免疫细胞的分离与检测解析课件

第一节第一节 免疫细胞的分类与分离免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征二、免疫细胞的分离技术三、细胞的冻存与复苏第一节免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征1一、免疫细胞的特征一、免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征理化性状生物学特性2、免疫细胞的膜分子特征CD分子一、免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征2免疫细胞的分离与检测解析课件3NK cells吞噬溶酶体NKcells吞噬溶酶体4免疫细胞的分离与检测解析课件5二、免疫细胞的分离技术二、免疫细胞的分离技术1 1、密度梯度离心法、密度梯度离心法2 2、黏附分离法、黏附分离法3 3、荧光激活分离法、荧光激活分离法4 4、磁性分离法、磁性分离法5 5、其他分离法、其他分离法二、免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法61、密度梯度离心法、密度梯度离心法聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液pFicollFicoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为为400,000400,000，当密度为，当密度为1.2g/ml1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。也不穿过生物膜。p红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。1、密度梯度离心法聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urog7离心前离心前离心后离心后稀释抗凝血稀释抗凝血淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液血浆血浆单个核细胞单个核细胞粒细胞粒细胞红细胞红细胞离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核细胞粒细胞红细82 2、黏附分离法、黏附分离法-纯淋巴细胞群的分离纯淋巴细胞群的分离贴壁法：将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至皿或扁平小瓶中，移至3737温箱静置温箱静置1h1h左右，单核细胞和左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因因B B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B B细胞有所细胞有所损失。损失。2、黏附分离法-纯淋巴细胞群的分离贴壁法：将已制备的单个核细92、黏附分离法：淋巴细胞亚群的分离vv尼龙毛法：尼龙毛法：混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B B细胞、浆细胞、细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T T细胞则细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含通过尼龙毛柱，这是获得富含T T细胞群的有效方法。细胞群的有效方法。T细胞得率为20-30%左右。vv亲和板法：亲和板法：利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。吸附的细胞悬液中获取。vv吸附柱法：吸附柱法：将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。对细胞极少损害。2、黏附分离法：淋巴细胞亚群的分离尼龙毛法：混合单个核细胞悬103、荧光激活分离法（FACS）3、荧光激活分离法（FACS）11流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪124、磁性分离法（1）磁铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，在利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为单个核细胞悬液中加直径为3m3m的羰基铁颗粒，置的羰基铁颗粒，置3737温箱温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。（2）磁激活细胞分离术MACs：是一种特异性细是一种特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。