发酵工艺学课件第4章-菌种的选育与保藏

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 菌种选育与保藏,决定工业发酵生产水平的因素有：生产菌种、发酵工艺和后提取工艺。,最重要的是生产菌种。,发酵用菌种往往要打破原有的正常代谢，使之失去调节控制，从而大量积累所需要的代谢产物。,主要措施：,菌种选育,和,控制发酵条件,。,菌种值千金！,1985,年，日本日东公司建成了世界上第一个微生物法生产丙烯酰胺的工业性装置。第一代菌种为红球菌,Rhodococcus,sp.774,，活力达到,900,U/,mL,；第二代菌种为假单胞菌,Pseudomonas,chlororaphis,B23,，活力达到,1400,U/,mL,，在,1988,年替代了第一代菌株成为生产菌株；第三代菌种为玫瑰红球菌,Rhodococcus rhodochrous,J1,，经优化，其活力达到,2100,U/,mL,，于,1991,年成为新一代生产菌株。每一次菌种的更替、活力的提高，都带来工业生产产量的大幅度提高，年产量也由初始的,4000,吨,/,年提高到了,30000,吨,/,年。,菌种选育的技术,菌种育种技术：,自然突变,诱变育种,原生质体技术,杂交育种,分子育种,第一节 菌种的自然选育,不经过人工诱变处理，只根据菌种的自发突变而进行的筛选过程，称为自然选育或自然分离。,目的：淘汰衰退的菌种，保存优良的菌株,(,通过自然选育来获得优良,菌株,的效果远不如,诱变育种,),。,生产菌株与野生菌株相比较，表现出如下特点：,1,、生产菌种往往是代谢失控的突变株，因而表现为生活力比野生菌株弱；,2,、遗传特性不稳定，容易继续变异。,上述特点导致生产菌株容易发生变异。,变异是不定向的，负突变占多数，导致菌种退化，生产性能降低。,一、菌种衰退的原因分析,1,、菌种的遗传特性改变,（,1,）异核现象引起菌种这个微生物群体的变异。,（,2,）自发突变导致菌种遗传特性的改变。,（,3,）突变或杂交重组形成的杂种往往不稳定，容易发生回复突变或者产生分离子，以至在菌种这一群体产生具有不同基因型的个体。,内因和外因共同作用的结果：,内因是遗传因素，外因是环境因素。,2,、菌种生理状况的改变,（,1,）菌种不是纯一的个体，而是由一些混合变株组成，各个变株所占的比例决定该菌种的特性。,（,2,）菌种培养基可以通过影响发酵的生理状况而影响发酵产量。,（,3,）在某些培养条件下，某些菌种处于活化状态或阻遏状态而使菌种的生理状态改变。,自发突变是通过群体效应表现出来的，即突变基因的在生长繁殖过程中逐渐占优势后，才能使群体表现出变异的性状。,二、自然选育的方法,单菌落分离法。,霉菌或放线菌用石英砂打散孢子，获得分散的单个孢子。,第二节,诱变育种,诱变育种,：通过诱变剂进行诱变，可大大提高菌种的突变率，扩大变异的幅度，从中选育出具有优良特性的变异菌株，称为诱变育种。,优点,：速度快、收效大、方法简便，是当前菌种选育的主要方法。,缺点,：,诱变缺乏定向性,，必须配合大规模的筛选。,以高产为目标的诱变育种路线,物理诱变剂,紫外线、快中子、,X,射线、,射线、,射线、激光、离子束,化学诱变剂,碱基类似物,2,氨基嘌呤、,5,溴尿嘧啶、,8,氮鸟嘌呤,与碱基反应的物质,硫酸二乙酯、甲基硫酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基甲基脲、亚硝基乙基脲、亚硝酸、氮芥、四硝基喹啉、乙烯亚胺、羟胺,在,DNA,分子中插入或缺失一个或几个碱基,吖啶类染料,生物诱变剂,噬菌体、转座子,常用的各类诱变剂,一、诱变的原理,紫外线、,X,射线，,-,射线、快中子、,-,射线、激光。前三种方法应用多。,X,射线，,-,射线照在分子上，将分子中的电子打出来，称为,电离辐射,。紫外线称为非电离辐射。,(,一,),物理诱变,紫外线的作用,使,DNA,断裂，破坏核糖和磷酸之间的键联。,胞嘧啶,（,C,）,和鸟嘌呤,（,G,）,的水合作用，造成氢链的断裂。,胸腺嘧啶的,二聚体化,（一条链上相邻的胸腺嘧啶二聚体造成氢键的断裂，两条单链间的胸腺嘧啶二聚体化造成两条单链的交联，并使氢键断裂。在含有两条以上,DNA,链的真核细胞中，还造成,DNA,分子之间的交联作用。）,2,、,X,射线，,-,射线的作用,X,射线，,-,射线是电离射线，在其冲击下，各种分子都发生电离现象。照射到细胞上时，可以直接打击核酸，引起核酸电离，也可以先打击细胞的水，使水电离，形成,H,和,OH,的自由基，,H,和,OH,。,自由基的化学活性很强，能与核酸反应，产生次生的电离作用。核酸的离子同样极其活跃，能发生多种反应，如,引起,DNA,大分子断裂、使双螺旋中的氢键断裂或者断裂后交联等等均可以使菌体死亡或者产生突变,。