真菌及检验课件

真菌学及检验真菌学及检验1 1、掌握真菌的概念、掌握真菌的概念 2、掌握真菌的生物学性状。、掌握真菌的生物学性状。3、了解真菌的致病性与免疫性。、了解真菌的致病性与免疫性。4、掌握真菌的常规检查法。、掌握真菌的常规检查法。目的与要求目的与要求目的与要求2真菌的基本性状真菌的基本性状3真菌（Fungus）概念:是一类有典型的细胞核和完整细胞器，不含叶绿素，不分根、茎、叶的真核细胞型微生物。细胞结构完整。真菌（Fungus）概念:4具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁）具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁）细胞壁含几丁质和（或）纤维素细胞壁含几丁质和（或）纤维素无根、茎、叶，不含叶绿素无根、茎、叶，不含叶绿素以腐生或寄生方式摄取养料以腐生或寄生方式摄取养料能进行有性生殖和（或）无性繁殖能进行有性生殖和（或）无性繁殖Fungus 特点特点具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁）Fungus 特点5第一节 真菌的生物学地位与分类生物学地位：生物学地位：真菌界真菌界分类：分类：真真菌菌界界粘菌门粘菌门(Myxomycota)真菌门真菌门(Eumycota)接合菌亚门接合菌亚门子囊菌亚门子囊菌亚门担子菌亚门担子菌亚门半知菌亚门半知菌亚门第一节 真菌的生物学地位与分类生物学地位：真菌界真粘菌门真6n对人类致病的真菌分为：对人类致病的真菌分为：浅部真菌浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，对治疗有顽固性，但影响身体较小对治疗有顽固性，但影响身体较小 深部真菌深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引：可侵犯全身内脏，严重的可引 起死亡。起死亡。此外有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中此外有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起，能产生毒素引起中毒性真菌病中毒性真菌病。对人类致病的真菌分为：7 第二节 真菌的生物学性状一、形态与结构二、培养与繁殖三、变异性与抵抗力 第二节 真菌的生物学性状一、形态与结构8一、真菌的形态与结构n结构：结构：比细菌复杂比细菌复杂 细胞壁细胞壁缺乏肽聚糖，缺乏肽聚糖，为为几丁质几丁质(Chitin)（多（多聚聚N乙酰葡萄糖组成）乙酰葡萄糖组成），并含葡聚糖，甘露，并含葡聚糖，甘露聚糖及蛋白质，某些酵母菌还含类脂体。聚糖及蛋白质，某些酵母菌还含类脂体。细胞内有较为典型的细胞内有较为典型的核结构核结构和和细胞器。细胞器。大小：大小：比细菌大几倍几十倍比细菌大几倍几十倍一、真菌的形态与结构结构：比细菌复杂大小：比细菌大几倍几十9单细胞单细胞真菌真菌多细胞多细胞真菌真菌菌丝菌丝(hypha)孢子孢子(spore)据功能分据功能分据是否有隔分据是否有隔分据形状分据形状分叶状孢子叶状孢子分生孢子分生孢子孢子囊孢子孢子囊孢子（霉菌（霉菌Mold）无性孢子无性孢子有性孢子有性孢子 许多病原性真菌因生活的环境如营养、温度氧气许多病原性真菌因生活的环境如营养、温度氧气等的改变，等的改变，孢子与菌丝两种形态可以互变孢子与菌丝两种形态可以互变，这类真菌，这类真菌称为称为二相性真菌二相性真菌。真菌（如：酵母菌、类酵母菌）（如：酵母菌、类酵母菌）单细胞真菌菌丝 据功能分叶状孢子（霉菌Mold）无性孢子 10真菌孢子和细菌芽胞的区别真菌孢子和细菌芽胞的区别真菌孢子真菌孢子细菌芽胞细菌芽胞抵抗力抵抗力不强，不强，60-70短时间短时间杀死杀死强，煮沸短时间不死强，煮沸短时间不死数目数目一条菌丝可产生多个一条菌丝可产生多个孢子孢子一个细菌体只形成一一个细菌体只形成一个芽孢个芽孢作用作用为繁殖方式之一为繁殖方式之一不是繁殖方式不是繁殖方式形成位置形成位置可在细胞内外形成可在细胞内外形成只在细菌细胞内形成只在细菌细胞内形成形状形状形态、色泽多样形态、色泽多样圆形或椭圆形圆形或椭圆形真菌孢子和细菌芽胞的区别真菌孢子细菌芽胞抵抗力不强，60-711 培养特性：培养特性：营养要求不高，在营养要求不高，在 沙沙 保保（SabouraudSabouraud）培养基上，）培养基上，PH4 PH46 6生长良好生长良好。