生物合成青蒿酸课件

1 简介介1.1.疟疾疟疾是一种由疟原虫造成的，通过疟蚊传播的全球性急性寄生虫传染病是一种由疟原虫造成的，通过疟蚊传播的全球性急性寄生虫传染病2.2.疟原虫疟原虫恶性疟原虫具有复杂的生命周期，因而很难根除这种疾病，治疗是唯一恶性疟原虫具有复杂的生命周期，因而很难根除这种疾病，治疗是唯一的选择。而抗药疟原虫突变系的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。的选择。而抗药疟原虫突变系的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。据据WTOWTO统计，统计，20102010年有年有2 2亿疟疾病例，并导致亿疟疾病例，并导致655000655000人死亡。人死亡。3.3.青蒿素青蒿素一种由我国学者在一种由我国学者在2020世纪世纪7070年代初从年代初从Artemisia annua LArtemisia annua L（菊科植物，（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15C-15倍半萜），通倍半萜），通过释放高剂量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。是目前世界过释放高剂量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。是目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称为为“治疗疟疾的最大希望治疗疟疾的最大希望”。1 简介1.疟疾2简介介4.4.青蒿素工艺路径青蒿素工艺路径人工全化学合成人工全化学合成青蒿素由于其工艺复杂、毒副作用大、成本高而青蒿素由于其工艺复杂、毒副作用大、成本高而不能投入生产。不能投入生产。世界上青蒿素药物的生产主要依靠我国从世界上青蒿素药物的生产主要依靠我国从野生和栽培野生和栽培青蒿中青蒿中直接直接提取提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低。但是青蒿中青蒿素的含量很低(0.1%-1%w/w),(0.1%-1%w/w),且受地且受地域性种植影响较大。域性种植影响较大。用用酵母酵母生产青蒿酸，再由青蒿酸合成青蒿素生产青蒿酸，再由青蒿酸合成青蒿素本文使用了本文使用了半化学合成法半化学合成法来生产青蒿素。来生产青蒿素。2 简介4.青蒿素工艺路径研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内合成的：焦磷酸法呢焦磷酸法呢酯（酯（FPP）Amorphadiene（合成合成青蒿酸及青蒿素的最青蒿酸及青蒿素的最直接的前体原料直接的前体原料）青蒿酸青蒿酸青蒿素青蒿素青蒿素天然合成路径青蒿素天然合成路径由于酵母也可以合成由于酵母也可以合成FPPFPP，所以我们所需要做的只是将，所以我们所需要做的只是将FPPFPP到到AmorphadieneAmorphadiene再到再到青蒿酸青蒿酸这两个过程克隆进入酵母细胞内，并这两个过程克隆进入酵母细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控，使之能正常并且大对细胞内的其他与之相关的基因进行调控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。量合成青蒿酸。研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内合成的：焦磷4酵母内代酵母内代谢途径途径ERG9：编码鲨烯合成酶，将 2分子FPP合成鲨烯，最终获得固醇CYP71AV1：控制一种细胞色素P450合成的酶CPR1：与CYP71AV1对应的还原酶的表达基因4酵母内代谢途径ERG9：编码鲨烯合成酶，将 2分子FPP合5主要工作主要工作 开发了一种利用纯态氧（开发了一种利用纯态氧（singlet oxygensinglet oxygen）将青蒿）将青蒿酸转化为青蒿素的有效、可行的化学合成途径酸转化为青蒿素的有效、可行的化学合成途径2 2本文证实了本文证实了青蒿酸在酵母体内全生物合成途径青蒿酸在酵母体内全生物合成途径，并，并发现了一种发现了一种植物脱氢酶植物脱氢酶和另一种和另一种细胞色素（细胞色素（CYB5CYB5）1 15 主要工作 开发了一种利用纯态氧（singlet o6酵母内代酵母内代谢途径途径ERG9：编码鲨烯合成酶，将 2分子FPP合成鲨烯，最终获得固醇CYP71AV1：控制一种细胞色素P450合成的酶CPR1：与CYP71AV1对应的还原酶的表达基因6酵母内代谢途径ERG9：编码鲨烯合成酶，将 2分子FPP合7Amorphadiene合成青蒿酸途径合成青蒿酸途径1.已有文献指出细胞色素b5与细胞色素P450酶作用会增强细胞色素P450酶的反应速率。本文鉴定出一种细胞色素b5的cDNA,从而获得编码细胞色素b5的基因CYB5。2.