,3,、离子注入法,离子束对生物体有能量沉积,(,即注入的离子与生物体大分子发生一系列碰撞并逐步失去能量,而生物大分子逐步获得能量进而发生键断裂、原子被击出位、生物大分子留下断键或缺陷的过程,),和质量沉积,(,即注入的离子与生物大分子形成新的分子,),双重作用,从而使生物体产生死亡、自由基间接损伤、染色体重复、易位、倒位或使,DNA,分子断裂、碱基缺失等多种生物学效应。因此,离子注入诱变可得到较高的突变率,且突变谱广,死亡率低,正突变率高,性状稳定。,4,、激光法,激光是一种与自然光不同的辐射光,它具有能量高度集中、颜色单一、方向性好、定向性强等特性。激光通过光效应、热效应和电磁效应的综合作用,能使生物的染色体断裂或形成片段,甚至易位和基因重组。,微波辐射,微波辐射属于一种低能电磁辐射,具有较强生物效应的频率范围在,300MHz300GHz,对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升,从而引起生理生化反应,;,非热效应指在微波作用下,生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下,生物体会产生一系列突变效应。,影响辐射的因素,辐射剂量,=,辐射强度,时间,A,、,氧效应，在照射时有氧，有利于形成,H,和,OH,。,B,、,光复活作用,C,、,许多药品对诱变和杀害效应有保护和消除作用。如丙酮酸、琥珀酸、和葡萄糖等共培养有很大的保护作用。,(,二,),化学诱变,1,、化学诱变剂：亚硝酸、羟氨、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、氮芥、亚硝基胍、吖啶黄、吖啶橙、碱基类似物等等。,2,、化学诱变的机理：,A,、,通过,掺入,DNA,分子而引发突变。如碱基类似物等。,B,、,通过直接,和,DNA,起化学反应而引起突变。如亚硝酸。,C,、,通过一对核苷酸的插入而引起突变。如吖啶类染料。,3,、化学诱变的处理程序：,制备诱变剂；,选择适当的诱变处理剂量；,选择适当,的,pH,和温度；,终止反应。,4,、剂量的选择,致死剂量：全部杀死。,亚致死剂量：杀死,90%-99%,。,弱致死剂量：杀死,30-50%,二、突变诱发的过程,DNA,复制,突变型,DNA,修复,不发生突变,前突变,诱变剂,进入细胞,与,DNA,分子接触,突变表型,1,、诱变剂接触,DNA,分子前,细胞的渗透性影响诱变效果，细胞质酶会和诱变剂反应。,基因的状态影响诱变效果，处于转录状态最有利于诱变。,诱变剂造成,DNA,分子的某一位置结构改变称为,前突变,。,2,、,DNA,损伤的修复,修复：是指针对已发生的缺陷而进行的补救机制。,光复活作用,切补修复,重组修复,SOS,修复,DNA,多聚酶的校正作用,其中,重组修改,和,SOS,修复,有利于发生突变。,(1),光修复,(light repairing),光修复酶,DNA聚合酶I,DNA连接酶,ATP,(2),切除修复,核酸内切酶，核酸外切酶，聚合酶，连接酶,核酸内切酶,核酸外切酶,聚合酶,连接酶,(3),重组修复,(recombination repairing),(4)SOS,修复,当,DNA,损伤广泛难以继续复制时，应急而诱发产生的一系列复杂的修复反应。,各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子,(,regulon,),的网络式调控系统。,这种修复使,DNA,保留的错误较多，会引起较广泛、长期的突变。,在大肠杆菌中,这种,SOS,修复由,recA-lexA,系统调控。正常情况下处于不活动状态。当有诱导信号如,DNA,损伤或复制受阻形成暴露的单链时，,recA,蛋白的蛋白酶活力就会被激活，分解阻遏物,lexA,蛋白,使,SOS,反应有关的基因去阻遏而先后开放,产生一系列细胞效应。引起,SOS,反应的信号消除后，,recA,蛋白的蛋白酶活力丧失，,lexA,蛋白又重新发挥阻遏作用。,（,5,）,DNA,多聚酶的校正作用,DNA,聚合酶对复制过程中出现的差错有较正功能。,如,DNA,多聚酶发生突变，核酸外切酶活性减弱，切除不正常核苷酸的能力减弱，菌体的突变率相应提高，称为,增变突变型,。,延伸知识点：易错,PCR,？,3,、从前突变到突变,修复系统引起校正差错和引起差错。,光修复作用,、,切除修复,和,DNA,多聚酶的校正作用,具有校正差错的作用，不利于突变的诱发；而,重组修复,和,SOS,修复系统,具有引起差错的作用，有利于突变的发生。,酶活性的因素对前突变向突变转化：,影响修复系统酶活性的都会影响前突变到突变的过程。,咖啡碱能抑制修复系统酶活性，因而增强诱变作用；氯霉素能抑制蛋白合成，降低突变率。