病毒学病毒的检验培训课件

病毒学病毒的病毒学病毒的检验检验常用的病毒检验方法包括：常用的病毒检验方法包括：一、病毒的分离一、病毒的分离鉴定定二、病毒感染性的二、病毒感染性的检测三、病毒三、病毒颗粒粒检测四、病毒的血清学四、病毒的血清学检查五、病毒的分子五、病毒的分子(蛋白和核酸蛋白和核酸)检测2 2病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验一、病毒的分离鉴定一、病毒的分离鉴定n病毒的分离与病毒的分离与病毒的分离与病毒的分离与鉴鉴定定定定可可可可为为病毒感染提供最病毒感染提供最病毒感染提供最病毒感染提供最为为直直直直接的病原学接的病原学接的病原学接的病原学证证据，同据，同据，同据，同时时可可可可为进为进一步的病毒学一步的病毒学一步的病毒学一步的病毒学研究提供材料。研究提供材料。研究提供材料。研究提供材料。n病毒的分离和病毒的分离和病毒的分离和病毒的分离和鉴鉴定（含定（含定（含定（含义义）：指从病人、：指从病人、：指从病人、：指从病人、带带毒者、外界毒者、外界毒者、外界毒者、外界环环境中采集境中采集境中采集境中采集标标本本本本经过经过适当的适当的适当的适当的处处理理理理,采用一系列物理、化学、生物学等手段采用一系列物理、化学、生物学等手段采用一系列物理、化学、生物学等手段采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病将病将病将病毒从毒从毒从毒从标标本中分离出来本中分离出来本中分离出来本中分离出来,并通并通并通并通过过有关特异性方法有关特异性方法有关特异性方法有关特异性方法鉴鉴定属于何种病毒定属于何种病毒定属于何种病毒定属于何种病毒,这这一方法称一方法称一方法称一方法称为为病毒的分离病毒的分离病毒的分离病毒的分离与与与与鉴鉴定。定。定。定。3 3病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒的分离与病毒的分离与鉴定包括：定包括：n1、病毒材料的采集与准、病毒材料的采集与准备 2、病毒的、病毒的分离与培养分离与培养3、病毒的形、病毒的形态学学观察察4、病毒的理化特性病毒的理化特性测定定5、病毒的血清、病毒的血清学学鉴定及病毒的分子生物学定及病毒的分子生物学鉴定等基本定等基本过程。程。4 4病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验（一）标本的采取与送检（一）标本的采取与送检n病料采集适当与否病料采集适当与否病料采集适当与否病料采集适当与否,直接影响病毒的直接影响病毒的直接影响病毒的直接影响病毒的检测结检测结果。果。果。果。n一般可采集一般可采集一般可采集一般可采集发发病或死亡病或死亡病或死亡病或死亡动动物的物的物的物的组织组织病料、分泌病料、分泌病料、分泌病料、分泌物或物或物或物或粪粪便等便等便等便等,主要因主要因主要因主要因动动物及病毒的种物及病毒的种物及病毒的种物及病毒的种类类而异而异而异而异,n例如例如例如例如检测检测犬犬犬犬细细小病毒或小病毒或小病毒或小病毒或轮轮状病毒状病毒状病毒状病毒,一般一般一般一般应应采腹泻采腹泻采腹泻采腹泻幼犬或幼犬或幼犬或幼犬或犊犊牛的牛的牛的牛的粪粪便便便便;n怀怀疑疑疑疑为为口蹄疫的猪或牛口蹄疫的猪或牛口蹄疫的猪或牛口蹄疫的猪或牛,则应则应采其水疱液及水疱采其水疱液及水疱采其水疱液及水疱采其水疱液及水疱皮送皮送皮送皮送检检。5 5病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验应注意下列原则：n1.1.对对本身本身本身本身带带有有有有杂杂菌菌菌菌 (如咽喉拭子、如咽喉拭子、如咽喉拭子、如咽喉拭子、粪粪便便便便)或易或易或易或易受受受受污污染的染的染的染的标标本，要本，要本，要本，要进进行病毒分离培养行病毒分离培养行病毒分离培养行病毒分离培养时时，应应使用使用使用使用抗生素抗生素抗生素抗生素。n2.2.因病毒在室温中易失去活性，因病毒在室温中易失去活性，因病毒在室温中易失去活性，因病毒在室温中易失去活性，标标本本本本应应低温低温低温低温保保保保存并尽快送存并尽快送存并尽快送存并尽快送检检。n3.3.血清学血清学血清学血清学诊诊断断断断标标本的采取本的采取本的采取本的采取应应在在在在发发病初期和病后病初期和病后病初期和病后病初期和病后2 23w3w内各取内各取内各取内各取1 1份血清，以便份血清，以便份血清，以便份血清，以便对对比比比比双份血清抗双份血清抗双份血清抗双份血清抗体效价的体效价的体效价的体效价的动态变动态变化。化。化。化。6 6病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验标本处理：标本处理：n n采集采集采集采集样样本在接种本在接种本在接种本在接种细细胞、胞、胞、胞、鸡鸡胚或胚或胚或胚或动动物之前物之前物之前物之前,都需要做适都需要做适都需要做适都需要做适当的当的当的当的处处理理理理,以保以保以保以保证证病毒分离的成功几率。病毒分离的成功几率。病毒分离的成功几率。病毒分离的成功几率。n n采集的器官或采集的器官或采集的器官或采集的器官或组织样组织样本：如肺本：如肺本：如肺本：如肺脏脏、脑脑、肝、脾、淋巴、肝、脾、淋巴、肝、脾、淋巴、肝、脾、淋巴结结等等等等,可取一小可取一小可取一小可取一小块进块进行行行行充分研磨充分研磨充分研磨充分研磨,加入含青、加入含青、加入含青、加入含青、链链霉素的霉素的霉素的霉素的HanksHanks液液液液,离心取上清液作离心取上清液作离心取上清液作离心取上清液作为为接种物接种物接种物接种物;n n鼻液、鼻液、鼻液、鼻液、脓脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、汁、乳汁等分泌物或渗出液、汁、乳汁等分泌物或渗出液、汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪粪便便便便,应应加入加入加入加入高高高高浓浓度的度的度的度的抗生素抗生素抗生素抗生素,充分混匀后充分混匀后充分混匀后充分混匀后,置置置置44冰箱内冰箱内冰箱内冰箱内处处理理理理24h24h或或或或过过夜夜夜夜,离心后取上清做接种用离心后取上清做接种用离心后取上清做接种用离心后取上清做接种用;n n咽喉拭子在取咽喉拭子在取咽喉拭子在取咽喉拭子在取样样后后后后应应迅速将其浸泡入含有迅速将其浸泡入含有迅速将其浸泡入含有迅速将其浸泡入含有2%2%小牛血小牛血小牛血小牛血清和一定清和一定清和一定清和一定浓浓度的青、度的青、度的青、度的青、链链霉素的霉素的霉素的霉素的HanksHanks液中液中液中液中,充分刷洗充分刷洗充分刷洗充分刷洗棉棉棉棉拭子拭子拭子拭子,反复反复反复反复冻冻融融融融3535次次次次,离心后取上清液作离心后取上清液作离心后取上清液作离心后取上清液作为为接种材料。