主要组成成分为主要组成成分为MACSMACS微珠、微珠、MACSMACS分选柱和分选柱和MACSMACS分选器分选器。MACSMACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。粒。MACSMACS分选柱置于一个永久性磁场分选柱置于一个永久性磁场MACSMACS分选器中，分选器中，可以将磁力增强可以将磁力增强10001000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。4、磁性分离法（1）磁铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，13MACS(阳性选择法）阳性选择法）NSMACS(阳性选择法）NS14MACS(阴性选择法）阴性选择法）NSMACS(阴性选择法）NS15免疫细胞的分离与检测解析课件16免疫细胞的分离与检测解析课件175、其他分离法、其他分离法花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。可溶性MHC-肽四聚体法：mhc-肽四聚体复合物的原理是通过增强t细胞受体与mhc-肽复合物亲和力，达到可直接特异性检测t细胞的目的。p作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异性CTLs的比率，并进行表型及功能分析。p用于过继性肿瘤免疫治疗p用于疫苗疗效的监测5、其他分离法花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红18抗原肽抗原肽-MHC分子四聚体技术分子四聚体技术T抗原肽-MHC分子四聚体技术T19MHCIMHCI类类(左左)和和类类(右右)分子四聚体结构示意图分子四聚体结构示意图 MHCI类(左)和类(右)分子四聚体结构示意图20三、细胞的冻存与复苏三、细胞的冻存与复苏1、细胞冻存的原理与方法：、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件下直在不加任何条件下直在不加任何条件下直在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在胞。贮存在胞。贮存在胞。贮存在-130-130-130-130以下的低温中能减少冰晶的形成。以下的低温中能减少冰晶的形成。以下的低温中能减少冰晶的形成。以下的低温中能减少冰晶的形成。2、细胞复苏的原理与方法：、细胞复苏的原理与方法：细胞复苏时速度要快，细胞复苏时速度要快，细胞复苏时速度要快，细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的使之迅速通过细胞最易受损的使之迅速通过细胞最易受损的使之迅速通过细胞最易受损的5 5 5 50000，细胞仍能生长，细胞仍能生长，细胞仍能生长，细胞仍能生长，活力受损不大。活力受损不大。活力受损不大。活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（目前常用的保护剂为二甲亚砜（目前常用的保护剂为二甲亚砜（目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSODMSO）和甘油，它们）和甘油，它们）和甘油，它们）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。三、细胞的冻存与复苏1、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件21细胞冻存罐细胞冻存罐细胞冻存罐22 第二节 免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型二、免疫细胞膜分子的检测方法第二节免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子检测的原理23一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原、以抗体识别抗原2、以配体识别受体、以配体识别受体一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原24二、免疫细胞膜分子的主要检测方法1 1、免疫标记检测方法、免疫标记检测方法 荧光抗体法荧光抗体法 酶免疫检测法酶免疫检测法 免疫金银染色法免疫金银染色法2 2、补体依赖的细胞毒试验（、补体依赖的细胞毒试验（CDCCDC）3 