,Ba,2+,抑制,DNA,多聚酶,3-5,核酸外切酶的活性，可提高突变率。,4,、从突变到突变型,出现突变基因，并不表示出现突变表型。因为表型的出现要落后于基因型的改变，称之为,表型延迟,。两种原因：,分离性延迟,生理性延迟,分离性延迟,野生型基因和突变型基因处于同一细胞中，基因处于不纯状态。,经过复制，分离，突变基因处于纯的状态。突变性状才能表达。,生理性延迟,基因由杂合状态变为纯合状态后，还不一定表现为突变型，必须等到原有的野生型基因产物稀释到某一程度后才能表现出来。,细胞要经历过几个世代，才能原有的基因产物降低到临界水平后，才能表现新的表型。,三个环节,:,1,、突变的诱发,2,、突变株的筛选,3,、突变株高产基因的表现,三、诱变育种方案的设计,诱变,育种的步骤,：,原始菌种,纯化,斜面,/,肉汤培养,单孢子,/,单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种,特性鉴定,保藏菌种,对照组,对照组,诱变育种的基本过程：,选择选择合适的出发菌株,制备待处理的菌悬液,诱变处理,筛选,保藏和扩大试验,1,、制定筛选目标,高产性状、生长速度、产孢子，消除色素和无益组分，能有效利用廉价的发酵原材料，改善发酵工艺中某些缺陷（如泡沫过多，自溶早）等，一般要筛选,1000,株。,2,制定筛选方案,（,1,）诱变过程 出发菌株的斜面、单孢子悬液的制备、孢子计数、单菌落分离,（,2,）筛选过程,:,A,，,传种斜面,:,选取生长良好的正常形态的菌株接种斜面；,B,，,留种保藏菌种,：生产能力提高,10%,以上的菌种要制成沙土管或冷冻管长期保存；,C,，,筛选高产菌株：,初筛量大、粗放，复筛要求逐步提高，优良菌株可考察其稳定性、菌种特性和最适培养条件优化。,四、突变的诱发,突变的诱发受菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状况和诱变处理时的环境条件的影响。,1,、出发菌株的选择：选择纯种、选择具有优良性状的出发菌株、选择对诱变剂敏感的菌株。,2,、诱变剂的选择,和诱变剂有关，还和遗传背景有关。,遗传不稳定，用温和诱变剂；不经常使用同一种诱变剂。,诱变剂自身特点，紫外线主要对,DNA,嘧啶碱基，亚硝酸盐主要对嘌呤碱基，结合使用，则诱变谱广。,诱变剂量，大剂量死亡率,90%99.9%,，小剂量,7580%,。,3,、影响诱变效果的因素,菌株的生理状态、被处理菌株的预培养和后培养条件、诱变处理时的外界条件都影响诱变效果。,致死率（,%,）,诱变剂量,五、突变株的筛选,育种工作中，常用的筛选方法有：,随机筛选,理性化筛选,（一）随机筛选,1,、随机筛选 摇瓶筛选、琼脂块筛选、筛选自动化和筛选工具微型化。,春雷霉素对稻瘟病菌有强烈的抑制作用,96,孔板,产蛋白酶菌株的筛选,（二）理性化筛选,理性化筛选是指：运用遗传学和生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的一些筛选方法，获得能大量形成产物的高产突变株。,1,、初级代谢产物高产菌株的筛选,育种的目的：打破原有的反馈调节系统。,（,1,）降低终产物浓度,筛选终产物营养缺陷型菌株（图,2-7,、,8,、,9,）,筛选细胞膜透性改变的菌株：生物素、油酸和甘油缺陷型菌株。,（,2,）筛选抗反馈突变菌株,筛选结构类似物抗性突变株,利用,回复突变,筛选抗反馈突变株,营养缺陷型（,auxotroph,）,天冬氨酸,人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸,中间产物,天冬氨酸激酶,中间产物,甲硫氨酸,苏氨酸,高丝氨酸,不能合成,可以大量积累,赖 氨 酸,人工诱变的,菌种不能产生,二羧酸合成酶对赖氨酸,反馈抑制不敏感，协同反馈抑制解除。,高丝氨酸,脱氢酶,2,、次级代谢产物高产菌株的筛选,（,1,）利用营养缺陷型筛选,如果初级代谢和次级代谢有共同的中间体，消除初级代谢产物对共同中间体的反馈调节，中间体大量积累，有利于次级代谢产物的合成。,莽草酸是芳香氨基酸和氯霉素共同的中间体。,注意：氨基酸营养缺陷型不适合工业发酵生产的要求。,缬氨酸与赖氨酸反馈抑制调节青霉素,(a),与苄基青霉素,(b),合成,莽草酸是芳香氨基酸和氯霉素共同的中间体,利用渗漏缺陷型,是遗传性障碍不完全的营养缺陷型，能少量合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量生长。,（,2,）筛选负变株的回复突变株,诱变后生产能力明显降低或完全丧失的突变株作为实验材料，进行诱变，挑选高产菌株。,（,3,）筛选去磷酸盐的调节突变株,磷酸盐抑制浓度下，正常产生抗生素的突变株；筛选磷酸盐结构类似物（如砷酸盐、钒酸盐）抗性突变株。