接种材料。接种材料。接种材料。7 7病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验（二）病毒的分离与培养（二）病毒的分离与培养n n细细胞培养、胞培养、胞培养、胞培养、鸡鸡胚和胚和胚和胚和实验动实验动物物物物可用于病毒的分离与培养可用于病毒的分离与培养可用于病毒的分离与培养可用于病毒的分离与培养,其中其中其中其中细细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。n n用于病毒分离与培养的用于病毒分离与培养的用于病毒分离与培养的用于病毒分离与培养的细细胞有胞有胞有胞有原代原代原代原代细细胞、二倍体胞、二倍体胞、二倍体胞、二倍体细细胞胞胞胞株和株和株和株和传传代代代代细细胞系胞系胞系胞系,一般一般一般一般说说来来来来,本本本本动动物的原代物的原代物的原代物的原代细细胞最胞最胞最胞最为为敏敏敏敏感感感感,但不如但不如但不如但不如传传代代代代细细胞方便易得胞方便易得胞方便易得胞方便易得.n n例如猪例如猪例如猪例如猪传传染性胃染性胃染性胃染性胃肠肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或二倍体代或二倍体代或二倍体代或二倍体细细胞胞胞胞,但但但但该细该细胞生胞生胞生胞生长缓长缓慢慢慢慢,通常用通常用通常用通常用PD5(PD5(猪甲猪甲猪甲猪甲状腺状腺状腺状腺细细胞系胞系胞系胞系)取代。取代。取代。取代。n n培养方法常用的有培养方法常用的有培养方法常用的有培养方法常用的有静置培养和旋静置培养和旋静置培养和旋静置培养和旋转转培养培养培养培养,有的病毒如有的病毒如有的病毒如有的病毒如轮轮状病毒状病毒状病毒状病毒,初次分离初次分离初次分离初次分离时时旋旋旋旋转转培养的成功率培养的成功率培养的成功率培养的成功率较较静置培养静置培养静置培养静置培养高。高。高。高。8 8病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验1、病毒的分离、病毒的分离n不同的病毒分离不同的病毒分离不同的病毒分离不同的病毒分离时时采用不同的分离方法采用不同的分离方法采用不同的分离方法采用不同的分离方法,这这主主主主要取决于目的要取决于目的要取决于目的要取决于目的病毒的生物学特性病毒的生物学特性病毒的生物学特性病毒的生物学特性。n主要有主要有主要有主要有细细胞培养法、胞培养法、胞培养法、胞培养法、鸡鸡胚接种法、胚接种法、胚接种法、胚接种法、动动物接种物接种物接种物接种法法法法等等等等,而而而而对细对细胞、胞、胞、胞、鸡鸡胚不敏感胚不敏感胚不敏感胚不敏感,又没有合适又没有合适又没有合适又没有合适动动物物物物模型的病毒模型的病毒模型的病毒模型的病毒,可采用可采用可采用可采用基因克隆基因克隆基因克隆基因克隆的方法。的方法。的方法。的方法。9 9病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验（1）动物接种法物接种法n 是最原始的病毒培养方法，根据病毒种是最原始的病毒培养方法，根据病毒种是最原始的病毒培养方法，根据病毒种是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类类不不不不同，同，同，同，选择选择敏感敏感敏感敏感动动物及适宜接种部位，如嗜神物及适宜接种部位，如嗜神物及适宜接种部位，如嗜神物及适宜接种部位，如嗜神经经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑脑内，内，内，内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。n动动物的接种途径要根据物的接种途径要根据物的接种途径要根据物的接种途径要根据病毒种病毒种病毒种病毒种类类、实验动实验动物物物物种种种种类类、接种材料接种材料接种材料接种材料等等等等选择选择合适的接种途径。合适的接种途径。合适的接种途径。合适的接种途径。动动物接种途径的物接种途径的物接种途径的物接种途径的选择选择正确与否正确与否正确与否正确与否对对提高病毒分离提高病毒分离提高病毒分离提高病毒分离成功率也起到重要作用。成功率也起到重要作用。成功率也起到重要作用。成功率也起到重要作用。1010病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验常见病毒常用实验动物及接种途径P37P371111病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验n n在在在在动动物物物物实验实验的期的期的期的期间间或或或或结结束束束束时时采集采集采集采集动动物血液物血液物血液物血液检测检测病毒或特病毒或特病毒或特病毒或特异性抗体。异性抗体。异性抗体。异性抗体。n n实验动实验动物采血分物采血分物采血分物采血分为为致死性采血和非致死性采血两种。致死性采血和非致死性采血两种。致死性采血和非致死性采血两种。致死性采血和非致死性采血两种。n n致死性采血致死性采血致死性采血致死性采血是指尽量采集是指尽量采集是指尽量采集是指尽量采集动动物血物血物血物血,直至直至直至直至动动物死亡。物死亡。物死亡。物死亡。n n非致死性采血非致死性采血非致死性采血非致死性采血是指采集一定量的是指采集一定量的是指采集一定量的是指采集一定量的动动物血而不致物血而不致物血而不致物血而不致动动物死亡。