资源描述
,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,定量,PCR,是如何工作的,荧光定量,PCR,是什么,一种,实时监控,目的基因,PCR,扩增的技术,定量,PCR,是如何工作的,?,传统,PCR,具有以下基本要素,dsDNA,模版,primers,引物,dNTPs,核苷酸,PCR buffer,缓冲液,Taq,polymerase,DNA,聚合酶,等,TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA,ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,T,A,C,G,G,A,G,C,T,G,A,与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行:,双链DNA模板变性,引物与模板退火,引物延伸,新的扩增片段,定量,PCR,是如何工作的,?,理论上每经过一个,循环目的基因的数,量都会增加一倍,在,PCR,混合液中含有,荧光物质。,定量,PCR,是如何工作的,?,无论哪个型号，所有的荧光定量,PCR,仪都有三个共同的组成部分,定量,PCR,是如何工作的,?,PCR,PCR,Lots of PCR,PCR product,随着扩增的进行,荧光信号会随着,PCR,产物的增加而增加,定量,PCR,是如何工作的,?,Real-time PCR,仪会记录,每个循环,经过,每个滤光片,的,荧光信号,变化,定量,PCR,是如何工作的,?,Cycle 1,Filter A,Sample 1,Level:,为什么要用定量,PCR,？,重复性好,灵敏度高,动力学范围宽,一个,好的定量,PCR,数据,PCR,的动力学曲线和四个阶段,1:,重复性好,2:,灵敏度高,可以检测到,低拷贝,的目的基因,3:,动态范围宽,兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围,(,越大越好,),指数扩增期,重复性,准确性,动态范围,3,个阶段中,最佳时期,只有一个扩增期提供,高质量,的数据,指数扩增期,为什么要用定量,PCR,？,快：,节省时间和劳力（不用电泳检测）。,为什么要用定量,PCR,？,安全：,不用,EB,或放射性物质,定量,PCR,的化学原理,支持的化学试剂,SYBR,Green I,TaqMan,TaqMan,中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物,TaqMan,化学原理,第三段短片段序列，又称为探针,位于序列中间,TaqMan,化学原理,报告染料,Reporter dye,淬灭染料,Quencher dye,探针标记两种,染料分子,TaqMan,化学原理,Reporter,没有,荧光信号,（发射）,能量,光,(,激发,),完整的探针,TaqMan,化学原理,光能,然而，如果探针断裂了,TaqMan,化学原理,Denaturation,变性,(95,C),TaqMan,化学原理,Annealing,退火,(60,C),TaqMan,化学原理,Taq,酶登场,TaqMan,化学原理,找到引物序列,TaqMan,化学原理,开始延伸,(60,C),TaqMan,化学原理,Extension,延伸,(60,C),TaqMan,化学原理,Extension,延伸,(60,C),TaqMan,化学原理,?,Extension,延伸,(60,C),TaqMan,化学原理,Taq,酶很特别,具有,核酸外切酶活性,，,可以吃掉结合到模板上,的,DNA,片段,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,Taq,酶降解探针,TaqMan,化学原理,TaqMan,化学原理,TaqMan,化学原理,TaqMan,化学原理,TaqMan,化学原理,嗝,!,TaqMan,化学原理,TaqMan,化学原理,每个循环后,.,理论上，反应管中目的基因的数量增加一倍；,报告荧光的信号按照相应的比例增加；,荧光信号的增加可以在扩增曲线图上看到。,SYBR,Green I,化学原理,SYBR,Green I,染料,SYBR,Green I,染料,SYBR,Green I,染料,SYBR,Green I,染料的缺点,非特异结合,任意,双链,DNA,定量结果不准确,非特异性,PCR,产物信号,使用,熔解曲线,Melt curve(Dissociation Curve),检查反应特异性,Temperature,Fluorescence,Melt curve:,导数图谱,一个干净的峰,=,没有无关的产物,Temperature,Fluorescence,Melt curve,的杂峰,可能是引物二聚体,多余的峰是如何产生的,?,非特异扩增,1,、转录组中错误的目的基因。