,（,4,）筛选去除碳源代谢分解调节突变株,能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时，往往对许多其他代谢途径中的酶,(,包括许多抗生素合成酶和其他的酶,),有阻遏或抑制作用，成为抗生素发酵产量的限制因素，不利于发酵生产工艺的控制。,（,5,）筛选氨基酸结构类似物抗性突变株,许多抗生素和氨基酸有共同的前体，氨基酸结构类似物抗性突变株可解除反馈调节，增加前体量。,（,6,）筛选二价离子抗性突变株,加入能和产物（抗生素）或其中间体结合的生长抑制剂，抑制剂达一定浓度，抗生素低产菌株不能生长，而高产菌株能够存活下来，可筛选到高产菌株。,（,7,）筛选前体或前体结构类似物抗性突变株,在发酵培养基中添加前体可提高抗生素的产量，这类物质可能会对菌的生长产生毒性，而抑制生长。,（,8,）筛选自身所产生的抗生素的抗性突变株,高产菌株耐受自身所产生的抗生素的能力高于低产抗生素。,（,9,）其他突变株,消除无益组份的突变株,;,有利于分离和提取工艺的突变株,;,抗噬菌体突变株等。,六、突变基因的表现,发酵产量决定于菌种遗传特性和菌种的培养条件，菌种遗传特性的改变，则其培养条件也相应改变。,高产菌株筛选出来以后，要进行最佳发酵条件的研究，,使高产基因能在生产规模下得以表现。,第四节 杂交育种,杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状的菌株。,要求直接亲本菌株带有适当的遗传标记，如营养缺陷型、颜色和抗药性等。,杂交实际上是基因重组的过程，杂交育种也称之为重组育种。,基因重组,甲,生长快、产量低,生长快、产量高,乙,生长慢、产量高,面包酵母,:,对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生,CO,2,多，生长快；,酒精酵母,:,产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱,.,杂交,:,就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。,杂交育种的优点：,1,、由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本。,定向性强,。,2,、利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象。,一、细菌的杂交育种,转化,：受体菌直接吸收了来自供体菌的,DNA,片段，通过交换把它整合到自己的基因组中，从而获得了新的遗传特性的现象。,转导,：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的,DNA,片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。,接合,：指供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触，而实现大段的,DNA,传递现象。,但成功的报道还不多。,接合：,是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒,DNA,）,从供体菌转移给受体菌。能通过结合方式转移的质粒称为接合性质粒，不能通过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒。,二、放线菌的杂交育种,基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似,.,放线菌的遗传体系和杂交原理：,异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无重组体出现。,接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分合子。整,+,部分、部分,+,部分。,异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基本或选择培养基上生长。,（单交换，二体区）,重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重组子，产生重组子孢子。,2,放线菌的杂交技术,1),混合培养法：选择性平板法,互补的营养缺陷型亲本,亲本混合,接种完全培养基,单孢子悬液选择平板分离,长出菌落即重组体,异核系分析法,混合培养,单孢子悬液,分离于基本培养基,小而丰富的菌落即异核系,异核系分离于完全培养基,长出的菌落即分离子,2),平板杂交法：孢子平板影印杂交,将菌落培养在非选择性培养基上，形成孢子后，用影印培养法将菌落印至铺有试验菌孢子,(10,7,10,9,个,/,mL,),的,CM,平板上培养至孢子形成。