物死亡。物死亡。物死亡。n n对对采血采血采血采血动动物物物物,应应在禁食在禁食在禁食在禁食24h24h后采血。采血后采血。采血后采血。采血后采血。采血应应无菌操作。无菌操作。无菌操作。无菌操作。n n不同不同不同不同动动物采用不同的采血方法。常用的有物采用不同的采血方法。常用的有物采用不同的采血方法。常用的有物采用不同的采血方法。常用的有心心心心脏脏采血法、采血法、采血法、采血法、眼眶眼眶眼眶眼眶采血法、采血法、采血法、采血法、颈颈静脉静脉静脉静脉采血法、采血法、采血法、采血法、颈动颈动脉脉脉脉采血法、采血法、采血法、采血法、耳静脉耳静脉耳静脉耳静脉采采采采血法等。根据血法等。根据血法等。根据血法等。根据实验动实验动物和物和物和物和实验实验条件灵活条件灵活条件灵活条件灵活选选用。用。用。用。实验动物采血1212病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验n鸡鸡胚胚胚胚对对多种病毒敏感。多种病毒敏感。多种病毒敏感。多种病毒敏感。n不同病毒在不同病毒在不同病毒在不同病毒在鸡鸡胚的不同部位的生胚的不同部位的生胚的不同部位的生胚的不同部位的生长长特性差异特性差异特性差异特性差异很大很大很大很大,因此因此因此因此选择选择适当的接种途径是病毒分离成适当的接种途径是病毒分离成适当的接种途径是病毒分离成适当的接种途径是病毒分离成功的关功的关功的关功的关键键。n一般采用孵化一般采用孵化一般采用孵化一般采用孵化9 91414天的天的天的天的鸡鸡胚，根据病毒种胚，根据病毒种胚，根据病毒种胚，根据病毒种类类不同，将病毒不同，将病毒不同，将病毒不同，将病毒标标本本本本 接种于接种于接种于接种于鸡鸡胚的不同部位，胚的不同部位，胚的不同部位，胚的不同部位，最常用的最常用的最常用的最常用的鸡鸡胚接种部位有：胚接种部位有：胚接种部位有：胚接种部位有：尿囊腔、尿囊腔、尿囊腔、尿囊腔、绒绒毛尿毛尿毛尿毛尿囊膜囊膜囊膜囊膜、卵黄囊卵黄囊卵黄囊卵黄囊和和和和羊膜腔羊膜腔羊膜腔羊膜腔等。等。等。等。（2）鸡胚培养法胚培养法1313病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验n是将离体活是将离体活是将离体活是将离体活组织块组织块或分散的或分散的或分散的或分散的组织细组织细胞加以培胞加以培胞加以培胞加以培养的技养的技养的技养的技术总术总称，称，称，称，为为病毒分离病毒分离病毒分离病毒分离鉴鉴定中的最常用定中的最常用定中的最常用定中的最常用的基本方法。的基本方法。的基本方法。的基本方法。（3）细胞培养胞培养(cell culture)法或法或组织培养法培养法 (tissue culture)1414病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验n一般一般一般一般选择选择生生生生长长旺盛旺盛旺盛旺盛的敏感的敏感的敏感的敏感细细胞用于病毒分离。胞用于病毒分离。胞用于病毒分离。胞用于病毒分离。n少数病毒例外少数病毒例外少数病毒例外少数病毒例外,例如犬、猪等的例如犬、猪等的例如犬、猪等的例如犬、猪等的细细小病毒小病毒小病毒小病毒,病毒病毒病毒病毒的复制有的复制有的复制有的复制有赖赖于于于于分裂旺盛分裂旺盛分裂旺盛分裂旺盛的的的的细细胞胞胞胞,因此需将病毒因此需将病毒因此需将病毒因此需将病毒接种与接种与接种与接种与细细胞培养胞培养胞培养胞培养同步同步同步同步进进行。行。行。行。n细细胞培养技胞培养技胞培养技胞培养技术术在病毒在病毒在病毒在病毒发现发现、病毒研究、疫苗、病毒研究、疫苗、病毒研究、疫苗、病毒研究、疫苗研制、抗病毒研制、抗病毒研制、抗病毒研制、抗病毒药药物物物物筛选筛选等病毒学等病毒学等病毒学等病毒学发发展的展的展的展的历历程程程程中中中中发挥发挥着重要作用。着重要作用。着重要作用。着重要作用。1515病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验常见人类病毒的敏感细胞P36P36P361616病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验（4）分子生物学技）分子生物学技术n对对体外培养的体外培养的体外培养的体外培养的细细胞、胞、胞、胞、鸡鸡胚、胚、胚、胚、动动物不敏感的病物不敏感的病物不敏感的病物不敏感的病毒毒毒毒,可采用可采用可采用可采用现现代分子生物学技代分子生物学技代分子生物学技代分子生物学技术术,如基因克隆技如基因克隆技如基因克隆技如基因克隆技术术,对对病毒的全基因病毒的全基因病毒的全基因病毒的全基因进进行克隆行克隆行克隆行克隆,构建表达构建表达构建表达构建表达载载体体体体,并能表达出病毒并能表达出病毒并能表达出病毒并能表达出病毒样颗样颗粒。粒。粒。粒。1717病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验（三）病毒的鉴定（三）病毒的鉴定步步骤：1、初步、初步鉴定定2、接种、接种动物的物的观察察3、最、最终鉴定定1818病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验1、初步鉴定、初步鉴定(1)(1)根据根据根据根据临临床表床表床表床表现现、流行病学特征与、流行病学特征与、流行病学特征与、流行病学特征与标标本来源。本来源。本来源。本来源。初步判定属于哪一初步判定属于哪一初步判定属于哪一初步判定属于哪一类类病毒病毒病毒病毒n脑脑炎患者炎患者炎患者炎患者脑脑脊液脊液脊液脊液 乙型乙型乙型乙型脑脑炎病毒炎病毒炎病毒炎病毒n秋季腹泻病人秋季腹泻病人秋季腹泻病人秋季腹泻病人粪粪便便便便轮轮状病毒状病毒状病毒状病毒n发烧发烧小孩（下肢麻痹）小孩（下肢麻痹）小孩（下肢麻痹）小孩（下肢麻痹）粪粪便便便便脊髓灰脊髓灰脊髓灰脊髓灰质质炎炎炎炎病毒病毒病毒病毒1919病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验(2)病毒的生物学特性病毒或接种分离病毒或接种分离病毒或接种分离病毒或接种分离标标本后，本后，本后，本后，细细胞出胞出胞出胞出现现的病理性的病理性的病理性的病理性变变化。