浅部真菌浅部真菌：22222828，生长缓慢，大，生长缓慢，大多于多于1 12 2 周出现典型菌落。周出现典型菌落。深部感染真菌深部感染真菌：3737长的最好，生长较长的最好，生长较快，快，3 34 4 天即长出菌落。天即长出菌落。二、真菌的培养 培养特性：营养要求不高，在 沙 保（Sabourau12 1 1酵母型菌落酵母型菌落 为单细胞真菌的菌落，为单细胞真菌的菌落，形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖，如形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖，如新型隐球菌。新型隐球菌。2 2类酵母型菌落类酵母型菌落 外观似酵母菌落，但外观似酵母菌落，但可见伸入培养基中的假菌丝，它是由伸长的芽可见伸入培养基中的假菌丝，它是由伸长的芽生孢子形成，如白色念珠菌。生孢子形成，如白色念珠菌。3.3.丝状菌落丝状菌落 为多细胞真菌的菌落，由为多细胞真菌的菌落，由许多菌丝体组成。丝状菌落许多菌丝体组成。丝状菌落呈棉絮状呈棉絮状、绒球状绒球状、粉末状粉末状或或石膏粉样，石膏粉样，在下面和背面可显示不同在下面和背面可显示不同颜色，这些以及菌丝、孢子的形状都是真菌的颜色，这些以及菌丝、孢子的形状都是真菌的鉴别依据。鉴别依据。1酵母型菌落 为单细胞真菌的菌落，形态与一般13三、变异性与抵抗力易变异：经多次传代或培养时间过久，经多次传代或培养时间过久，其形态、菌落性状、色素及毒力等都可其形态、菌落性状、色素及毒力等都可以发生改变。用不同的培养基和不同温以发生改变。用不同的培养基和不同温度培养，其性状也可不同。度培养，其性状也可不同。三、变异性与抵抗力易变异：经多次传代或培养时间过久，其形态、14 抵抗力抵抗力 真菌真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂抵抗力较强毒剂抵抗力较强；对热敏感，一般对热敏感，一般601601小时小时可杀死真菌菌丝和孢子可杀死真菌菌丝和孢子。对。对2.5%2.5%碘酒，碘酒，10%10%福福尔马林都敏感，一般可用福尔马林薰蒸被真菌尔马林都敏感，一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。感染的房间。对抗细菌的抗生素不敏感对抗细菌的抗生素不敏感；灰黄；灰黄霉素、制霉菌素、二性霉素霉素、制霉菌素、二性霉素 克霉唑等对其有克霉唑等对其有抑制作用。抑制作用。抵抗力 15第三节 真菌的致病性与免疫性一、致病性一、致病性（一）病原性真菌感染（一）病原性真菌感染（二）条件致病性真菌感染（二）条件致病性真菌感染（三）真菌超敏反应性疾病（三）真菌超敏反应性疾病（四）真菌性中毒（四）真菌性中毒（五）真菌与肿瘤（五）真菌与肿瘤第三节 真菌的致病性与免疫性一、致病性161.1.病原性真菌感染病原性真菌感染：主要是外源性感染，主要是外源性感染，浅部真菌：浅部真菌：有亲嗜表皮角质特性，侵犯皮肤、指甲及有亲嗜表皮角质特性，侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。深部真菌：深部真菌：可侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性可侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。肉芽肿及坏死。2.2.条件致病性真菌感染条件致病性真菌感染 主要是内源性感主要是内源性感染（如白色念珠菌），此类感染与机体抵抗力，免疫染（如白色念珠菌），此类感染与机体抵抗力，免疫力降低及菌落失调有关，常发生于长期应用抗生素、力降低及菌落失调有关，常发生于长期应用抗生素、激素、免疫抑制剂、化疗和放疗的患者。激素、免疫抑制剂、化疗和放疗的患者。1.