把形成的孢子影印到一系列,SM,上,筛选各种重组体子代。,优点：能迅速地大量杂交，尤其是确定大量菌落与一个共同试验菌配对时的致育力更为方便。一个培养皿可排列,20,个菌株与一株配对菌株杂交。,平板杂交法,三、霉菌的杂交育种,有一类不产生有性孢子的丝状真菌，不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程称为准性生殖。,1952,年,Pontecorvo,等在研究构巢曲霉时首先发现了准性生殖现象。,指真菌不通过有性生殖而进行基因重组的过程。,分为三个阶段：,1,、异核体的形成,2,、二倍体的形成,3,、体细胞重组。,（一）准性生殖的,3,个阶段,1,异核体,(,heterocaryon,),形成,用,2,个不同营养缺陷型突变株的混合孢子，大量接种到基本培养基表面，可得到少量原养型菌落，在这些菌落中的某一条菌丝或一个细胞内若同时具有两种或两种以上基因型的细胞核，则称为异核体。这种现象称为异核现象。,2,核融合,(nuclear fusion),和杂合二倍体的形成,核融合是指异核体内,2,个不同基因型的单倍体细胞核在繁殖过程中融合成,1,个二倍体细胞核的过程（,10,-5,-10,-7,的概率）。杂合二倍体是指细胞核中含有,2,个不同来源染色体组的菌体细胞。,菌丝成斑点、扇面,扇变。,3,体细胞交换,(somatic crossing-over),与单倍体化,杂合二倍体极不稳定，在其进行有丝分裂过程中，有极少数细胞，其同源染色体的两条染色单体之间发生互换，在体细胞分裂时，产生,1,个或,1,个以上标记的纯合现象，从而形成具有新性状的单倍体杂合子。,单倍体化是指在一系列有丝分裂过程中一再发生的个别染色体减半，直至最后形成单倍体的过程。其单倍体化不是一次有丝分裂的结果，而是经过若干次有丝分裂过程，每次分裂都有可能从二倍体核中失去部分染色体，最后才回复成单倍体核。分裂次数取决于染色体数目，数目越多则其单倍体化所需要的分裂次数也越多。,（二）霉菌的杂交技术,1,遗传标记：营养缺陷型；抗药性突变等杂交亲本通常是经诱变得到的营养缺陷型。,2,异核体形成,二个亲本孢子混合接种液体培养基,1-2,天，挑出菌丝体洗涤，将菌丝置于基本培养基培养,7,天，由菌丝碎片长出的菌落即为异核体。,3,、杂合二倍体的形成：随染色体分离可形成多种重组分离子，分离子融合形成杂合子。,第五节 原生质体技术,用脱壁酶除去微生物细胞壁，制备原生质体，用,PEG,促进原生质体融合，形成重组子。,原生质体技术应用的先决条件是具有较高的原生质生形成率和再生率。,破壁前菌数,-,剩余菌数,原生质体形成率,=100%,破壁前菌数,用高渗溶液涂皿再生菌落数,用水涂皿再生菌落数,原生质体再生率,=,原生质体总数,血球计数板,Protoplast Fusion,Fusion(Hybridization):,The fusion of two cells in tissue,culture,Cell is removed by enzymatictreatment (protoplast),The two different strains after the removal of cell wall forced to fuse using polyethylene glycol(PEG),After the fusion the cells are allowed to regenerate their cell wall,Microbial Cells,(Species,#1),Cell Wall,Microbial Cells,(Species,#2),Cell Wall is Removed,Cell Wall is Removed,Two types of cells are fused together in the presence of PEG,where their nucleus combine with one another to form a new hybrid cell,Newly formed hybrid,一、原生质体融合的优越性,1,、不需要已知遗传系统,任何接合型均可,前提是具有较高的原生质体形成率和再生率,；,2,、亲本的基因组可发生多次交换，形成多种类型的重组子；,3,、重组频率特别高,20%,；,4,、利用理化因素钝化亲本菌株，有利于融合,后筛选。,二、原生质体融合技术,1,、标记菌株筛选：性能稳定、具有明显的遗传标记；（营养缺陷型和抗药性标记）,2,、原生质体制备：细菌用溶菌酶，酵母和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶。,1),菌体预处理,EDTA,、,Gly,、青霉素处理,；增加对酶处理的敏感性。,2),菌体培养时间：选择对数生长期细胞；,3),酶浓度：原生质体形成率和再生率的乘积达到最大时的酶浓度为最适；,4),酶解温度：,20-40,5),酶解时间,6),渗透压稳定剂：一般在高渗或等渗液中进行；,渗透压稳定剂的选择,原核生物为蔗糖、丁二酸钠；酵母为甘露醇、山梨醇；霉菌为,KCl,和,NaCl,Ca,2+,和,Mg,2+,是高渗培养基中的必需成分。,3,、原生质体融合：,PEG,分子量,4000-6000,为宜,和,Ca,2+,介导。,4,原生质体再生：再生培养基回复生长细胞壁。再生培养基由渗透压稳定剂和各种营养成份组成。原生质体再生可以提高抗生素产生菌的生产能力。再生菌株的正变率较高。,5,、融合子的选择：在选择培养基上通过亲本遗传标记得到互补的菌落挑出融合子，融合子再生后进行几代分离选择才能最后确定。,三、原生质体在诱变中的应用,1,、原生质体的诱变,原生质体失去了细胞壁，对外界环境的影响更加敏感。,2,、原生质体再生与常规诱变相结合。,原生质体对外界环境的影响更加敏感。,3,、灭活原生质体融合技术在育种中的应用。,灭活：原生质体失去再生的能力,四、原生质体融合技术在育种中的应用,抗生素生产菌、种内融合、种间融合。,（四）基因组重排（,genome shuffling,）,经典微生物诱变育种技术与原生质体融合技术的有机结合,技术特点,基因组重排,(Genome shuffling),技术是近几年新发展起来的一种微生物育种方法,该技术具有不需要事先知道供试微生物的遗传背景也可以对其进行遗传育种的突出优点,使之成为了一种极其高效的微生物育种方法。,基因组重排技术,首先对微生物菌体进行诱变，筛选出正向突变菌株，然后通过原生质体“递推式融合”使正向突变的若干个菌株进行原生质体融合，筛选出符合育种要求的融合子，从而在短时间内获得性状得到大幅度提高的菌株。,Increasing production of antibiotics(and other small molecules)-traditional methods,Obtain organism,that produces a specific compound-,Penicillium,mold originally made micrograms per liter of culture,Randomly,mutagenize,the organism and,screen,for increased production,repeat using top producing organism,Outcome:grams of,penicillum,per liter of culture(1000-fold increase in production),Time consuming and expensive process!,An alternative to simple random mutagenesis:genome shuffling,For millennia,selective breeding,on the basis of,biparental,mating,has led to the successful improvement of plants and animals to meet societal needs.At a molecular level,DNA shuffling mimics,yet accelerates,evolutionary processes,and allows the breeding and improvement of individual genes and,subgenomic,DNA fragments.We describe here whole-genome shuffling;a process that combines the advantage of multi-parental crossing allowed by DNA shuffling with the recombination of entire genomes normally associated with conventional breeding.We show that recursive genomic recombination within a population of bacteria can efficiently generate combinatorial libraries of new strains.When