生化前沿蛋白质功能研究方法的一点探讨课件

蛋白质功能研究方法的一点探讨蛋白质功能研究方法的一点探讨 01/04/2013蛋白质功能研究方法的一点探讨 01/04/20131 *DNA *RNA *ProteinMessengerHeadquarterExecutor *DNAMessengerHeadquar2蛋白质功能研究起始蛋白质功能研究起始生物信息学分析生物信息学分析n n背景：信号蛋白，调节蛋白以及大多数其他的蛋白质都具有包括相互作用区域在内的好几个结构域；n n应用：综合利用生物学，计算机科学和信息技术而揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘。蛋白质功能研究起始生物信息学分析背景：信号蛋白，调节蛋白以3蛋白质功能研究起始蛋白质功能研究起始信息学序列同源性 Homology相互作用区域Interaction motif功能结构域Functional domain为抗体、siRNA,shRNA等的设计提供预测 功能伙伴的预测新蛋白蛋白质功能研究起始信息学序列同源性相互作用区域功能结构域为抗4PRD WH2Y397Y398 IMD domainF-actin bindingRac bindingCortactin bindingG-actinbindingSrc SH2 binding利用信息学分析预测新蛋白的功能结构域、相互作用结构域、磷酸化位点Yamagishi et al,J Biol Chem,279,14929,2004;Mattila et al,J Biol Chem,278,8452,2003;Bompard et al,J Cell Sci,118,5393,2005.Lin et al,Oncogene,24,2059,2005.示例：示例：PRD WH2Y397Y398 IMD doma5序列同源性分析为抗体制备（抗原序列选择）、siRNA,shRNA等的设计提供预测 序列同源性分析为抗体制备（抗原序列选择）、siRNA,shR6蛋白质功能研究起始之试验蛋白质功能研究起始之试验准备试验工具：抗体;克隆；探索体内生物学背景：内源表达水平；组织分布；细胞定位；外来干预下具有生物学意义上的变化：(-)Knock out or Knock down (+)Over-expression蛋白质功能研究起始之试验准备试验工具：抗体;克隆；7蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用研究8n n事物是普遍联系的。世界上的一切事物都处在普遍联系之中，没有任何一个事物是孤立地存在的，整个世界是一个相互联系的整体。n nWere all connected:to each other biologically,to the Earth chemically,to the rest of the universe atomically.”（Feynman）事物是普遍联系的。世界上的一切事物都处在普遍联系之中，没有任9Single protein Protein complex Protein complex interaction Protein complex network Cell,Versatile,Dynamic,Accurate regulationCell assembly and functionProtein-Protein InteractionsSingle proteinCell assembly an10Interaction Domain-Structural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础信号蛋白，调节蛋白以及大多数其他的蛋白质 都具有包括相互作用区域在内的好几个结构域；有些多肽仅由相互作用区域组成，从而充当蛋白 质复合物的核心。Interaction Domain-Structural11信号通路中的蛋白质相互作用与相互作用结构域信号通路中的蛋白质相互作用与相互作用结构域信号通路中的蛋白质相互作用与相互作用结构域12蛋白质相互作用的生理功能蛋白质相互作用的生理功能蛋白质相互作用的生理功能蛋白质相互作用的生理功能 Localization 蛋白质的亚细胞定位蛋白质的亚细胞定位*蛋白质的亚细胞定位与其 功能密切相关；*涉及：蛋白质-蛋白质相互作用；蛋白质与磷脂的相互作用；*蛋白质的组织特异性与 亚细胞定位的研究是蛋白 质功能研究的起始步骤蛋白质相互作用的生理功能 Localization 蛋白13*蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。*错误的相互作用可能导致病理现象的出现。蛋白质相互作用的生理功能蛋白质相互作用的生理功能蛋白质相互作用的生理功能14动态的蛋白质相互作用与翻译后修饰动态的蛋白质相互作用与翻译后修饰n nDynamic behavior of cells in response to changing conditions is highly dependent on posttranslational modifications;细胞面对不断改变的环境表现出来的动态行为有赖于蛋白质的翻译后修饰以及它带来的蛋白质相互作用的变化。