化。化。化。不同的病毒具有不同的敏感不同的病毒具有不同的敏感不同的病毒具有不同的敏感不同的病毒具有不同的敏感细细胞，而又能引起不同的胞，而又能引起不同的胞，而又能引起不同的胞，而又能引起不同的细细胞病胞病胞病胞病变变效效效效应应。例如：上呼吸道例如：上呼吸道例如：上呼吸道例如：上呼吸道标标本接种到本接种到本接种到本接种到细细胞培养上胞培养上胞培养上胞培养上,出出出出现细现细胞融合胞融合胞融合胞融合,产产生多核巨生多核巨生多核巨生多核巨细细胞胞胞胞现现象，就要考象，就要考象，就要考象，就要考虑虑副黏病毒、疱疹病毒、副黏病毒、疱疹病毒、副黏病毒、疱疹病毒、副黏病毒、疱疹病毒、肾肾综综合征出血合征出血合征出血合征出血热热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到WI-38WI-38或人胚肺或人胚肺或人胚肺或人胚肺细细胞培养上出胞培养上出胞培养上出胞培养上出现现散在的、局部堆散在的、局部堆散在的、局部堆散在的、局部堆积积的巨的巨的巨的巨大大大大细细胞，胞，胞，胞，则则要考要考要考要考虑虑巨巨巨巨细细胞病毒的可能性；胞病毒的可能性；胞病毒的可能性；胞病毒的可能性；肠肠道病毒能使道病毒能使道病毒能使道病毒能使细细胞胞胞胞圆缩圆缩、变变小、分散，往往全部小、分散，往往全部小、分散，往往全部小、分散，往往全部细细胞受到破坏；腺病胞受到破坏；腺病胞受到破坏；腺病胞受到破坏；腺病毒能使毒能使毒能使毒能使细细胞胞胞胞肿肿大，大，大，大，颗颗粒增多，粒增多，粒增多，粒增多，细细胞聚集成葡萄状。胞聚集成葡萄状。胞聚集成葡萄状。胞聚集成葡萄状。细胞病变效应哪三种现象？哪三种现象？2020病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验血吸附和血凝作用n有些病毒感染有些病毒感染有些病毒感染有些病毒感染细细胞后胞后胞后胞后,细细胞膜上可胞膜上可胞膜上可胞膜上可镶镶嵌着病毒嵌着病毒嵌着病毒嵌着病毒基因基因基因基因编码产编码产生的糖蛋白生的糖蛋白生的糖蛋白生的糖蛋白,其中有些能吸附特定其中有些能吸附特定其中有些能吸附特定其中有些能吸附特定种种种种类类的的的的红细红细胞胞胞胞,或将或将或将或将细细胞培养胞培养胞培养胞培养单层单层刮下后刮下后刮下后刮下后,经过经过适当适当适当适当处处理理理理,可以凝集特定种可以凝集特定种可以凝集特定种可以凝集特定种类类的的的的红细红细胞胞胞胞,此此此此类类糖糖糖糖蛋白在蛋白在蛋白在蛋白在细细胞表面形成刺突胞表面形成刺突胞表面形成刺突胞表面形成刺突,称称称称为为血凝素血凝素血凝素血凝素。n如流感病毒、副黏病毒、如流感病毒、副黏病毒、如流感病毒、副黏病毒、如流感病毒、副黏病毒、风风疹病毒等感染疹病毒等感染疹病毒等感染疹病毒等感染细细胞后可胞后可胞后可胞后可产产生血吸附生血吸附生血吸附生血吸附现现象象象象,或通或通或通或通过过血凝血凝血凝血凝实验实验来来来来证证实实病毒的存在。病毒的存在。病毒的存在。病毒的存在。2121病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验n新城疫病毒新城疫病毒新城疫病毒新城疫病毒能吸附和凝集能吸附和凝集能吸附和凝集能吸附和凝集豚鼠豚鼠豚鼠豚鼠红细红细胞胞胞胞n风风疹病毒疹病毒疹病毒疹病毒能吸附和凝集能吸附和凝集能吸附和凝集能吸附和凝集鸽鸽子子子子、绵绵羊羊羊羊等等等等红细红细胞胞胞胞n病毒的血凝作用往往需要一定的病毒的血凝作用往往需要一定的病毒的血凝作用往往需要一定的病毒的血凝作用往往需要一定的pHpH和温度和温度和温度和温度,利利利利用血吸附和血凝集用血吸附和血凝集用血吸附和血凝集用血吸附和血凝集现现象可以象可以象可以象可以为为初步判定属于初步判定属于初步判定属于初步判定属于何种病毒提供重要思路。何种病毒提供重要思路。何种病毒提供重要思路。何种病毒提供重要思路。例子例子2222病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验干扰现象n n一种病毒感染一种病毒感染一种病毒感染一种病毒感染细细胞后胞后胞后胞后,可以干可以干可以干可以干扰扰另一种病毒在另一种病毒在另一种病毒在另一种病毒在该细该细胞内胞内胞内胞内的增殖的增殖的增殖的增殖,这这种种种种现现象称象称象称象称为为干干干干扰现扰现象象象象。n n利用干利用干利用干利用干扰现扰现象可以象可以象可以象可以检查检查出一些不引起出一些不引起出一些不引起出一些不引起细细胞病胞病胞病胞病变变、血凝、血凝、血凝、血凝、血吸附的病毒。血吸附的病毒。血吸附的病毒。血吸附的病毒。n n如：如：如：如：鼻病毒鼻病毒鼻病毒鼻病毒就可以利用干就可以利用干就可以利用干就可以利用干扰现扰现象象象象进进行初步行初步行初步行初步鉴鉴定。定。定。定。n n实验组实验组：感染人胚感染人胚感染人胚感染人胚肾细肾细胞管或培养板胞管或培养板胞管或培养板胞管或培养板细细胞用人或豚鼠胞用人或豚鼠胞用人或豚鼠胞用人或豚鼠红细红细胞做血吸附胞做血吸附胞做血吸附胞做血吸附实验实验,如果阴性如果阴性如果阴性如果阴性,用用用用HanksHanks液洗液洗液洗液洗涤涤3 3次次次次,然然然然后接种后接种后接种后接种仙台病毒仙台病毒仙台病毒仙台病毒,33 33 培养培养培养培养48h,48h,做血吸附做血吸附做血吸附做血吸附实验实验。n n对对照照照照组组：正常正常正常正常细细胞只接种胞只接种胞只接种胞只接种仙台病毒仙台病毒仙台病毒仙台病毒。n n实验现实验现象：如果象：如果象：如果象：如果对对照照照照组组血吸附阳性血吸附阳性血吸附阳性血吸附阳性,而而而而实验组实验组阴性阴性阴性阴性,说说明明明明先前接种的先前接种的先前接种的先前接种的标标本中存在能干本中存在能干本中存在能干本中存在能干扰扰仙台病毒增殖的病毒仙台病毒增殖的病毒仙台病毒增殖的病毒仙台病毒增殖的病毒,此此此此结结果即果即果即果即为为干干干干扰试验扰试验阳性。阳性。阳性。阳性。