生化药物制造工艺糖类药物培训课件

生化药物制造工艺糖生化药物制造工艺糖类药物类药物（一）糖类药物的分类（一）糖类药物的分类糖类药物种种类类繁繁多多，其分类方法也有多种，按照含有糖基数目糖基数目不同可分为以下几类。（1）单单糖糖类类：如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。（2）低聚糖类）低聚糖类：如蔗糖、麦芽乳糖、乳果糖等。（3）多多糖糖类类：多糖又有多种，根据其来来源源不不同同又可分为：来来源源于于植植物物的的多多糖糖，如黄芪多糖、人参多糖、刺五加多糖；2生化药物制造工艺糖类药物来来源源于于动动物物的的多多糖糖，如肝素、透明质酸、硫酸软骨素等；来来源源于于微微生生物物的的多多糖糖，如香菇多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝糖肽等。（4）糖糖的的衍衍生生物物：如1，6二磷酸果糖、6磷酸葡萄糖、磷酸肌醇等。3生化药物制造工艺糖类药物（二）多糖的药理活性（二）多糖的药理活性多糖具有十分广泛的药理生理作用药理生理作用：1、抗肿瘤和免疫促进活性、抗肿瘤和免疫促进活性多糖对免免疫疫功功能能具有重要的调节作用，从多多个个层层次次多多个个途途径径激激活活机机体体免免疫疫系系统统。包括对各种免免疫疫细细胞胞的调节，对细胞因子的调节以及对补体的调节的调节，对细胞因子的调节以及对补体的调节等。香菇多糖已用于临床，另外灵芝多糖、地黄多糖、冬虫夏草多糖、海带多糖、微藻多糖等也具有抗抗肿肿瘤瘤活性活性。4生化药物制造工艺糖类药物2、抗病毒活性、抗病毒活性多糖类在结构上与细胞表面糖糖胺胺聚聚糖糖类类似似，竞竞争争抑抑制制病病毒毒与与细细胞胞结结合合，同时又是许多细胞表面分子的模模拟配体，能直接与细胞结合，阻碍病毒的吸附。拟配体，能直接与细胞结合，阻碍病毒的吸附。3、抗凝血活性、抗凝血活性肝素肝素是天然抗凝剂，带有负电荷。甲壳素、硫酸化昆昆布布多多糖糖、海海带带多多糖糖均具有体内外抗抗凝凝血血作作用用。芦芦荟荟多多糖糖、黑黑木木耳耳多多糖糖等也具有肝素样的抗凝血作用抗凝血作用。5生化药物制造工艺糖类药物4、抗氧化活性、抗氧化活性多糖可通过提提高高抗抗氧氧化化酶酶活活性性、清清除除自自由由基基、抑抑制制脂质过氧化脂质过氧化，从而保护生物膜保护生物膜。5、抗感染作用、抗感染作用多多糖糖可以提高机体组织细胞对细细菌菌、原原虫虫、病病毒毒和和真真菌菌感感染染的抵抗力。如甲壳素对皮皮下下肿肿胀胀有有治治疗疗作作用用，对皮肤伤口有愈合作用愈合作用。6、降血脂、抗动脉粥样硬化作用、降血脂、抗动脉粥样硬化作用类肝素、硫酸软骨素、小分子量肝素等具有降降血血脂脂、降降血血胆胆固固醇醇、抗抗动动脉脉粥粥样样硬硬化化作作用用，用于防治冠心病和动脉硬化。6生化药物制造工艺糖类药物7、抗辐射、抗突变、抗辐射、抗突变随着人类对多糖研究的不断深入。将会发现多多糖糖更多的作用和用途。7生化药物制造工艺糖类药物二、糖类药物制备的一般方法二、糖类药物制备的一般方法（一）单糖及其衍生物的制备（一）单糖及其衍生物的制备游离单单糖糖及及小小分分子子寡寡糖糖易易溶溶于于冷冷水水及及温温乙乙醇醇，单糖、双糖类、三糖类、四糖类以及多元醇类。可以用水或在中性条件下以50乙乙醇醇为提取溶剂，也可以用82乙醇，在乙醇，在7078下回流提取下回流提取。植物材料磨碎经乙乙醚醚或或石石油油醚醚脱脱脂脂，拌加碳酸钙，（药材中拌拌入入碳碳酸酸钙钙或或氢氢氧氧化化钡钡，以防防止止酶酶和和有有机机酸酸的影响。）以50乙醇温浸，用中中性性醋醋酸酸铅铅去杂杂蛋蛋白白及其他杂质，铅离子可通通H2S除去除去，再浓缩。8生化药物制造工艺糖类药物醇液经活性炭脱脱色色、浓浓缩缩、冷冷却却、滴滴加加乙乙醚醚，或或置于硫酸干燥器置于硫酸干燥器中旋转，析出结晶。单糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸吸附附层层析析法法或离子交换法进行纯化或离子交换法进行纯化。（二）多糖的分离与纯化（二）多糖的分离与纯化多糖可来自动动物物、植植物物和和微微生生物物。来源不同，提取分离方法也不同。植植物物体体内内含有水水解解多多糖糖衍衍生生物物的的酶酶，必须抑抑制制或或破破坏酶的作用坏酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。9生化药物制造工艺糖类药物因温温度度升升高高，使多糖受到内内源源酶酶的的作作用用。速速冻冻冷冷藏藏是保存提取多糖材料保存提取多糖材料的有效方法。提取方法提取方法依照不同种类的多糖的溶解性质溶解性质而定。酸性黏多糖酸性黏多糖常含有氨基己糖、己糖醛酸以及硫酸氨基己糖、己糖醛酸以及硫酸基基等多种结构成分，且常与蛋白质结合与蛋白质结合在一起，提取分离时，通常先用蛋白酶或浓碱、浓中性盐解蛋白酶或浓碱、浓中性盐解离蛋白质与糖的结合键后，用水提取。10生化药物制造工艺糖类药物1、多糖的提取、多糖的提取提提取取多多糖糖时时，一般需先进行脱脱脂脂，以便多糖释放。方法是将材材料料粉粉碎碎，用甲醇或1：1乙乙醇醇乙乙醚醚混混合合液液，加热搅拌13h，也可用石油醚脱脂石油醚脱脂。动物材料动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理丙酮脱脂、脱水处理。多糖的提取方法主要有以下几种。（1）难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者）难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者对甘甘露露聚聚糖糖、半半乳乳聚聚糖糖等能形成硼硼酸酸络络合合物物的的多多糖糖，可加入硼砂硼砂，此法可得相当纯的物质。11生化药物制造工艺糖类药物（2）易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者）易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者材料用冷冷水水浸浸过过，用热水提取，必要时可加加热热至至8090搅拌提取，提取液用正正丁丁醇醇与与三三氯氯甲甲烷烷混混合合液液除去杂蛋白（或用三三氯氯乙乙酸酸除除杂杂蛋蛋白白），透析后用乙醇沉淀乙醇沉淀得多糖。（3）黏多糖）黏多糖因大部分黏黏多多糖糖与与蛋蛋白白质质结结合合于细胞中，因此需用酶酶解解法法或或碱碱解解法法使糖糖蛋蛋白白质质间的结结合合键键断断裂裂，促使多糖释放多糖释放。碱碱解解法法可以防止黏多糖分子中硫硫酸酸基基的水解破坏，也可以同时用酶解法酶解法处理组织。12生化药物制造工艺糖类药物碱碱解解法法。多糖与蛋白质结合的糖糖肽肽键键对对碱碱不不稳稳定定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。黏多糖分子上的硫硫酸酸基基一一般般对对碱碱较较稳稳定定，但若硫硫酸酸基基与与邻邻羟羟基基处处于于反反式式结结构构或硫硫酸酸基基在C3或或C6上，此时易发生脱脱硫硫作作用用。因此对这类多糖不不宜宜用用碱碱解法提取解法提取。酶解法。酶解法。蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖的最常用方法。鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键断裂糖肽键及其附近的肽键，因此成品中会保留较长的肽段。为除去长肽段，常可与碱解法合用碱解法合用。