病原性真菌感染：主要是外源性感染，浅部真菌：有亲嗜表173 3真菌变态反应性疾病真菌变态反应性疾病 由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反应性肺泡炎和癣菌疹等。如哮喘，变态反应性肺泡炎和癣菌疹等。4真菌毒素中毒症：真菌毒素中毒症：侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。穗素。5、真菌毒素与肿瘤、真菌毒素与肿瘤 如：黄曲霉素诱发肝癌。如：黄曲霉素诱发肝癌。3真菌变态反应性疾病 4真菌毒素中毒症：18 二、免疫性 1非非特特异异性性免免疫疫：人人类类对对真真菌菌感感染染有有天天然然免免疫疫力力。皮皮肤肤分分泌泌短短链链脂脂肪肪酸酸和和乳乳酸酸、血血液液中中转转铁铁蛋蛋白白、中中性性粒粒细细胞胞和和单单核核巨巨噬噬细细胞胞的的吞吞噬噬作作用，以及正常菌群的拮抗作用。用，以及正常菌群的拮抗作用。2特异性免疫：特异性免疫：真菌感染中真菌感染中细胞免疫细胞免疫是机体是机体排菌杀菌及复原的关键。排菌杀菌及复原的关键。由于皮肤癣真菌与腐生性真菌间有共同抗由于皮肤癣真菌与腐生性真菌间有共同抗原，因此一般不做血清学检查原，因此一般不做血清学检查Ab辅助诊断此类辅助诊断此类真菌感染。真菌感染。二、免疫性 1非特异性免疫：人类对真菌感染有天然免19第四节真菌的常规检验法实验室检查：标本采集 分离培养 直接镜检 生化反应 染色镜检 免疫学试验以直接镜检和分离培养最重要。第四节真菌的常规检验法实验室检查：以直接镜检和分离培养最重20一、临床标本的采集 1 1皮肤的角质性物质：毛发、指皮肤的角质性物质：毛发、指(趾趾)甲、皮甲、皮 屑等。屑等。2 2各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳 垢、痰、粪便、尿液等。垢、痰、粪便、尿液等。3 3血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊 液、淋巴穿刺液等。液、淋巴穿刺液等。4 4脓汁及渗出物。脓汁及渗出物。一、临床标本的采集21 1.采集的标本要适宜 不同真菌感染 应采取不同的临床标本。浅部真菌感染如体癣，应刮取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取病发。深部真菌感染应取血液、脑脊液、脓汁等。2.在用药前采集标本 一般真菌标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。采集标本注意事项 1.采集的标本要适宜 不同真菌感染 应采取不同的临22 3.采集的标本量要足采集的标本量要足 血液和脑脊液标血液和脑脊液标本本5ml，胸腔液，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体，皮屑标本两块，活体组织两份组织两份(一份送病理科检查，一份作镜检一份送病理科检查，一份作镜检和培养和培养)。4.严格无菌操作严格无菌操作 并进行消毒处理，尤并进行消毒处理，尤其是采集血液和脑脊液标本，要避免污染其是采集血液和脑脊液标本，要避免污染杂菌。杂菌。5.采集标本立即送检采集标本立即送检 深部真菌标本最深部真菌标本最长不得超过长不得超过2h。3.采集的标本量要足 血液和脑脊液标本5m23二、检验程序二、检验程序24三、检验方法（一）标本直接检查 不染色标本检查 染色标本检查（二）培养检查（三）鉴定 三、检验方法（一）标本直接检查25 1.不染色标本的直接镜检：不染色标本的直接镜检：直直接接采采取取标标本本制制片片、显显微微镜镜下下直直接接观观察察，若若发发现现真真菌菌菌菌丝丝或或孢孢子子存存在在时时，即可初步判定为真菌感染。即可初步判定为真菌感染。1）标本制备：）标本制备：2）检查方法：）检查方法：3）封固液：）封固液：（一）标本直接检查 1.不染色标本的直接镜检：（一）标本直接检查26nKOH溶液溶液：n本本液液适适于于检检查查致致密密的的难难以以透透明明的的材材料料（如如毛毛发发、指指甲甲、鳞屑等）。鳞屑等）。n墨汁墨汁：n主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）n水合氯醛石炭酸乳酸封固液水合氯醛石炭酸乳酸封固液：n此液透明力较强，只限于不透明的标本。