,2,、引物结合在正确的序列,但是既检测基因组,DNA,又检测,cDNA,(,由于短的内含子,基因组,DNA,有较高的,Tm,值,),。,解决方法,：设计引物时至少有一条跨过外显子的结合点,引物二聚体,到底用哪一种化学方法呢？,TaqMan,还是,SYBR,Green?.,TaqMan,还是,.,SYBR,Green I?,优点,更高的特异性,不会有引物二聚体干扰,支持多重荧光实验设计,实验方法易于优化,缺点,价格稍贵,优点,价格便宜,大部分基因以及少量样品均适用,缺点,特异性稍差,必须要做,Melt curves,不支持多重荧光设计,实验方法通常需要优化,定量,PCR,的数学原理,怎样获得结果,首先让我们定义扩增曲线的各种参数。,基 线,基线,（空白）信号的产生是由于背景引起的,阈 值,默认,阈值,=,基线（背景）信号标准偏差,x10,怎么获得结果,第一步：确定,Ct,值,怎么获得结果,第二步：比较,Ct,值,定量,PCR,的应用,绝对定量,相对定量,阴阳性鉴定,基因分型,定量,PCR,实验设计和流程,-,绝对定量和相对定量,定量,PCR,的实验要素,目的基因,样品,标准曲线,标准品,监控系统故障,阳性对照,监控污染,阴性对照,校准生物学误差,内参,(,管家基因,),校准物理误差,参比荧光,降低随机误差,重复实验,绝对定量实验,目的,：生成标准曲线，建立,Ct,值与浓度之间的线性关系,；,要求,：,浓度已知,标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%,仪器质量一致,试剂质量一致：模板纯度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓,冲液成分,反应条件一致：循环参数相同、同一次实验,标准品的准备,绝对定量实验,Dont:,制备,3,个点的,2,倍标准曲线,要求,：,Do:,制备至少,5,个点的标准曲线,(4 logs),去除离散的重复孔，或者有必要时去除整个梯度数据,如何制备标准曲线,绝对定量实验,选择目标提取,/PCR,纯化测定浓度调整浓度梯度稀释,Ct,值在,17-30,之间，覆盖全部样品浓度区间,10,倍连续梯度稀释方法：,1v,原液,(,标准品,i)+9v,稀释缓冲液，得标准品,ii,1v,标准品,ii+9v,稀释缓冲液，得标准品,iii,1v,标准品,iii+9v,稀释缓冲液，得标准品,iv,1v,标准品,iv+9v,稀释缓冲液，得标准品,v,注：不可由标准品,i,分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品,ii,、,iii,、,iv,、,v,标准品梯度稀释方法,绝对定量实验,扩增效率,：每个循环中靶分子被作为模板利用的百分比。,PCR,效率的测定,相对定量实验,示例实验,未处理样本,处理后样本,目的基因：,Plat1,实验目的：样本处理后，,Plat1,基因的表达量有什么变化？,实验流程,对照样本,两种相对定量的方法,比较,Ct,（,Ct,）法,相对标准曲线法,样本间目的基因的倍数关系,两种方法的区别,比较,Ct(,Ct),法,相对标准曲线法,*已知各个基因的扩增效率,*每个基因都要做一条标准曲线,*不需要每次都做标准曲线,*准确的扩增效率计算,*简单,经济,通量较高,*工作量大,成本高,通量较低,如何选择相对定量的方法,如何选择相对定量的方法,如何选择相对定量的方法,在,EXCEL,中制作图表,如何选择相对定量的方法,在,EXCEL,中制作图表,斜率,0.1,比较,Ct(,Ct),法,相对标准曲线法,Ct,法,必要条件：,目的基因和内参基因必须有相一致的扩增效率，并尽可能,接近,100%,。,Ct,法,如何确认扩增效率接近,100%,？,每条引物一条标准曲线,Ct,法,标准曲线可以帮助判定扩增效率,例如：斜率,-3.3,说明扩增效率接近,100%,；,更小的负值（如,-3.5,）说明扩增效率小于,100%,公式：,E=10,(-1/,斜率,),-1,Ct,法结果计算,步骤一：内参基因均一化样本差异,Ct,目的基因,-,Ct,内参基因,=,Ct,步骤二：处理样本和对照样本作比较,Ct,处理样本,-,Ct,对照样本,=,Ct,步骤三：使用公式计算,倍数变化,=2,-,Ct,公式含义,2,-,Ct,2=,循环间扩增产物量的变化（,PCR,扩增产物倍增）,Ct,=,处理样本和对照样本之间校正过大循环数的变化,所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的,倍数变化,。