13生化药物制造工艺糖类药物2、多糖的纯化、多糖的纯化多糖的纯化方法很多，但必须根据目目的的物物的的性性质质及及条条件件选择合适的纯化方法。一种方法不易得到理想的结果，因此必要时应考虑合用几种方法。（1）乙乙醇醇沉沉淀淀法法乙醇沉淀法是制备黏多糖的最常用手段。乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。如使用充分过过量量的的乙乙醇醇，黏黏多多糖糖浓浓度度少少于于01也可以沉淀完全沉淀完全。向溶液中加入一定浓度的盐，如醋醋酸酸钠钠、醋醋酸酸钾钾、醋醋酸酸铵铵或或氯氯化化钠钠有助于使黏多糖从溶液中析出，盐的最最终终浓浓度度5即即足足够够。使用醋醋酸酸盐盐的的优优点点是在乙醇中其溶解度更大，即使在乙乙醇醇过过量量时，也不会发生这类盐的共沉淀共沉淀。14生化药物制造工艺糖类药物加完乙醇，搅拌数小时，以保证多糖完完全全沉沉淀淀。沉淀物可用无无水水乙乙醇醇、丙丙酮酮、乙乙醚醚脱水，真空干燥即可得疏松粉末状疏松粉末状产品。（2）分级沉淀法）分级沉淀法不同多糖在不同浓度的甲甲醇醇、乙乙醇醇或或丙丙酮酮中的溶溶解解度度不不同同，因此可用不同浓度的有有机机溶溶剂剂分分级级沉沉淀淀分子量大小不同的黏多糖。在Ca2、Zn2十十等等二二价价金金属属离离子子的的存存在在下下，采用乙乙醇分级分离醇分级分离黏多糖可以获得最佳效果。15生化药物制造工艺糖类药物（3）季季铵铵盐盐络络合合法法黏黏多多糖糖与一些阳阳离离子子表表面面活活性性剂剂如十六烷基三三甲甲基基溴溴化化铵铵和十六烷基氯氯化化吡吡啶啶（CPC）等能形成季铵盐络合物季铵盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物可以解离、溶解、释放解离、溶解、释放。无无机机盐盐浓浓度度（临界盐浓度）主要取决于聚聚阴阴离离子子的电荷密度的电荷密度。黏多糖的硫酸化程度硫酸化程度影响其电荷密度电荷密度。季季胺胺盐盐的的沉沉淀淀能能力力受其烷基链中的亚亚甲甲基基数数的影响，还可以用不不同同种种季季铵铵盐盐的的混混合合物物作为酸性黏多糖的分分离沉淀剂离沉淀剂。应应用用季季铵铵盐盐沉沉淀淀多多糖糖是是分分级级分分离离复复杂杂黏黏多多糖糖的的最最有用方法之一有用方法之一。16生化药物制造工艺糖类药物（4）离离子子交交换换层层析析法法黏多糖由于具有酸酸性性基基团团如糖糖醛醛酸酸和和各各种种硫硫酸酸基基，在溶液中以聚阴离子形式存在，因而可用阴离子交换剂阴离子交换剂进行交换吸附。洗脱时可以逐步提高盐浓度如梯梯度度洗洗脱脱或分步阶段洗脱。（5）凝凝胶胶过过滤滤法法凝胶过滤法可根据多糖分分子子量量大大小小不同不同进行分离。此外，区区带带电电泳泳法法、超超滤滤法法及及金金属属络络合合法法等在多糖的分离纯化中也常采用。17生化药物制造工艺糖类药物3、溶液中多糖浓度的测定、溶液中多糖浓度的测定（1）蒽酮硫酸比色法测定糖含量）蒽酮硫酸比色法测定糖含量糖糖类类遇遇浓浓硫硫酸酸脱水生成糠糠醛醛或或其其衍衍生生物物，可与蒽蒽酮酮试剂结合产生颜颜色色反反应应，反应后溶液呈蓝蓝绿绿色色，于620nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系吸收值与糖含量呈线性关系。标标准准曲曲线线：以“0”管作空白对照，620nm处处的的吸吸光度光度，以吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线。取样品液0.1ml，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线计算标准曲线计算多糖含量。