2323病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验（3）病毒的理化特性测定n包括病毒包括病毒包括病毒包括病毒核酸核酸核酸核酸类类型型型型鉴鉴定定定定、耐酸性耐酸性耐酸性耐酸性试验试验、脂溶脂溶脂溶脂溶剂剂敏感性敏感性敏感性敏感性试验试验、耐耐耐耐热热性性性性试验试验、胰蛋白胰蛋白胰蛋白胰蛋白酶酶敏感敏感敏感敏感性性性性试验试验等等等等n通常以通常以通常以通常以细细胞培养或胞培养或胞培养或胞培养或鸡鸡胚培养胚培养胚培养胚培养为观为观察体系察体系察体系察体系,应设应设立已知病毒立已知病毒立已知病毒立已知病毒为对为对照。照。照。照。病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据2424病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验代谢抑制法鉴定病毒核酸类型n病毒核酸病毒核酸病毒核酸病毒核酸类类型型型型鉴鉴定定定定是病毒理化特性是病毒理化特性是病毒理化特性是病毒理化特性测测定的最定的最定的最定的最主要指主要指主要指主要指标标。添加添加添加添加氟脱氧尿核苷氟脱氧尿核苷氟脱氧尿核苷氟脱氧尿核苷(FUDR)(FUDR)或或或或类类似物于病毒培似物于病毒培似物于病毒培似物于病毒培养物中养物中养物中养物中,病毒复制被抑制者病毒复制被抑制者病毒复制被抑制者病毒复制被抑制者,即即即即为为DNADNA病毒病毒病毒病毒,否否否否则为则为RNARNA病毒病毒病毒病毒,也可用也可用也可用也可用DNADNA酶酶或或或或RNARNA酶酶分分分分别别作用作用作用作用,以判定以判定以判定以判定核酸的性核酸的性核酸的性核酸的性质质。绿绿豆芽豆芽豆芽豆芽酶酶可降解可降解可降解可降解单单股核酸股核酸股核酸股核酸,用它可用它可用它可用它可进进一步一步一步一步鉴鉴定定定定核酸是核酸是核酸是核酸是单单股或双股股或双股股或双股股或双股。2525病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验n可直接用可直接用可直接用可直接用纯纯化的病毒核酸通化的病毒核酸通化的病毒核酸通化的病毒核酸通过过电镜观电镜观察察察察，对对其其其其进进行行行行鉴鉴定。但技定。但技定。但技定。但技术术要求要求要求要求较较高。高。高。高。n近年来近年来近年来近年来,PCRPCR核酸核酸核酸核酸测测序技序技序技序技术术的的的的应应用使得病毒核用使得病毒核用使得病毒核用使得病毒核酸型酸型酸型酸型鉴鉴定的可行性大定的可行性大定的可行性大定的可行性大为为增加。增加。增加。增加。（观观看看看看PCRPCR视频视频）2626病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验脂溶性试验n用乙用乙用乙用乙醚醚或或或或氯氯仿仿仿仿处处理待理待理待理待检检病毒液病毒液病毒液病毒液,而后与未而后与未而后与未而后与未处处理理理理者比者比者比者比较较其其其其TCIDTCID5050的的的的变变化化化化,以判断是否敏感。以判断是否敏感。以判断是否敏感。以判断是否敏感。n乙乙乙乙醚醚、氯氯仿、脱氧胆酸仿、脱氧胆酸仿、脱氧胆酸仿、脱氧胆酸钠钠等脂溶等脂溶等脂溶等脂溶剂剂能破坏病能破坏病能破坏病能破坏病毒的脂毒的脂毒的脂毒的脂质质包膜。包膜。包膜。包膜。n有包膜的病毒有包膜的病毒有包膜的病毒有包膜的病毒对对脂溶脂溶脂溶脂溶剂剂敏感敏感敏感敏感,受脂溶受脂溶受脂溶受脂溶剂剂的的的的处处理理理理能使病毒失去感染性能使病毒失去感染性能使病毒失去感染性能使病毒失去感染性;无包膜的病毒往往无包膜的病毒往往无包膜的病毒往往无包膜的病毒往往对对脂脂脂脂溶溶溶溶剂剂有抵抗力。因此有抵抗力。因此有抵抗力。因此有抵抗力。因此,用乙用乙用乙用乙醚醚等可以等可以等可以等可以鉴鉴定所分定所分定所分定所分离的病毒离的病毒离的病毒离的病毒是否有包膜是否有包膜是否有包膜是否有包膜。2727病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒粒的结构模式图病毒粒的结构模式图壳粒壳粒壳粒壳粒衣壳衣壳衣壳衣壳核心（核样物）核心（核样物）核心（核样物）核心（核样物）核衣壳核衣壳包膜包膜包膜包膜包膜病毒包膜病毒包膜子粒包膜子粒包膜子粒包膜子粒2828病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验处理方法处理方法:n n将病毒将病毒将病毒将病毒悬悬液液液液20003000r/min20003000r/min离心离心离心离心20min,20min,取上清液取上清液取上清液取上清液,分成两分成两分成两分成两组组：n n一一一一组为试验组组为试验组：按与乙：按与乙：按与乙：按与乙醚醚4:14:1的比例振的比例振的比例振的比例振荡荡混合均匀混合均匀混合均匀混合均匀,管口管口管口管口密封好密封好密封好密封好,4,4过过夜后夜后夜后夜后,20003000r/min,20003000r/min离心离心离心离心20min20min。此。此。此。此时时液液液液体分体分体分体分为为两两两两层层,上上上上层为层为乙乙乙乙醚醚,下下下下层为层为病毒液病毒液病毒液病毒液。吸取下。吸取下。吸取下。吸取下层层部分部分部分部分,避免混有乙避免混有乙避免混有乙避免混有乙醚醚。n n另一另一另一另一组为对组为对照照照照组组：不加乙：不加乙：不加乙：不加乙醚醚,处处理方法同理方法同理方法同理方法同试验组试验组。n n将两将两将两将两组组的病毒液同的病毒液同的病毒液同的病毒液同时时测测定病毒滴度定病毒滴度定病毒滴度定病毒滴度,如果如果如果如果试验组试验组病毒滴病毒滴病毒滴病毒滴度明度明度明度明显显降低降低降低降低,与与与与对对照照照照组组有明有明有明有明显显差异差异差异差异,说说明病毒明病毒明病毒明病毒对对乙乙乙乙醚醚敏感敏感敏感敏感,属于属于属于属于有膜病毒有膜病毒有膜病毒有膜病毒。如果两。如果两。如果两。如果两组组的病毒滴度没有的病毒滴度没有的病毒滴度没有的病毒滴度没有显显著差异著差异著差异著差异,说说明病毒明病毒明病毒明病毒对对乙乙乙乙醚醚有抵抗力有抵抗力有抵抗力有抵抗力,属于属于属于属于无膜病毒无膜病毒无膜病毒无膜病毒。