此液透明力较强，只限于不透明的标本。n生理盐水生理盐水：n为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。钾溶液。KOH溶液：墨汁：水合氯醛石炭酸乳酸封固液：生理27直接镜检的意义 有诊断意义，如浅部真菌病等；通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种,如假丝酵母菌的厚膜孢子等；直接镜检的局限性：阴性结果不能排除真菌感染；有假阳性结果。因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。直接镜检的意义直接镜检的局限性：28 2.染色标本检查（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。（2）乳酸酚棉蓝染色（3）糖原染色：又又称称过过碘碘SchiffSchiff（简简称称PASPAS或或PASHPASH）。真真菌菌细细胞胞壁壁由由纤纤维维素素和和几几丁丁质质组组成成，含含有有多多糖糖。过过碘碘酸酸使使糖糖氧氧化化成成醛醛，再再与与品品红红亚亚硫硫酸酸结结合合，成成为为红红色色，故故菌菌体体均均染染成成红红色色。为为真真菌菌染染色色最最常常用用的的方法之一。方法之一。2.染色标本检查（2）乳酸酚棉蓝染色（3）糖原染色：29（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色。（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主主要要用用于于新新生生隐隐球球菌菌荚荚膜膜的的染染色色。隐隐球球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。（6）荧光染色：主主要要使使用用吖吖啶啶橙橙和和氢氢氧氧化化钾钾来来染染直直接接涂片、培养涂片及组织切片涂片、培养涂片及组织切片。（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色。（5）粘蛋白卡红染色法30（二）培养检查法1 1、培养基、培养基常用真菌培养基及用途培培 养养 基基用用 途途沙保培养基沙保培养基 真菌的常规培养真菌的常规培养 放线菌酮氯霉素琼脂放线菌酮氯霉素琼脂 同上同上 玉米粉聚山梨酯玉米粉聚山梨酯80琼脂琼脂 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子观察白假丝酵母菌的厚膜孢子马铃薯葡萄糖琼脂马铃薯葡萄糖琼脂 观察真菌菌落色素，用于鉴别观察真菌菌落色素，用于鉴别尿素琼脂尿素琼脂 用生化反应鉴别真菌用生化反应鉴别真菌 （红色癣菌和石膏样癣菌）（红色癣菌和石膏样癣菌）心脑浸液葡萄糖血琼脂心脑浸液葡萄糖血琼脂 深部真菌培养深部真菌培养（二相性真菌）（二相性真菌）（二）培养检查法1、培养基常用真菌培养基及用途培 养 基用31 2、培养方法 接种工具为接种钩、接种针和接种环接种工具为接种钩、接种针和接种环 （1）直接培养）直接培养 （2）试管培养）试管培养：多用于菌种传代接种与保存。多用于菌种传代接种与保存。（3）大培养）大培养：用平皿或培养瓶培养。用平皿或培养瓶培养。（4）小培养）小培养 可观察结构特征及发育的全过程。可观察结构特征及发育的全过程。1）玻片培养玻片培养 2）郭可大钢圈小培养法郭可大钢圈小培养法：材材料料：培培养养基基、钢钢环环（用用铁铁环环或或废废电电线线之之铝铝丝丝制制成成）、载载玻玻片片、盖盖玻玻片片、毛毛细细管管、石石蜡等。蜡等。2、培养方法 接种工具为接种钩、接种针和接种环 32 先将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖先将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖玻片之间，钢环开口处深入底部加入培养基。玻片之间，钢环开口处深入底部加入培养基。加够半环即可凝固。用接种针取少量材料，加够半环即可凝固。用接种针取少量材料，接种在培养基表面。接种在培养基表面。将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿纱布以防干燥。