,Ct,法计算示例,Ct,法计算示例,为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理。,Ct,法计算示例,首先，选择对照样本；,接着，均一化对照样本；,然后，所有样本和对照样本进行比较。,Ct,法计算示例,最后，计算出倍数关系,2,Ct,。,相对标准曲线法,每对引物做一条相对标准曲线,相对标准曲线法,计算示例,表示倍数差异,实验内容,实验：,小麦中,Cu/Zn-SOD,基因含量的相对定量测定,实验材料：,小麦根和叶,目的基因：,sod,内参基因：,actin,相对标准曲线：,6,个梯度，,2,倍稀释,。,样品：,4,倍稀释,实验内容,按,PCR,反应样品数计算所需各试剂的体积数，加入以下各反应组分（目的基因与内参基因的样品各做三个重复）。,2SYBR,Premix,10L,上游引物,0.4 L,下游引物,0.4 L,ROX,0.4 L,dd H,2,O,7.8 L,cDNA,模板,1 L,实验内容,设置程序并运行,Segment 1,：,预变性,95,30s,；,Segment 2,：,PCR,循环,95,5s,；,60,34s,；,40 cycles,；,Segment 3,：,Dissociation Curve,分别记录各管反应的,Ct,值,。,实验内容,计算小麦幼苗叶中,Cu/Zn-SOD,相对于根的表达量：,1.,用内参,actin,基因的,Ct,值归一,Cu/Zn-SOD,基因的,Ct,值：,Ct,根,=Ct,（根，,Cu/Zn-SOD,）,-Ct,（根，,actin,）,Ct,叶,=Ct,（叶，,Cu/Zn-SOD,）,-Ct,（叶，,actin,）,2.,用校准样本的,Ct,值归一试验样本的,Ct,值：,CT=Ct,叶,-CT,根,3.,计算表达水平比率：,叶中,Cu/Zn-SOD,的相对表达根中,/Cu/Zn-SOD,的相对表达,=2,Ct,常见问题分析,1.,扩增效率为什么达不到,100%,主要原因：,样品不纯,扩增产物太长,没有选择合适的引物退火温度,引物的设计有错配,模板的序列特殊（比如,GC,含量高）,抑制物的存在,2.,扩增效率为什么会大于,100%,主要原因：,背景污染,非特异性扩增,3.,实验结果的重复性不好,对每个样品我们都要做重复实验（通常至少为,3,个重复）,目标是所有复孔,CT,值都相近,(,通常,SD,值小于,0.167,),3.,实验结果的重复性不好,重复性好,3.,实验结果的重复性不好,重复性差,3.,实验结果的重复性不好,主要原因,加样误差（操作,?,加样器,?,）,没有将试剂和样品充分混匀,低拷贝的样品泊松分布,没有使用,ROX,校准,(,或者其他校准孔间误差的方法,),3.,实验结果的重复性不好,ROX,校准,Master Mix,中,ROX,浓度固定,ROX,不参与,PCR,扩增，信号强度只与,Mix,用量有关,ROX,的功能：校准物理误差,耗材质量,：管盖厚度、透光性能,仪器稳定性,：孔间批间波动,反应体系监控,：蒸发,卤素灯光源,光学系统,盖膜或管盖,管壁光滑性,反应体积,3.,实验结果的重复性不好,ROX,校准,大大改善各拷贝复样的重复性,(,参比荧光,),(,报告荧光,),10 ng Sample A,Well 1,Well 2,Rn=Normalization=,报告荧光,/,参比荧光,(,这个,normalization,是自动的,),4.,其他问题,标准曲线线性不好,引物特异性不好,阴性对照有扩增,退火温度的选择,两步法还是三步法,日常实验中的注意事项,实验室分区,标准品的稀释最好使用独立的一套移液器,使用带滤芯的吸头,光学平盖八联管（或,96,孔板,+,光学盖膜），不可裸手触摸盖或膜。,尽量不要在八联管和,96,孔板上做标记,阳性对照和阴性对照,反应后,PCR,管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启。,扩增产物,50-200bp,，不要超过,300bp,Ct,值,17-30,之间,扩增效率在,90-110%,之间,引物的特异性要好，熔解曲线单峰。,内参基因的选择,选择跟目的基因表达量接近的,多个内参（当一个内参基因的表达量不够恒定时）,在不同样本中内参的,Ct,值不能相差过大,日常实验中的注意事项,
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