18生化药物制造工艺糖类药物（2）3，5二二硝硝基基水水杨杨酸酸（DNS）比比色色法法测测定定还还原原糖糖在在碱碱性性溶溶液液中中，DNS与与还还原原糖糖共共热热后后被被还还原原成成棕棕红红色色氨氨基基化化合合物物，在一定范围内还还原原糖糖的的量量与反应液的颜色强度呈比比例例关关系系，利用比色法可测定样品中的含糖量。（3）苯酚硫酸比色法）苯酚硫酸比色法苯苯酚酚硫硫酸酸试试剂剂可与多糖中的己己糖糖、糖糖醛醛酸酸起显显色色反反应应，在490nm处处有有最最大大吸吸收收，吸收值与糖含量呈线性关系。19生化药物制造工艺糖类药物（4）葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖）葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶专一氧化葡葡萄萄糖糖，生成葡葡萄萄糖糖酸酸和和过过氧氧化化氢氢，再利用过过氧氧化化物物酶酶催化过过氧氧化化氢氢氧化某些物质如邻邻甲甲氧氧苯苯胺胺使其从无无色色转转变变为为有有色色，通过比比色法计算色法计算葡萄糖含量。葡萄糖溶液中葡葡萄萄糖糖和和葡葡萄萄糖糖存存在在着着动动态态平平衡衡，随着葡萄糖的氧化，最终所有型型全全部部转转变变成成型被氧化型被氧化。（5）Nelson法法 还原糖还原糖将铜试剂铜试剂还原生成氧化亚铜氧化亚铜，在浓硫酸浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液砷钼酸生成蓝色溶液，在在560nm下的吸收值与下的吸收值与糖含量呈线性关系。糖含量呈线性关系。20生化药物制造工艺糖类药物（2）高效凝胶渗透色谱法）高效凝胶渗透色谱法HPLC法法具有快速、高分辨率和重现性好的优点，因此得到越来越多的应用。用于HPLC的凝胶柱均为商品柱，其填料有疏疏水水性性的的，也也有有亲亲水水性性的的，而且每根柱的孔径不同，分分离离分分子量的范围亦不同子量的范围亦不同。选用哪一种性质的填料和用多大的排排阻阻限限和和渗渗透透限限，主要取决于被分离溶溶质质的的性性质质和和可可能能的的分分子子量量大大小小。多糖的检测不采用柱柱后后衍衍生生化化方方法法，而是采用直直接检测接检测。22生化药物制造工艺糖类药物（3）比旋度法）比旋度法不同的多糖具有不不同同的的比比旋旋度度，在不同浓度的乙醇中具有不同溶解度不同溶解度。如果多糖的水溶液经不不同同浓浓度度的的乙乙醇醇沉沉淀淀所得的沉淀具有相同比旋度相同比旋度，则该多糖为均一组分均一组分。（4）超离心法）超离心法如果多糖在离心力场作用下形成单一区带，说明多糖微粒沉沉降降速速度度相相同同，表表明明其其分分子子的的密密度度、大大小小和和形状相似形状相似。23生化药物制造工艺糖类药物三、重要糖类药物的制备三、重要糖类药物的制备糖类药物品种繁多，现根据其来源、性质及工艺特点不同，主要介绍具有代表性的几个重要品种的生产工艺。（二）（二）1，6-二磷酸果糖二磷酸果糖（1)、结构与性质、结构与性质1，6-二磷酸果糖二磷酸果糖是果糖的1，6-二磷酸酯，其分子形式有游离酸游离酸FDPH4与钠盐与钠盐如1，6-二磷酸果糖三钠盐（FDPNa3H）等。FDPNa3H为白色晶形粉末，有旋光，易溶于水，不溶于有机溶剂。24生化药物制造工艺糖类药物2、生产工艺、生产工艺1）酶转化工艺）酶转化工艺（1）工艺路线：）工艺路线：25生化药物制造工艺糖类药物取经多代发酵应用过的酵母渣，悬浮于适量蒸馏水中，反 复 冻冻 融融 3次次，加 入 底 物（8 蔗 糖，4NaH2PO4，30mmolLMgCl2，pH6.5）于30，反应6h。除杂蛋白除杂蛋白煮沸煮沸5min。阴离子交换柱层析阴离子交换柱层析转转酸酸 FDPCa沉沉淀淀悬浮于水中，732树脂转酸，NaOH调pH535.8，除菌过滤后，冻干。