applied to a population of,phenotypically,selected bacteria,many of these new strains show marked improvements in the selected phenotype.We demonstrate the use of this approach through the rapid improvement of,tylosin,production from,Streptomyces,fradiae,.This approach has the potential to facilitate cell and metabolic engineering and provide a non-recombinant alternative to the rapid production of improved organisms.,The shuffling advantage:simultaneous recombination of entire genomes(breeding)with multiple parents,(old way),(new way),具体方法详见,赵凯,平文祥,张丽娜,刘军,林燕,金涛,周东坡,.,用,Genome shuffling,技术选育紫杉醇高产菌株,.,中国科学,C,辑,:,生命科学,2008,年 第,38,卷 第,3,期,:221,229,第六节 分子育种,基因工程手段,一、链霉菌的基因克隆,1,基本步骤：制备供体,DNA,片段制备载体,DNA DNA,体外重组受体菌制备原生质体重组,DNA,对原生质体细胞进行转化原生质体再生选择重组菌落,遗传标记筛选,2,链霉菌抗生素生物合成基因的克隆,合成某种抗生素所需的全套基因包括抗性,基因往往排列成簇,克隆策略：,1),检测克隆到标准宿主中的个别基因产物；,2),利用产生菌阻断突变株的互补作用；,3),利用突变克隆技术；,4),连锁的抗生素抗性基因的克隆；,5),用人工合成的寡核苷酸探测基因文库；,6),直接克隆抗生素产生菌,DNA,大片段到非生产菌中；,7),用一种抗生素的克隆,DNA,探测相关抗生素的同源基因。,3,利用基因工程技术生产新的抗生素,*将一种抗生素生物合成基因引入产生结构相近似的抗生素产生菌，可改造抗生素的结构。,二、用基因工程育种技术生产氨基酸,Thr,Trp,Pro,His,的工程菌已经达到工业生产水平。,现已证实，所有氨基酸合成酶基因可以在不同系统中克隆表达。,附一,:,核糖体工程,微生物核糖体具有调控次级代谢的功能。核糖体发生某些突变，不仅导致微生物形态、性状方面的变化，还可显著改变次级代谢。这种改变主要体现在两个方面：其一，使抗生素产生菌的产能得到大幅提高；其二，使突变株获得可生产原始菌所不生产的新产物的代谢能力。核糖体可从翻译和转录水平调节相关基因表达，从而调控微生物次级代谢。,微生物在恶劣的环境下,如,:,碳源、氮源或者磷酸盐营养突然匮乏时,自身的,rRNA,以及,tRNA,合成受到限制,从而导致蛋白合成水平降低,启动抗生素等次级代谢产物的合成,这种应答机制被称作应急反应。通过研究发现,小分子化合物四磷酸鸟苷,(,ppGpp,),是导致微生物出现应急反应中的主要响应因子,它能直接作用于,RNA,聚合酶,调节,tRNA,和,mRNA,合成水平。,作用位点与,ppGpp,邻近的抗生素利福平以及作用位点在核糖体上的抗生素,(,链霉素、庆大霉素、巴龙霉素、硫链丝菌肽,),等,都能模拟,ppGpp,的作用,使微生物产生类似应急反应的现象,从而使得菌株相关代谢产物产量增加或者产生新型化合物,基于这些发现,Ochi,等提出了核糖体工程育种技术的概念。,例一,天蓝色链霉菌中,通过筛选链霉素的抗性突变株,能得到放线紫红素产量为野生型,5,倍和,10,倍的突变株,;,组合链霉素、庆大霉素和利福平对其进行抗性突变,能使其产放线紫红素高达野生型的,48,倍，通过组合,8,种抗性筛选到的菌株,产量比野生型提高了,160,倍。,附二,:,表观遗传修饰,寻找新结构的代谢产物,基因组挖掘技术研究发现,真菌基因组中存在广泛的次级代谢生物合成途径,但由于实验室条件对于菌株的“驯化”,大量潜在的生物合成基因簇仍处于沉默状态,菌株实际产生的次级代谢产物远远低于预期。,表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如,DNA,甲基化和染色质构象变化等。,沉默基因簇一般呈异染色质状态，位于基因组的端粒附近，其结构基因受表观遗传机制调控，如,:,组蛋白的,(,去,),乙酰化和,DNA,的,(,去,),甲基化。