动态的蛋白质相互作用与翻译后修饰Dynamic behavi15蛋白质相互作用的研究方法与技术蛋白质相互作用的研究方法与技术Elucidation of Protein-Protein InteractionsBiophysical TechniquesMass SpectrometrySurface Plasmon Resonance Atomic Force MicroscopyNMRX-ray CrystallographyHigh Throughput TechniquesLibrary ScreeningDegenerate Peptide LibrariesSpot BlotsCo-IPsGST-pulldownsYeast 2-HybridPhage DisplayStandard TechniquesCo-IPsGST-pull downsYeast 2-HybridPhage DisplayIn vivo ImagingFRETBRETProtein Interaction Networks蛋白质相互作用的研究方法与技术Elucidation of 16GST-Pull down原理:亲和纯化；依赖于多肽或蛋白质的相互作 用区域的亲和力大小；特点：直接相互作用/体外相互作用GST-Pull down原理:亲和纯化；17GST-pull down 流程图：流程图： down www.biotechnique18免疫沉淀免疫沉淀 Immunoprecipitation免疫沉淀 Immunoprecipitation19质量作用定律决定质量作用定律决定IP的成功度的成功度质量作用定律决定IP的成功度20免疫沉淀（非变性）免疫沉淀（非变性）免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A(or G)与 IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度；Protein A BeadIgG AntigenKdKd*IgG KdAntigen免疫沉淀（非变性）免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A 21Co-Immunoprecipitation/共免疫沉淀共免疫沉淀原理:蛋白质复合物的亲和纯化特点:In vivo/代表生理状态下的相互作用XYXYCell Cell Lysis andImmunoprecipitation of protein X ZZ细胞裂解与蛋白质X的免疫沉淀Co-Immunoprecipitation/共免疫沉淀原22免疫共沉淀流程示意图：免疫共沉淀流程示意图：http:/www.molecularsciences.org/proteomics/protein_protein_interactions免疫共沉淀流程示意图：http:/www.molecula23免疫沉淀（非变性）免疫沉淀（非变性）免疫沉淀的产物用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时，*需要去除盐的干扰，PBS 或其它洗涤缓冲液应 尽可能去除；*大量IgG掺入影响电泳效果，如脱尾和扩散。检测信号十分微弱时，这种条带的扩散可能导 致根本无法获得信息；免疫沉淀（非变性）免疫沉淀的产物用于SDS-PAGE及及24Co-IP特点特点n nAdvantages of co-immunoprecipitationAdvantages of co-immunoprecipitation-Proteins in their native state-Proteins in their native state-At their native concentration(unless transfection)-At their native concentration(unless transfection)n nDisadvantages of co-immunoprecipitationDisadvantages of co-immunoprecipitation-Mixing of compartments during cell lysis,i.e.-Mixing of compartments during cell lysis,i.e.interacting proteins might not be in the same cellular interacting proteins might not be in the same cellular compartmentcompartment-Detection of stable interactions only-Detection of stable interactions only-Does not indicate whether interaction is direct-Does not indicate whether interaction is direct-Antibodies required-Antibodies requiredhttp:/www.molecularsciences.org/proteomics/protein_protein_interactionsCo-IP特点Advantages of co-immuno25非变性免疫沉淀非变性免疫沉淀1.生理活性的保持：2.a.全程低温操作；3.b.裂解液中加入蛋白酶抑制剂；4.2.免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A(or G)与 IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度；Protein A BeadIgG XKdKd*IgG XKd非变性免疫沉淀生理活性的保持：Protein AIgG 26免疫沉淀（非变性）免疫沉淀（非变性）免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时，大量的IgG掺入样品后导致免疫印迹时出现非特异性条带；对免疫共沉淀的结果分析影响尤其大；IgG目的蛋白用目的蛋白的抗体进行 免疫沉淀，再用免疫印 迹法进行检测；免疫沉淀（非变性）免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免27GFP WT YF Mut(6)-+-+-+IP:GFPIB:4G10(pTyr)MTSS1-GFPGFPPDGF115 93 49.8 35.8 29.2198 -+-+-+Reblot:GFP MTSS1-GFPGFP WT YF Mut(6)GFP WT YF Mut(6)-28 免疫共沉淀：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑1.