3、花环形成试验、花环形成试验二、免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫标记检测方法25SmIg的荧光抗体检测法的荧光抗体检测法SmIg的荧光抗体检测法26SmIg的酶免疫检测法的酶免疫检测法SmIg的酶免疫检测法27补体依赖的细胞毒试验补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体28E-花环：利用利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体细胞膜上的异种动物红细胞受体T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞E-花环：利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体T细胞B细胞花环29免疫细胞的分离与检测解析课件30EA-花环：B B淋巴细胞表面有淋巴细胞表面有淋巴细胞表面有淋巴细胞表面有FcFc受体受体受体受体，能与免疫球蛋白的，能与免疫球蛋白的，能与免疫球蛋白的，能与免疫球蛋白的FcFc段结合，因此用抗体致敏的红细胞与段结合，因此用抗体致敏的红细胞与段结合，因此用抗体致敏的红细胞与段结合，因此用抗体致敏的红细胞与B B淋巴细胞混合，可见淋巴细胞混合，可见淋巴细胞混合，可见淋巴细胞混合，可见B B淋巴细胞周围粘附有红细胞淋巴细胞周围粘附有红细胞淋巴细胞周围粘附有红细胞淋巴细胞周围粘附有红细胞EA-花环：B淋巴细胞表面有Fc受体，能与免疫球蛋白的Fc段31EAC-花环：B B淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的红细胞中加入补体，可形成红细胞红细胞中加入补体，可形成红细胞红细胞中加入补体，可形成红细胞红细胞中加入补体，可形成红细胞-抗体抗体抗体抗体-补体复合物，再与补体复合物，再与补体复合物，再与补体复合物，再与B B淋巴细胞混合，则可形成淋巴细胞混合，则可形成淋巴细胞混合，则可形成淋巴细胞混合，则可形成EACEAC玫瑰花环。玫瑰花环。玫瑰花环。玫瑰花环。EAC-花环：B淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的红细胞中32 第三节第三节 免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定一、转化、增殖试验二、细胞毒试验三、抗体形成试验四、细胞吞噬与杀伤试验第三节免疫细胞功能测定一、转化、增殖试验331、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植物血凝素、刀豆素A等）和特异性刺激因子（如抗原）；检测方法为形态学检测法和3H-TdR掺入法及MTT法等。2、混合淋巴细胞培养：混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。一、转化、增殖试验一、转化、增殖试验1、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植物血凝素、刀豆34免疫细胞的分离与检测解析课件35放射性测定放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋淋巴巴细细胞胞转转化化试试验验原原理理示示意意小淋巴细胞在转化为原始母细胞过程中，合成小淋巴细胞在转化为原始母细胞过程中，合成DNADNA增加，能够增加，能够吸收胸腺嘧啶核苷（吸收胸腺嘧啶核苷（3H3H）放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋巴细胞转化试验原理361、T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验2、ADCC作用测定作用测定3、NK活性测定活性测定二、细胞毒检测试验 第三节第三节 免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定1、T细胞介导的细胞毒试验二、细胞毒检测试验第三节免疫37放射性测定细胞毒试验原理示意靶细胞效应细胞分离上清放射性测定细胞毒试验原理示意靶细胞效应细胞分离上清382、K细胞活性胞活性测定（定（ADCC活性活性测定）定）v动物机体有些免疫细胞，通过抗体依赖细胞介导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（的细胞毒作用（ADCCADCC）杀伤靶细胞，如NK细胞、活化的T细胞、吞噬细胞等，这类细胞统称为K细胞。vK细胞的活性不仅反映机体细胞免疫的能力，而且与体液免疫也有直接的关系。vK细胞活性检测的方法有同位素释放试验法，溶血空斑法，细胞剥离法和靶细胞接合试验。仅介绍同位素释放法。2、K细胞活性测定（ADCC活性测定）动物机体有些免疫细胞，39（1）原理）原理v将靶细胞用51Cr标记后，再与特异性的IgG抗体结合，加入K细胞后即可发生ADCC效应，引起靶细胞的溶解并释放51Cr。用计数仪分别检测上清和细胞沉淀中的cpm，根据上清中释放的51Cr的多少，可判断K细胞活性的高低。（1）原理将靶细胞用51Cr标记后，再与特异性的IgG抗体结40（2）方法）方法v1、试验管：效应细胞(淋巴细胞悬液)，标记的靶细胞(Cr51标记的鸡红细胞)和亚凝集单位的抗体(兔抗鸡红细胞抗体)各0.1ml，加RPMI1640完全培养基1.7ml（ADCC）。