,2007,年，,Keller,等研究发现，组蛋白去乙酰化酶基因缺失的构巢曲霉，其产生杂色曲霉素和青霉素的生物合成基因簇的转录水平大大提高，代谢产物发生明显改变。除此而外，在赤星病菌,和扩展青霉中，抑制组蛋白去乙酰化酶活力能使代谢产物谱增加。,第七节 菌种衰退、复壮和保藏,一、菌种退化现象,菌种退化（,degeneration,）是指群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象。常表现为，在形态上的分生孢子减少或颜色改变，甚至变形。,原因：,1,、自然突变：微生物的突变常常是负突变。,2,、环境条件：营养条件，温度，环境因子。,3,、衰退的防止：控制传代次数；创造良好的培养条件；利用不同类型的细胞进行接种；采用有效的菌种保藏方法。,4,、退化菌种的复壮：因为在退化的菌种中仍有一些保持原有菌种特性的细胞，故有可能采取一些相应措施，使这些细胞生长、繁殖，以更新退化的菌株，称之为菌种的复壮。常用方法是纯种分离；通过宿主体内生长进行；淘汰已衰退的个体。,二、菌种的保藏,（一）任务：菌种是微生物学核心，生命科学研究的基本材料。其任务是使菌种不导致死亡，同时尽可能将菌种优良特性保持下来不向坏的方向转化。,原则就是采用最合适的方法使菌种的变异和死亡减少到最低限度。,（二）菌种保藏原理和方法,1,原理：根据菌种的生理生化特点，人为地创造合适的环境条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少变异。人工环境主要从,低温、干燥和缺氧和缺乏营养物质,四个方面设计。,2,常用方法,1),斜面冰箱保藏：,4,保藏，,3-6M,2),沙土管保存：冰箱放置，,1Y,3),石蜡油封存：冰箱放置，,1Y,4),真空冷冻干燥保藏：,5Y,需要添加保护剂牛奶或血清,5),液氮保藏：,5-10Y,需加保护剂甘油,三、国内外主要菌种保藏机构,菌种是一个国家的重要资源，,1980,年我国成立微生物菌种保藏委员会,1,、,ATCC,：,American type Culture Collection,Rockvill,.Maryland.USA,（,美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市）,2,、,CSH,：,Cold Spring Harbor Lab.,USA,（,冷泉港研究室，美国）,3,、,IAM,：,Institute of Applied Micro-biology,Univ.of,Yokyo,Japan,（,日本东京大学应用微生物研究所，日本东京）,4,、,IFO,：,Institute for Fermentation.Osaka,Japan,（发酵研究所,日本大阪）,5,、,KCC,：,Kaken Chemical Company Ltd.Tokyo,，,Japan,（科研化学有限公司，日本东京）,6,、,NCTC,：,National Collection of Type Culture.London,United Kingdom,（国立标准菌种收藏所，英国伦敦）,7)NIH,：,National Institutes of Health.Bethesda,，,Maryland,，,U.S.A,（国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达）,8 NRRL,：,Northern Utilization Research and Development Division,U.S.Dept.of Agriculture,Peoria,USA,（,农业研究服务部菌种收藏所北方地区研究室，美国,）,中国微生物菌种保藏管理委员会,China Committee for Culture Collection,of Microorganisms CCCMS,下设,6,个菌种保藏中心：,1,、普通微生物菌种保藏管理中心,CCGMC,中国科学院微生物研究所 北京,(AS),：细菌、真菌；,中国科学院病毒研究所 武汉,(AS),：病毒；,2,、农业微生物菌种保藏中心：,中国农业科学院土壤肥料研究所，北京,3,、工业微生物菌种保藏中心：,轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京,4,、医学微生物菌种保藏中心：,中国医学科学院皮肤病研究所，南京,(ID),：真菌；,卫生部药品生物制品检定所 北京：细菌；,中国预防医学科学院病毒研究所，北京：病毒；,5,、抗生素菌种保藏中心：,中国医学科学院抗生素研究所 北京；,四川抗生素工业研究所,成都：新抗生素菌种；,华北制药厂抗生素研究所,石家庄：生产用抗生素菌种；,6,、兽医微生物菌种保藏中心,CVCC,：,农业部兽医药品监察所 北京,