26生化药物制造工艺糖类药物（三）肝素（三）肝素1、结构与性质、结构与性质肝素是天天然然抗抗凝凝剂剂，是一种含有硫硫酸酸基基的酸酸性性粘粘多糖多糖。肝素及其钠盐为白色或灰白色粉末，无臭无味，有吸湿性，易易溶溶于于水水，不溶于乙乙醇醇、丙丙酮酮、二二氧氧六六环环等有机溶剂，其游离酸游离酸在乙醚中有一定溶解性。肝素分子中含有硫硫酸酸基基与与羧羧基基，呈强强酸酸性性，为聚聚阴阴离子，能与阳离子反应成盐离子，能与阳离子反应成盐。硫硫酸酸化化程程度度高高的肝素具有较高的降降脂脂和抗抗凝凝活活性性。小分子量肝素（分子量40005000）具有较低的抗抗凝凝活性和较高活性和较高的抗血栓形成活性抗血栓形成活性。27生化药物制造工艺糖类药物2、生产工艺、生产工艺肝素肝素系广泛分布于哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠粘膜、肌肉和血液胸腺、肠粘膜、肌肉和血液里。其生产工艺生产工艺主要有盐解盐解-季胺盐沉淀法季胺盐沉淀法，盐解盐解-离子离子交换法交换法和酶解酶解-离子交换法离子交换法。肝素在组织内和其他粘粘多糖多糖一起与蛋白质结合成蛋白质结合成复合物复合物，因此肝素制备过程包括肝素蛋白质复合物的提取肝素蛋白质复合物的提取、解离解离和肝素的分离纯分离纯化化两个步骤。28生化药物制造工艺糖类药物1）盐解）盐解-离子交换生产工艺离子交换生产工艺（1）工艺路线：）工艺路线：继续升温至继续升温至95，维持，维持10min。95乙醇乙醇沉淀过夜NaOH调PH11，按3量加入H2O2（H2O2浓度30），共共48小时小时。去热原、杂质去热原、杂质。29生化药物制造工艺糖类药物3、检验方法检验方法4、作用与用途、作用与用途肝素是典型的抗凝血药抗凝血药，能阻止血液的凝结过程，用于防止血栓防止血栓的形成。30生化药物制造工艺糖类药物（四）小分子肝素（四）小分子肝素1、结构与性质、结构与性质肝素通过与AT结结合合并抑抑制制a因因子子和和Xa因因子子活活性性而发挥抗栓、抗凝作用。发挥抗栓、抗凝作用。31生化药物制造工艺糖类药物（2）工艺过程）工艺过程降降解解。HCl调pH至至2.8，加NaNO2反反应应，反应温度为1825，用KI试纸控制终点试纸控制终点。还还原原。调节pH至至9.8，反应温度为1825，加NaBH4反应2h。沉沉淀淀。调节pH至至5.56.6，95乙乙醇醇沉沉淀淀，得小分子肝肝素素粗粗品品。蒸馏水溶解，95乙乙醇醇沉沉淀淀。蒸馏水溶解，95乙醇沉淀乙醇沉淀。得小分子肝素精品小分子肝素精品。32生化药物制造工艺糖类药物3、检验方法、检验方法抗Xa因子活性测定抗IIa因子活性测定4、作用和用途、作用和用途 小分子量肝素钠具有抗抗Xa因子活性因子活性，药效学研究表明小分子量肝素钠对体内、外血栓体内、外血栓，动静脉血栓血栓的形成有抑制作用抑制作用。33生化药物制造工艺糖类药物（五）香菇多糖（五）香菇多糖1、结构与性质、结构与性质香菇多糖系从担子菌纲伞菌科真菌香菇子实体中提取分离纯化获得的均一组分的多糖，香菇多糖是以（l3）葡葡萄萄糖糖为为主主链链，（16）葡葡萄萄糖糖为为侧侧链链的葡聚糖。重重复复结结构构单单位位一一般般含含有有7个个葡葡萄萄糖糖残残基基，其中其中2个残基在侧链上个残基在侧链上。34生化药物制造工艺糖类药物香菇多糖为白色粉末。香菇多糖的抗抗肿肿瘤瘤作作用用与其化学结构尤其是D（13）链关系密切）链关系密切。采用凝胶过滤法（HPLC）和激激光光拉拉曼曼散散射射法法测测得得其相对分子量为41058105。35生化药物制造工艺糖类药物4、作用与用途、作用与用途 香菇多糖具有广泛的药理学活性，如免疫调节作免疫调节作用用，抗肿瘤、抗衰老作用抗肿瘤、抗衰老作用。目前香菇多糖主要用于恶恶性肿瘤的辅助治疗性肿瘤的辅助治疗。36生化药物制造工艺糖类药物