v2、效应细胞对照管：效应细胞和标记的靶细胞各0.1ml加上述完全培养基1.8ml（未加抗体）。v3、抗体对照管：标记的靶细胞和亚凝集单位的抗体各0.1ml，加完全培养基1.8ml（未加效应细胞）。v4、最大释放对照管：标记的靶细胞0.1ml加蒸馏水1.9ml（靶细胞会裂解，完全释放同位素）。v5、自然释放管：标记的靶细胞0.1ml，加完全培养基1.9ml（靶细胞不裂解，但可自然释放一定量的同位素）。v以上各管均置37520h后，2500g离心10min，分别取各管上清夜1.0ml置于5支试管中，用计数仪测各管上清和沉淀中的cpm值。（2）方法1、试验管：效应细胞(淋巴细胞悬液)，标记的靶细41（3）结果判断和果判断和计算算v51Cr实验释放率（%）2(上清cpm本底cpm)100%(上清cpm-本底cpm)(沉淀cpm-本底cpm)v51Cr特异释放率（%）试验释放率自然释放率100%最大释放率自然释放率（3）结果判断和计算51Cr实验释放率（%）423、NK细胞活性胞活性测定定vNK细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样细胞，其杀伤作用不需要抗体、补体的参加，所杀伤靶细胞通常指肿瘤细胞和病毒感染或转化的细胞。这样，可以将来源于同种动物的肿瘤细胞系或病毒转化的细胞系，作为检测NK细胞活性的指示细胞。vNK细胞活性测定多采用51Cr释放法试验，其原理同细胞毒性T细胞试验中所采用的51Cr释放法试验。在这里以检测小鼠脾脏NK细胞活性为例，说明本试验方法。用3H-TdR掺入法，靶细胞为YAC-1细胞株（小鼠淋巴瘤细胞系）。3、NK细胞活性测定NK细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样43v（1）试剂v小鼠脾细胞悬液:分离单个脾脏细胞-裂解红细胞-淋巴细胞洗涤配置悬液（1640完全培养基2106/ml）。v标记的靶细胞：活淋巴细胞（96%以上）加入H3-Tdr-孵育2小时/每30min振摇-洗3次-配成2106/ml悬液。（1）试剂44v（2）方法v试验组孔：脾细胞悬液(淋巴细胞)：标记的靶细胞悬液100:1左右；v对照组：单纯加标记的靶细胞。v375%CO2培养18小时（NK细胞杀伤靶细胞）；v每孔加终浓度为0.15%的胰酶和0.0125%DNA酶37处理30min（消化细胞和处理掉死亡靶细胞释放出来的放射性DNA）。v各孔细胞收集后依次通过生理盐水，5%三氯乙酸和无水乙醇（获得了存活的靶细胞的标记DNA）。v待滤膜干燥后用液闪计数仪测定cpm值。v三、结果计算vNK细胞活性以特异性杀伤率表示：特异性杀伤率（%）（1试验组cpm/对照组cpm）100%（2）方法451、直接溶血空斑试验2、间接溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验三、抗体形成试验三、抗体形成试验1、直接溶血空斑试验三、抗体形成试验461 1、直接溶血空斑试验、直接溶血空斑试验1、直接溶血空斑试验472 2、间接溶血空斑试验、间接溶血空斑试验2、间接溶血空斑试验483 3、SPA-SRBCSPA-SRBC溶血空斑试验溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验491、细胞吞噬功能试验2、细胞杀菌功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验1、细胞吞噬功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验50免疫细胞的分离与检测解析课件51吞噬百分率 =吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数 =吞噬细胞吞噬的总颗粒数计数的吞噬细胞数吞噬百分率=吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数52NBT还原试验还原试验原理：N-N-C +H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黄色）甲月簪基（紫黑色）NBT还原试验原理：N-N-N-NH2四氮唑基（淡黄色）甲月53NBT还原试验还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、镜检。正常值：NBT阳性细胞7.5-15%NBT还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），54 第四节第四节 免疫细胞凋亡测定免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与原理二、细胞凋亡的检测方法第四节免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与原理55 一、细胞凋亡的概念与原理一、细胞凋亡的概念与原理1、细胞凋亡的概念2、细胞凋亡的原理3、细胞凋亡的特点一、细胞凋亡的概念与原理1、细胞凋亡的概念56 1 1、细胞凋亡、细胞凋亡（apoptosisapoptosis）细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。