逐日镜纱布以防干燥。逐日镜 检，一般约检，一般约7 7即可长即可长好。根据菌丝和孢子的结构特点进行真菌类好。根据菌丝和孢子的结构特点进行真菌类别的鉴定。别的鉴定。真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养真菌的温度为28，但深部真菌为37。菌落是鉴别真菌的方法。先将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖玻片之间，钢环开口33（三）真菌的鉴定（三）真菌的鉴定 方法：方法：1 1、生化反应生化反应 2 2、芽管形成芽管形成 3 3、厚膜孢子生成厚膜孢子生成 4 4、免疫学免疫学及及分子生物学试验等。分子生物学试验等。（三）真菌的鉴定 341.真菌的生化反应 用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。菌等。1 1）糖）糖(醇醇)类发酵试验类发酵试验 37，观察糖发酵情况。2 2）同化碳源试验）同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基固体同化碳源培养基(45)(45)混合，然后在培养混合，然后在培养基上分别加糖，置基上分别加糖，置2525孵育观察结果。若孵育观察结果。若24h24h后无变化可重复加糖。如能同化则在糖周围有后无变化可重复加糖。如能同化则在糖周围有生长圈，否则无生长。一般对双糖发酵的真菌生长圈，否则无生长。一般对双糖发酵的真菌能同化或利用糖类或碳源。主要用于能同化或利用糖类或碳源。主要用于酵母菌酵母菌的的鉴定。鉴定。1.真菌的生化反应2）同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的35 3）同化氮源试验 同化碳源试验相同，但 需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。用于观察酵母菌对硝酸钾的利用情况。4）明胶液化试验：某些真菌可液化明胶。5）尿素分解试验 石膏样癣菌、新生隐球菌等可分解尿素。6）测定淀粉样化合物：某些真菌可产生淀粉样化合物，遇碘后变成兰色。7）牛乳分解试验；真菌可使牛乳酸化、凝固、胨化、碱化等 3）同化氮源试验 同化碳源试验相同，但 需用无氮源36 2.核酸检测 医学真菌的鉴定手段引入了分子医学真菌的鉴定手段引入了分子生物学的鉴定方法，从核酸碱基生物学的鉴定方法，从核酸碱基G+CmolG+Cmol分析、限制性片段长度多态分析、限制性片段长度多态性性(RFLP)Southern(RFLP)Southern印迹分析到脉冲场印迹分析到脉冲场凝胶电泳凝胶电泳(PFGE)PCR(PFGE)PCR指纹、随机扩增多指纹、随机扩增多态性态性DNA(RAPD)DNA(RAPD)以及以及DNADNA特殊片段测序特殊片段测序等。等。2.核酸检测 37单细胞真菌单细胞真菌（酵母菌）（酵母菌）多细胞真菌多细胞真菌单细胞真菌 多细胞真菌38真菌及检验课件39真菌菌丝的形态真菌菌丝的形态真菌菌丝的形态40真真 菌菌 无无 性性 孢孢 子子 形形 态态芽生孢子芽生孢子厚膜孢子厚膜孢子关节孢子关节孢子小分生孢子小分生孢子大分生孢子大分生孢子1叶状孢子2分生孢子真 菌 无 性 孢 子 形 态芽生孢子厚膜孢子关节孢子小分生41芽生孢子芽生孢子芽生孢子42Candida albicans-chlamydospore formation on cornmeal agar假丝酵母菌假丝酵母菌 厚膜孢子厚膜孢子Candida albicans-chlamydosp433、孢子囊孢子3、孢子囊孢子44孢子囊孢子孢子囊孢子45真菌及检验课件46真菌及检验课件47真菌的有性孢子（根霉菌的接合孢子）真菌的有性孢子48假丝酵母菌菌落假丝酵母菌菌落假丝酵母菌菌落49真菌及检验课件50真菌及检验课件51 青 霉 菌 青 霉 菌52石膏样癣菌石膏样癣菌53真菌及检验课件54真菌及检验课件55真菌及检验课件56真菌及检验课件57真菌及检验课件58 新新 型型 隐隐 球球 菌菌 新 型 隐 球 菌59真菌及检验课件60嗜银染色（嗜银染色（GMSGMS）嗜银染色（GMS）61