近期分离出了青蒿醛脱氢酶的cDNA,并将其对应的基因ALDH1在酵母体内表达3.检测到一种脱氢酶，对其纯化分析，并通过ESTs、序列分析等获得基因ADH1综上，我们认为有综上，我们认为有5 5种酶（种酶（CYP71AV1CYP71AV1、CPR1CPR1、CYB1CYB1、ADH1ADH1和和ALDH1ALDH1）参与了）参与了amorphadieneamorphadiene氧化为青蒿酸的过程，并将其重新在酵母中氧化为青蒿酸的过程，并将其重新在酵母中构建形成生物合成构建形成生物合成amorphadieneamorphadiene的完整路径。的完整路径。7Amorphadiene合成青蒿酸途径1.已有文献指出细8生物合成生物合成青蒿酸青蒿酸菌株改造：Y337（原始菌株，PMET3-ERG9）Y1516（PCTR3-ERG9）将控制ERG9基因表达的启动子PMET3替换为 PCTR3Y285（PMET3-ERG9）导入表达CYP71AV1和CPR1 基因的高拷贝质粒Y301（PCTR3-ERG9）导入表达CYP71AV1和CPR1 基因的高拷贝质粒将控制ERG9基因表达的启动子PMET3替换为 PCTR38生物合成青蒿酸菌株改造：Y337（原始菌株，PMET3-9 结果果Y337产amorphadiene12g/LY285产青蒿酸3.3g/L+amorphadiene 0.3g/L+青蒿酸乙酯0.18g/L（不产青蒿醛）Y285产量少，且生长能力显著变差，猜测是由细胞色素P450氧化amorphadiene，或青蒿酸的积累引起的9 结果Y337产amorphadiene12g/L10生物合成生物合成青蒿酸青蒿酸菌株改造：Y657（PCTR3-ERG9）插入弱启动子GAL3控制CPR1的表达，并将其整合到基因组DNA上Y692（PCTR3-ERG9）将受强启动子GAL7控制的CYB5基因整合到染色体导入ALDH1基因Y1368（PCTR3-ERG9）Y1283（PCTR3-ERG9）Y1284（PCTR3-ERG9）敲除GAL80基因Y301（PCTR3-ERG9）导入ALDH1基因Y973（PCTR3-ERG9）导入ADH1基因10生物合成青蒿酸菌株改造：Y657插入弱启动子GAL3控制11 结果果Y657较Y285（或Y301，是将Y285启动子PMET3替换为PCTR3）细胞生长能力增强，但青蒿酸产量降低尽管降低CPR1的表达水平降低了青蒿酸的产量，总的倍半萜烯类物质产量仍很高，说明低CPR1表达量增加细胞的生存能力，但减少了amorphadiene氧化物的生成速率11 结果Y657较Y285（或Y301，是将Y285启12 结果果对比Y657和Y692，发现Y692的青蒿素、青蒿醛的产量均较高，总倍半萜烯类产物的产量增加了40%，说明CYB5基因的表达会提高青蒿素产率对比Y692和Y1368,说明ALDH1基因的表达显著地增加了青蒿酸的产量，并且检测不到产物青蒿醛，且菌株的生存能力显著增加，产量是菌株Y285的两倍多。对比Y1368和Y1283，青蒿酸产量增加了18%，说明ADH1基因的表达能增加目的产物产量12 结果对比Y657和Y692，发现Y692的青蒿素、13添加添加IMP 表达ALDH1基因的菌株以胞外晶体沉淀的形式生产青蒿酸，沉淀在初期发酵时便能观察到，这对使得多相发酵样品中产品的精确测量变得复杂。为了克服由青蒿酸结晶沉淀带来的困难，我们利用萃取发酵溶解沉淀的现象，在十四酸异丙酯（IMP)环境中培养菌体。13 添加IMP 表达ALDH1基因的菌株以胞外晶体14 结果果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力显著加强14 结果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力显著15 结果果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力显著加强。同时，对Y285、Y301、Y657和Y692菌株（缺乏ALDH1和ADH1基因）而言，添加IPM会导致中间产物的析出。而对有ALDH1和ADH1基因的菌株，添加IPM会提高青蒿酸的产量15 结果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力显著16 化学途径化学途径1.the reduction of the D11(13)double bond.2.the esterification of the carboxylic acid.3.an ene-type reaction of the C4C5 double bond with singlet oxygen.4.the allylic hydroperoxide undergoes an acid-catalysed Hock fragmentation and rearrangement to afford a ringopened keto-aldehyde enol16 化学途径1.the reduction of th生物合成青蒿酸课件