2929病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验耐酸性试验n耐酸性耐酸性耐酸性耐酸性试验试验和脂溶和脂溶和脂溶和脂溶剂剂敏感性敏感性敏感性敏感性试验试验是最常做的两是最常做的两是最常做的两是最常做的两项项理化指理化指理化指理化指标标。n耐酸性耐酸性耐酸性耐酸性试验设试验设置置置置缓缓冲液冲液冲液冲液pHpH为为3 3和和和和7 7的病毒做比的病毒做比的病毒做比的病毒做比较较。n通通通通过肠过肠道道道道传传播的病毒播的病毒播的病毒播的病毒对对酸有抵抗力酸有抵抗力酸有抵抗力酸有抵抗力,借此可借此可借此可借此可鉴别鉴别某些病毒。某些病毒。某些病毒。某些病毒。n如如如如肠肠道病毒道病毒道病毒道病毒与与与与鼻病毒鼻病毒鼻病毒鼻病毒同同同同为为RNARNA病毒病毒病毒病毒,肠肠道病毒道病毒道病毒道病毒对对酸有抵抗力酸有抵抗力酸有抵抗力酸有抵抗力,而鼻病毒而鼻病毒而鼻病毒而鼻病毒则则没有。没有。没有。没有。3030病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验处理方法处理方法:n试验组试验组：病毒：病毒：病毒：病毒悬悬液用液用液用液用0.1mol/L0.1mol/L的的的的HClHCl调调pHpH至至至至3.0,373.0,37放置放置放置放置2h2h后后后后,用用用用5.6%5.6%的的的的NaHCONaHCO3 3调调pHpH至至至至7.27.2n对对照照照照组组：除了不加酸外：除了不加酸外：除了不加酸外：除了不加酸外,其他步其他步其他步其他步骤骤和和和和试验组试验组相同。相同。相同。相同。n将两将两将两将两组组同同同同时时测测定病毒滴度定病毒滴度定病毒滴度定病毒滴度,如果如果如果如果试验组试验组病毒滴度病毒滴度病毒滴度病毒滴度明明明明显显降低降低降低降低,与与与与对对照照照照组组有有有有显显著差异著差异著差异著差异,说说明明明明病毒病毒病毒病毒对对酸敏酸敏酸敏酸敏感感感感,不属于不属于不属于不属于肠肠道病毒道病毒道病毒道病毒。如果两。如果两。如果两。如果两组组的病毒滴度没有的病毒滴度没有的病毒滴度没有的病毒滴度没有显显著差异著差异著差异著差异,说说明病毒明病毒明病毒明病毒对对酸有抵抗力酸有抵抗力酸有抵抗力酸有抵抗力,属属属属肠肠道病毒道病毒道病毒道病毒。3131病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验2、接种动物的观察、接种动物的观察n根据根据根据根据动动物的感染范物的感染范物的感染范物的感染范围围,可初步推断属于何种病毒。可初步推断属于何种病毒。可初步推断属于何种病毒。可初步推断属于何种病毒。n接种接种接种接种动动物的物的物的物的观观察是非常重要的察是非常重要的察是非常重要的察是非常重要的,通通通通过观过观察察察察试验动试验动物的反物的反物的反物的反应应有有有有时时也可初步也可初步也可初步也可初步鉴鉴定何种病毒。定何种病毒。定何种病毒。定何种病毒。n每天都需要每天都需要每天都需要每天都需要观观察察察察,有有有有时时1d1d需要需要需要需要观观察数次。察数次。察数次。察数次。3232病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验观察指标:n n动动物物物物发发病的病的病的病的潜伏期潜伏期潜伏期潜伏期,病毒感染都有一定的潜伏期。因病毒感染都有一定的潜伏期。因病毒感染都有一定的潜伏期。因病毒感染都有一定的潜伏期。因此此此此,潜伏期在病毒的初步潜伏期在病毒的初步潜伏期在病毒的初步潜伏期在病毒的初步鉴鉴定方面也是非常重要的。如定方面也是非常重要的。如定方面也是非常重要的。如定方面也是非常重要的。如乙乙乙乙脑脑小鼠小鼠小鼠小鼠脑脑内接种潜伏期一般内接种潜伏期一般内接种潜伏期一般内接种潜伏期一般为为4d,4d,狂犬病狂犬病狂犬病狂犬病脑脑内接种潜内接种潜内接种潜内接种潜伏期一般伏期一般伏期一般伏期一般为为68d68d。n n接种接种接种接种动动物的物的物的物的饮饮食情况食情况食情况食情况是否有是否有是否有是否有变变化化化化,活活活活动动与与与与饮饮食能力是食能力是食能力是食能力是否否否否发发生改生改生改生改变变,粪粪便便便便是否有是否有是否有是否有变变化。化。化。化。n n每天在同一每天在同一每天在同一每天在同一时间测时间测量量量量动动物的物的物的物的体重体重体重体重和和和和体温体温体温体温,比比比比较较接种前接种前接种前接种前后后后后变变化情况。化情况。化情况。化情况。n n观观察察察察局部或全身性反局部或全身性反局部或全身性反局部或全身性反应应,如出如出如出如出现现毛松、毛松、毛松、毛松、软软弱无力、震弱无力、震弱无力、震弱无力、震颤颤、不安、抽搐、不安、抽搐、不安、抽搐、不安、抽搐,甚至死亡等全身症状甚至死亡等全身症状甚至死亡等全身症状甚至死亡等全身症状,可考可考可考可考虑虑神神神神经经系系系系统统感染的可能性。感染的可能性。感染的可能性。感染的可能性。n n对对照照照照组组不接种病毒不接种病毒不接种病毒不接种病毒,用生理用生理用生理用生理盐盐水代替水代替水代替水代替,其他步其他步其他步其他步骤骤和和和和观观察指察指察指察指标标与与与与试验组试验组完全相同。完全相同。完全相同。完全相同。3333病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验3、最终鉴定、最终鉴定n病毒的最病毒的最病毒的最病毒的最终鉴终鉴定需要定需要定需要定需要免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法、分子生物分子生物分子生物分子生物学方法、学方法、学方法、学方法、电电子子子子显显微微微微镜镜与与与与免疫免疫免疫免疫电电子子子子显显微技微技微技微技术术等等等等特异性方法加以特异性方法加以特异性方法加以特异性方法加以鉴鉴定。定。定。定。