1、细胞凋亡（apoptosis）细胞在内源性基因调57v虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。v坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。v凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大58凋亡凋亡坏死坏死机制机制基因调控的程序化细胞死亡，基因调控的程序化细胞死亡，主动进行（自杀性）主动进行（自杀性）意外事故性细胞死亡，被动进行意外事故性细胞死亡，被动进行（他杀性）（他杀性）诱因诱因生理性或轻微病理性刺激因子生理性或轻微病理性刺激因子诱导发生，如生长因子缺乏诱导发生，如生长因子缺乏病理性刺激因子诱导发生，如缺氧、病理性刺激因子诱导发生，如缺氧、感染、中毒感染、中毒死亡范围死亡范围多为散在的单个细胞多为散在的单个细胞多为聚集的大片细胞多为聚集的大片细胞形态特征形态特征细胞固缩，核染色质边集，细细胞固缩，核染色质边集，细胞膜及各细胞器膜完整，膜可胞膜及各细胞器膜完整，膜可发泡成芽，形成凋亡小体发泡成芽，形成凋亡小体细胞肿胀，核染色质絮状或边集，细胞肿胀，核染色质絮状或边集，细胞膜及各细胞器膜溶解破坏，溶细胞膜及各细胞器膜溶解破坏，溶酶体酶释放，细胞自溶酶体酶释放，细胞自溶生化特征生化特征耗能的主动过程，有新蛋白合耗能的主动过程，有新蛋白合成，成，DNADNA早期规律降解为早期规律降解为180-180-200bp200bp片段，琼脂凝胶电泳呈片段，琼脂凝胶电泳呈特征性梯带状特征性梯带状不耗能的被动过程，无新蛋白合成，不耗能的被动过程，无新蛋白合成，DNADNA降解不规律，片段大小不一，琼降解不规律，片段大小不一，琼脂凝胶电泳不呈梯带状脂凝胶电泳不呈梯带状周围反应周围反应不引起周围组织炎症反应和修不引起周围组织炎症反应和修复再生，但凋亡小体可被邻近复再生，但凋亡小体可被邻近细胞吞噬细胞吞噬引起周围组织炎症反应和修复再生引起周围组织炎症反应和修复再生凋亡坏死机制基因调控的程序化细胞死亡，主动进行（自杀性）意59 2、细胞凋亡的原理、细胞凋亡的原理凋亡信号凋亡受体信号传导凋亡基因启动编码程序性死亡蛋白细胞结构解体细胞凋亡2、细胞凋亡的原理凋亡信号凋亡受体信号传导凋亡60 细胞凋亡机制细胞凋亡机制（动（动画）画）细胞凋亡机制（动画）61 3、细胞凋亡的特点、细胞凋亡的特点（1）细胞皱缩（2）染色质边集（3）凋亡小体出现3、细胞凋亡的特点（1）细胞皱缩62 细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡63 二、细胞凋亡的检测方法二、细胞凋亡的检测方法1、形态观察法：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。2、生化检测法：胞浆内胞浆内Ca2+Ca2+浓度升高。浓度升高。细胞内活性氧增多。细胞内活性氧增多。质膜通透性增高。质膜通透性增高。DNADNA内切酶被激活，双链内切酶被激活，双链DNADNA在核小体之间切断形成在核小体之间切断形成180200bp180200bp的特征性的有序片段。的特征性的有序片段。型谷氨酰胺转移酶和钙蛋白酶（型谷氨酰胺转移酶和钙蛋白酶（CalpainCalpain）活性升高。）活性升高。3、流式细胞仪检测法二、细胞凋亡的检测方法1、形态观察法：凋亡的细胞皱缩，质膜641、形态观察法、形态观察法（1 1）普通光镜检测）普通光镜检测HEHE染色染色甲基绿甲基绿-派诺宁染色：派诺宁染色：细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNAmRNA表达的增强。表达的增强。而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNARNA的的损失。根据这一特点，可应用试剂甲基绿对损失。根据这一特点，可应用试剂甲基绿对DNADNA染色的特异性染色的特异性和派诺宁对和派诺宁对RNARNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。二、细胞凋亡的检测方法1、形态观察法（1）普通光镜检测二、细胞凋亡的检测方法65vv甲基绿甲基绿-派诺宁染色：派诺宁染色：光学显微镜下凋亡细胞和坏死细胞均表现为细光学显微镜下凋亡细胞和坏死细胞均表现为细胞固缩：其中凋亡细胞细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色胞固缩：其中凋亡细胞细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞，核绿色着染，而细胞质无染色。着染，坏死细胞只有固缩细胞，核绿色着染，而细胞质无染色。