硫酸镁,0.05%,硝酸钠,0.02%,硫酸亚铁,0.001%(,自然,pH),。,枯草杆菌,AS1.398,碱性磷酸酶发酵培养基,:,葡萄糖,0.4%,乳蛋白水解物,0.1%,硫酸铵,1%,氯化钾,0.1%,氯化钙,0.1mmol/L,氯化镁,1.0mmol/L,磷酸氢二钠,20mol/L(,用,pH7.4,的,Tris-HCl,缓冲液配制,),回本节,74,ppt课件,三、,pH,调节,不同的细胞，其生长繁殖的最适,pH,值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适,pH,值在中性或碱性范围（,pH6.5,8.0,）；霉菌和酵母的最适生长,pH,值为偏酸性,(pH4,6),；植物细胞生长的最适,pH,值为,5,6,。,75,ppt课件,细胞发酵产酶的最适,pH,值与生长最适,pH,值往往有所不同。,细胞生产某种酶的最适,pH,值通常接近于该酶催化反应的最适,pH,值。,有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的,pH,值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。,例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的,pH,值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的,pH,值为中性时，主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。,76,ppt课件,培养基的,pH,值与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。,含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使,pH,值向酸性方向移动；,含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使,pH,值向碱性方向移动；,以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使,pH,值降低；,以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的,pH,值上升，然后又随着氨被细胞同化而使,pH,值下降；,磷酸盐的存在，对培养基的,pH,值变化有一定的缓冲作用。,在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基的,pH,值向酸性方向移动。,77,ppt课件,发酵过程中，,pH,值控制和调节方法,:,调节,pH,值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；,也可以使用缓冲液来稳定,pH,值；,或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的,pH,值，以满足细胞生长和产酶的要求。,78,ppt课件,四、温度的调节控制,不同的细胞有不同的最适生长温度。例如，枯草杆菌的最适生长温度为,34,37,，黑曲霉的最适生长温度为,28,32,等。,79,ppt课件,通常在生物学范围内每升高,10,，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，,对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。,这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的,mRNA,的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。,温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。,80,ppt课件,五、溶解氧的调节控制,细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量,ATP,。,81,ppt课件,在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。,培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。,溶氧速率与通,气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质,等有密切关系,。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。,82,ppt课件,溶解氧的调节控制,调节通气量,调节氧的分压,调节气液接触时间,调节气液接触面积,改变培养液的性质,控制溶解氧方法,83,ppt课件,六、提高酶产量的措施,1.,添加诱导物,2.,控制阻遏物浓度,3.,添加表面活性剂,4.,添加产酶促进剂,84,ppt课件,1.,添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导,-,半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。,诱导物一般可以分为,3,类,酶的作用底物,酶的催化反应产物,作用底物的类似物,85,ppt课件,1.,酶的作用底物,许多诱导酶都可以由其作用底物诱导产生。例如，乳糖诱导大肠杆菌,-,半乳糖苷酶。,L-,苯丙氨酸诱导苯丙氨酸解氨酶的合成等。,2.,酶的反应产物,有些酶可以由其催化反应产物诱导产生。例如，半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，它可以作为诱导物，诱导果胶酶的生物合成；纤维二糖诱导纤维素酶的生物合成；没食子酸诱导单宁酶的产生等。,3.,酶作用底物的类似物,有些酶的最有效的诱导物是可以与酶结合，但不能被酶催化的底物类似物。例如，异丙基,-,硫代半乳糖苷（,IPTG,）对,-,半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍；,86,ppt课件,阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。,1.,产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。,2.,分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。,控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。,为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当,控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。,采用其他较难利用的碳源，如淀粉等,采用补料、分次流加碳源,添加一定量的环腺苷酸（,cAMP,）,对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过,控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。,2.,控制阻遏物浓度,87,ppt课件,表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。,将适量的,非离子型表面活性剂,，,如,吐温（,Tween,）、曲通,(Triton),等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。,由于,离子型表面活性剂对细胞有毒害作用,，尤其是季胺型表面活性剂（如,新洁而灭,等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。,3.,添加表面活性剂,88,ppt课件,产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高,1,20,倍,添加聚乙烯醇（,Polyvinyl alcohol,）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，,要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度,。,4.,添加产酶促进剂,89,ppt课件,第四节 酶发酵动力学（自学）,发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速率、产物生长速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的学科。,发酵动力学主要包括,细胞生长动力学、产物生成动力学（产酶动力学）和基质消耗动力学,。,90,ppt课件,细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。,细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。,1950,年，,法国的莫诺德,(Monod),首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程,。,在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比。,假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，,为这种限制性基质浓度的函数。,K,S,为莫诺德常数，是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。,91,ppt课件,产酶动力学主要研究,细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律,。,产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为,非结构动力学,。,也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之,微观产酶动力学,或称为,结构动力学,。,92,ppt课件,固定化细胞指采用各种方法固定在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。,固定化细胞发酵产酶的特点：,提高酶产率,可以反复使用或连续使用较长时间,基因工程菌的质粒稳定，不易丢失,发酵稳定性好,缩短发酵周期，提高设备利用率,产品容易分离纯化,适用于胞外酶等包外产物的生产,第五节 固定化微生物细胞发酵产酶,93,ppt课件,2.,控制阻遏物的浓度：无机磷是碱性磷酸酶的阻遏物,3.,添加表面活性剂：增加细胞的通透性,4.,添加产酶促进剂：聚乙烯醇提高糖化酶的产量机理尚不清楚,94,ppt课件,95,ppt课件,