n（1 1）病毒的）病毒的）病毒的）病毒的血清学鉴定血清学鉴定血清学鉴定血清学鉴定n（2 2）病毒的分子生物学）病毒的分子生物学）病毒的分子生物学）病毒的分子生物学鉴定鉴定鉴定鉴定n（3 3）电子显微镜技术）电子显微镜技术）电子显微镜技术）电子显微镜技术3434病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验（1）病毒的血清学鉴定n病毒分离后病毒分离后病毒分离后病毒分离后,可用已知的抗病毒血清或可用已知的抗病毒血清或可用已知的抗病毒血清或可用已知的抗病毒血清或单单克隆克隆克隆克隆抗体抗体抗体抗体,对对分离毒株分离毒株分离毒株分离毒株进进行血清学行血清学行血清学行血清学鉴鉴定定定定,以确定病毒以确定病毒以确定病毒以确定病毒的种的种的种的种类类、血清型及其、血清型及其、血清型及其、血清型及其亚亚型。型。型。型。n常用的血清学常用的血清学常用的血清学常用的血清学试验试验有有有有血清中和血清中和血清中和血清中和试验试验、血清抑血清抑血清抑血清抑制制制制试验试验、免疫免疫免疫免疫荧荧光光光光试验试验等。等。等。等。n此外此外此外此外,可采用一些血清学技可采用一些血清学技可采用一些血清学技可采用一些血清学技术术如免疫沉淀技如免疫沉淀技如免疫沉淀技如免疫沉淀技术术和免疫和免疫和免疫和免疫转转印技印技印技印技术术分析病毒的分析病毒的分析病毒的分析病毒的结结构蛋白成分。构蛋白成分。构蛋白成分。构蛋白成分。3535病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验中和试验n基本原理：基本原理：基本原理：基本原理：特异性的抗病毒免疫血清（即中特异性的抗病毒免疫血清（即中特异性的抗病毒免疫血清（即中特异性的抗病毒免疫血清（即中和抗体）和病毒体表面的抗原和抗体）和病毒体表面的抗原和抗体）和病毒体表面的抗原和抗体）和病毒体表面的抗原结结合后合后合后合后,使病毒使病毒使病毒使病毒不能吸附于敏感不能吸附于敏感不能吸附于敏感不能吸附于敏感细细胞胞胞胞,或两者或两者或两者或两者结结合后抑制了病合后抑制了病合后抑制了病合后抑制了病毒的穿入和毒的穿入和毒的穿入和毒的穿入和/或脱壳或脱壳或脱壳或脱壳过过程。因此程。因此程。因此程。因此,病毒就失去了病毒就失去了病毒就失去了病毒就失去了感染的能力。感染的能力。感染的能力。感染的能力。n中和中和中和中和试验试验是以是以是以是以测测定病毒的感染力定病毒的感染力定病毒的感染力定病毒的感染力为为基基基基础础的的的的,试试验验必必必必须须在培养的在培养的在培养的在培养的细细胞内胞内胞内胞内,或或或或动动物、物、物、物、鸡鸡胚等活体胚等活体胚等活体胚等活体内内内内进进行行行行,而且都必而且都必而且都必而且都必须须是是是是对对病毒敏感的。病毒敏感的。病毒敏感的。病毒敏感的。以病毒以病毒以病毒以病毒受免疫血清中和后的残存感染力受免疫血清中和后的残存感染力受免疫血清中和后的残存感染力受免疫血清中和后的残存感染力为为依据依据依据依据,判定判定判定判定中和抗体的滴度。中和中和抗体的滴度。中和中和抗体的滴度。中和中和抗体的滴度。中和试验试验需要需要需要需要设对设对照照照照试验试验。3636病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验结果判定的科学依据：结果判定的科学依据：n用用用用细细胞培养胞培养胞培养胞培养进进行行行行试验时试验时,可依据可依据可依据可依据细细胞病胞病胞病胞病变变情况情况情况情况、蚀蚀斑数量斑数量斑数量斑数量、颜颜色反色反色反色反应应等。等。等。等。n用用用用鸡鸡胚胚胚胚进进行行行行试验时试验时,可依据可依据可依据可依据鸡鸡胚的胚的胚的胚的死亡数死亡数死亡数死亡数、绒绒毛尿囊膜斑点数量和特征毛尿囊膜斑点数量和特征毛尿囊膜斑点数量和特征毛尿囊膜斑点数量和特征、血凝素血凝素血凝素血凝素产产生情况生情况生情况生情况等等等等;n用用用用动动物物物物进进行行行行试验时试验时,可依据可依据可依据可依据动动物死亡数物死亡数物死亡数物死亡数、发发病病病病数数数数、出出出出现现症状数症状数症状数症状数等。等。等。等。3737病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验操作步骤：操作步骤：中和中和中和中和试验试验常用的有两种方法：常用的有两种方法：常用的有两种方法：常用的有两种方法：n一种是一种是一种是一种是固定病毒数量固定病毒数量固定病毒数量固定病毒数量,一般用一般用一般用一般用100TCID100TCID5050的病的病的病的病毒与等量一系列倍比稀毒与等量一系列倍比稀毒与等量一系列倍比稀毒与等量一系列倍比稀释释的血清的血清的血清的血清进进行中和行中和行中和行中和试试验验。然后接种于然后接种于然后接种于然后接种于动动物、物、物、物、鸡鸡胚或胚或胚或胚或细细胞中，用胞中，用胞中，用胞中，用Reed-MuenchReed-Muench法法法法计计算算算算50%50%感染的血清中和感染的血清中和感染的血清中和感染的血清中和终终点。点。点。点。n另一种是另一种是另一种是另一种是固定血清用量固定血清用量固定血清用量固定血清用量与等量一系列与等量一系列与等量一系列与等量一系列对对数稀数稀数稀数稀释释的病毒的病毒的病毒的病毒进进行中和行中和行中和行中和试验试验。3838病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒毒价病毒毒价单位：位：u半数致死量半数致死量(LD(LD5050)作为毒价测定单位，即经规作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。u用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELDELD5050)或鸡胚半数感染量或鸡胚半数感染量(EIDEID5050)。u用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCIDTCID5050)。u在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD(IMD5050)或半数保护量或半数保护量(PD(PD5050)。