甲基绿-派诺宁染色：光学显微镜下凋亡细胞和坏死细胞均表现为细66（2 2）荧光显微镜检测）荧光显微镜检测溴化丙锭（溴化丙锭（PIPI）染色：）染色：碘化丙啶碘化丙啶(propidineiodide,PI)(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PIPI能能够透过细胞膜而使细胞核红染。够透过细胞膜而使细胞核红染。（2）荧光显微镜检测溴化丙锭（PI）染色：67vv（3 3）透射电子显）透射电子显微镜：微镜：已经用于凋已经用于凋亡细胞的检测。镜亡细胞的检测。镜下可见凋亡细胞体下可见凋亡细胞体积变小、细胞质浓积变小、细胞质浓缩、细胞核变小、缩、细胞核变小、染色质浓缩并凝结染色质浓缩并凝结成块，出现染色质成块，出现染色质沿核膜内侧排列的沿核膜内侧排列的核边集现象。晚期核边集现象。晚期的凋亡细胞，清晰的凋亡细胞，清晰可见细胞核裂解产可见细胞核裂解产生的凋亡小体。生的凋亡小体。（3）透射电子显微镜：已经用于凋亡细胞的检测。镜下可见凋亡细682、生化检测法、生化检测法（1）凝胶电泳法：（2）原位末端标记法（3）二苯胺分光光度法 二、细胞凋亡的检测方法二、细胞凋亡的检测方法2、生化检测法（1）凝胶电泳法：二、细胞凋亡的检测方法69（1）凝胶电泳法）凝胶电泳法原理：凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核活而导致细胞核DNADNA的断裂。典型的细胞凋亡，在核内形的断裂。典型的细胞凋亡，在核内形成大量成大量200bp200bp大小及其倍体的核苷酸片段，而非典型的凋亡大小及其倍体的核苷酸片段，而非典型的凋亡细胞，由于核内的细胞，由于核内的DNADNA降解不完全，仅形成降解不完全，仅形成30050kb30050kb的的DNADNA大片。利用这一特性，可通过大片。利用这一特性，可通过DNADNA凝胶电泳来判定凋凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况。亡的发生和发展情况。方法：提取总DNADNA凝胶电泳观察DNAladder现象（1）凝胶电泳法原理：凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切70v凝胶电泳特点(1)(1)本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。(2)(2)不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。凝胶电泳特点(1)本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。(71（2）原位末端标记法（）原位末端标记法（TUNEL）原理：利用标记的dUTP，在TdT作用下结合DNA断片的3末端羟基，显示断链DNA，提示凋亡方法：制备组织切片标记物结合标记物显色镜检（2）原位末端标记法（TUNEL）原理：利用标记的dUTP，72vTUNEL染色：细胞核固缩有的呈碎片状，不规则，大小不一致，呈细胞核固缩有的呈碎片状，不规则，大小不一致，呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。棕黄色颗粒者为阳性细胞。即凋亡的细胞即凋亡的细胞 TUNEL染色：细胞核固缩有的呈碎片状，不规则，大小不一致，73（3）二苯胺分光光度法）二苯胺分光光度法原理：原理：细胞凋亡可产生低分子量细胞凋亡可产生低分子量DNADNA，通过超速，通过超速离心可与细胞核的高分子量离心可与细胞核的高分子量DNADNA分离，分别测定分离，分别测定两种两种DNADNA，即可得出凋亡百分率。，即可得出凋亡百分率。方法：方法：裂解细胞裂解细胞13000g13000g超速离心超速离心分别提取分别提取DNADNA使使DNADNA显色，测定显色，测定（3）二苯胺分光光度法原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通74凋亡百分率 =上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值凋亡百分率=上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值753 3、流式细胞仪法、流式细胞仪法原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可显示凋亡细胞的特征性亚二倍体峰。并可经计算分析得出凋亡百分率。方法：制备细胞悬液PI染色FACS检测 二、细胞凋亡的检测方二、细胞凋亡的检测方法法3、流式细胞仪法原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可显示凋76免疫细胞的分离与检测解析课件77本章小结本章小结1、免疫细胞的类型与分离技术2、细胞的冻存与复苏3、免疫细胞膜分子的检测原理与方法4、免疫细胞功能测定的原理与方法本章小结1、免疫细胞的类型与分离技术78