3939病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒毒价的病毒毒价的测定（微量法）定（微量法）(1)(1)病毒的制病毒的制病毒的制病毒的制备备将病毒接种于将病毒接种于将病毒接种于将病毒接种于单层细单层细胞，胞，胞，胞，3737吸附吸附吸附吸附1h1h后加入后加入后加入后加入维维持液，置温箱培养；逐日持液，置温箱培养；逐日持液，置温箱培养；逐日持液，置温箱培养；逐日观观察，待察，待察，待察，待细细胞病胞病胞病胞病变变（CPECPE）达）达）达）达75%75%以上，收以上，收以上，收以上，收获获病毒病毒病毒病毒悬悬液液液液冻冻融融融融或超声波或超声波或超声波或超声波处处理，以理，以理，以理，以3 000r/min3 000r/min离心离心离心离心10min10min，取上清液，定量分装成取上清液，定量分装成取上清液，定量分装成取上清液，定量分装成1ml1ml小瓶置小瓶置小瓶置小瓶置-70-70保存保存保存保存备备用，用，用，用，选选用的病毒必用的病毒必用的病毒必用的病毒必须须是是是是对细对细胞有胞有胞有胞有较稳较稳定的定的定的定的致病力。致病力。致病力。致病力。4040病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验(2)(2)病毒毒价病毒毒价病毒毒价病毒毒价测测定定定定取置取置取置取置-70-70冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在9696孔培养板上作孔培养板上作孔培养板上作孔培养板上作1010倍倍倍倍递进递进稀稀稀稀释释即即即即1010-1-1，1010-2 2，1010-3-3 ，每孔病毒，每孔病毒，每孔病毒，每孔病毒悬悬液量液量液量液量为为50l50l，每个稀，每个稀，每个稀，每个稀释释度作度作度作度作8 8孔，每孔加入孔，每孔加入孔，每孔加入孔，每孔加入100l100l细细胞胞胞胞悬悬液，每液，每液，每液，每块块板板板板的最后一行的最后一行的最后一行的最后一行设设8 8孔孔孔孔细细胞胞胞胞对对照，制照，制照，制照，制备细备细胞胞胞胞悬悬液的液的液的液的浓浓度以使度以使度以使度以使细细胞在胞在胞在胞在24h24h内内内内长满单层为长满单层为度。把培养度。把培养度。把培养度。把培养板置板置板置板置5%CO5%CO2 2温箱温箱温箱温箱3737培养，从培养，从培养，从培养，从48h-14d48h-14d逐日逐日逐日逐日观观察察察察细细胞病胞病胞病胞病变变，记录结记录结果。果。果。果。4141病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验中和试验可应用于：中和试验可应用于：n1.1.病毒株的种型病毒株的种型病毒株的种型病毒株的种型鉴鉴定：中和定：中和定：中和定：中和试验试验具有具有具有具有较较高的特高的特高的特高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型型型型标标准血清，即可准血清，即可准血清，即可准血清，即可测测知相知相知相知相应应血清或病毒的型，血清或病毒的型，血清或病毒的型，血清或病毒的型，所以中和所以中和所以中和所以中和试验试验不但可以定属而且可以定型。不但可以定属而且可以定型。不但可以定属而且可以定型。不但可以定属而且可以定型。n2.2.测测定血清抗体效价：中和抗体出定血清抗体效价：中和抗体出定血清抗体效价：中和抗体出定血清抗体效价：中和抗体出现现于病毒感于病毒感于病毒感于病毒感染的染的染的染的较较早期，在体内的早期，在体内的早期，在体内的早期，在体内的维维持持持持时间较长时间较长。动动物物物物体内中和抗体水平的高低，可体内中和抗体水平的高低，可体内中和抗体水平的高低，可体内中和抗体水平的高低，可显显示示示示动动物抵抗物抵抗物抵抗物抵抗病毒的能力。病毒的能力。病毒的能力。病毒的能力。n3.3.分析病毒的抗原性。分析病毒的抗原性。分析病毒的抗原性。分析病毒的抗原性。4242病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验血凝抑制试验n基本原理基本原理基本原理基本原理:某些病毒具有血凝素某些病毒具有血凝素某些病毒具有血凝素某些病毒具有血凝素,能能能能选择选择性地作性地作性地作性地作用于个用于个用于个用于个别别种种种种类类的哺乳的哺乳的哺乳的哺乳动动物的物的物的物的红细红细胞表面的受胞表面的受胞表面的受胞表面的受体体体体,病毒附着于病毒附着于病毒附着于病毒附着于细细胞而胞而胞而胞而发发生凝集反生凝集反生凝集反生凝集反应应,称称称称为为红细红细胞凝集胞凝集胞凝集胞凝集现现象象象象(简简称血凝称血凝称血凝称血凝)。n如果将病毒如果将病毒如果将病毒如果将病毒特异性抗体特异性抗体特异性抗体特异性抗体加入病毒或血凝素加入病毒或血凝素加入病毒或血凝素加入病毒或血凝素悬悬液中液中液中液中,作用一定作用一定作用一定作用一定时间时间后后后后,由于抗原由于抗原由于抗原由于抗原(血凝素血凝素血凝素血凝素)与抗与抗与抗与抗体体体体发发生特异性生特异性生特异性生特异性结结合合合合,这这种种种种结结合妨碍了病毒血凝合妨碍了病毒血凝合妨碍了病毒血凝合妨碍了病毒血凝素素素素对红细对红细胞的附着胞的附着胞的附着胞的附着,因而血凝因而血凝因而血凝因而血凝现现象被抑制象被抑制象被抑制象被抑制,这这种种种种试验试验称称称称为为血凝抑制血凝抑制血凝抑制血凝抑制试验试验。4343病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验用简式表示:病毒病毒+红细胞红细胞 凝集凝集病毒病毒+抗体抗体+红细胞红细胞 凝集被抑制凝集被抑制4444病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验病毒学病毒的检验免疫荧光试验基本原理：基本原理：n有些有些有些有些荧荧光素能和抗体分子光素能和抗体分子光素能和抗体分子光素能和抗体分子结结合合合合,并且保持抗体并且保持抗体并且保持抗体并且保持抗体活力活力活力活力,和相和相和相和相应应的抗原特异性的抗原特异性的抗原特异性的抗原特异性结结合合合合,并形成