抗体的质量：抗体的特异性；2.尽可能的设置多种阴性对照；一般采用兔子免疫前的血清(pre-immune serum)同时进行免疫沉淀及后续分析;3.使用目标蛋白的多种抗体进行免疫沉淀并比较；4.采用不表达目标蛋白的细胞裂解物同时进行免疫 沉淀并比较；5.增强细胞裂解液的严谨性，降低非特异性；6.检测两种蛋白质的相互作用时，同时用两个蛋白质的抗体进行实验；免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑1.29细胞可渗透交联剂在细胞可渗透交联剂在Co-IPCo-IP中的应用中的应用*当 X-Y 的复合物不很稳定或解离常数大时，可以考虑使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker)XNH2YNH2活性基团活性基团A BAxY细胞裂解蛋白质X的抗体进行免疫沉淀细胞可渗透交联剂在Co-IP中的应用*当 X-Y 的复合30*当 X-Y 的复合物是瞬间形成的或解离常数大时，可以考虑使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker)XNH2YNH2活性基团活性基团活性基团活性基团A 细胞可渗透交联剂在细胞可渗透交联剂在Co-IPCo-IP中的应用中的应用*当 X-Y 的复合物是瞬间形成的或解离常数大时，XNH31研究方案研究方案:Affinity purification&MS带Tag的目标蛋白与固相基质偶联目标蛋白带上Tag目标蛋白相互作用蛋白的亲和纯化目标蛋白复合物的SDS-PAGE分离蛋白质条带的切割和酶解质谱与生物信息学分析文献与其他数据库的功能分析实验验证与功能的探索研究方案:Affinity purification&32MTSS1 MTSS1 过量表达促进过量表达促进PDGFPDGF诱导的背部变皱膜形成诱导的背部变皱膜形成GFPMTSS1-GFPMTSS1 过量表达促进PDGF诱导的背部变皱膜形成GFPM33PRD WH2CCDY397Y398 IMD domainF-actin bindingRac bindingCortactin bindingG-actinbindingSrc SH2 binding利用信息学分析新蛋白的结构和功能区，并进行相互作用蛋白的预测Yamagishi et al,J Biol Chem,279,14929,2004;Mattila et al,J Biol Chem,278,8452,2003;Bompard et al,J Cell Sci,118,5393,2005.Lin et al,Oncogene,24,2059,2005.PRD WH2CCDY397Y398 IMD d34n n核糖体蛋白n n代谢酶类n n热休克蛋白n n泛肽酶n n高丰度的细胞骨架蛋白n n血清蛋白（如果使用是IP亲和的方式）免疫沉淀产物的质谱鉴定结果中通常包含很免疫沉淀产物的质谱鉴定结果中通常包含很多非特异的蛋白质信息多非特异的蛋白质信息去除这些常见的非特异结合的蛋白质（除非它们与你目标 蛋白质功能相关）核糖体蛋白免疫沉淀产物的质谱鉴定结果中通常包含很多非特异的蛋35 利用生物信息学与已有文献对可能的候选相互作利用生物信息学与已有文献对可能的候选相互作 用蛋白进行进一步甄别和筛选，分析这些蛋白质用蛋白进行进一步甄别和筛选，分析这些蛋白质 是否来自于同一个小型复合物并选择下一步试是否来自于同一个小型复合物并选择下一步试 验对象；验对象；*验证候选者与靶蛋白的相互作用；验证候选者与靶蛋白的相互作用；*探索其相互作用的生物学功能；探索其相互作用的生物学功能；After Co-IP and MS identification 利用生物信息学与已有文献对可能的候选相互作After C36利用亚细胞定位及蛋白质相互作用等信息进行蛋白质功能归属例 1：从免疫共沉淀中得到的蛋白质中筛选重要功能相关蛋白：利用免疫共沉淀方法找到的9个p53(胞浆和核定位胞浆和核定位）结合蛋白 1.GRP-94 GRP-94 2.Alpha-actinin 1 GRP-78 分子伴侣 *3.MCM3 GRP-75 4.GRP-78 5.GRP-75 2 MCM3 DNA复制准许因子*6.Lamin A/C 7.Ezrin/Cytovillin Alpha-actinin 胞浆 8.CD98 antigen 3 Lamin A/C 核纤层 细胞骨架？9.Protein kinase C Ezrin/cytovilin 胞浆 4 Protein Kinase C 激酶？5 CD98 antigen 跨膜糖蛋白 X 1 利用亚细胞定位及蛋白质相互作用等信息进行蛋白质功能归属例 37寡沉淀寡沉淀(oligoprecipitation)大多数蛋白质经过磷酸化等修饰后才能被激活,发挥其特定的功能，而在蛋白质活性状态和非活性状态时，与其发生相互作用的物质有所不同。传统的免疫共沉淀方法不能区分哪些蛋白是与靶蛋白活性状态时相结合的。寡沉淀(oligoprecipitation)大多数蛋白质38Meng 等于2006年在免疫共沉淀基础上建立了寡沉淀方法,用来研究处于活性状态的转录因子蛋白质相互作用。质谱鉴定质谱鉴定结合结合洗涤洗涤洗脱洗脱基基质质基基质质基基质质洗涤洗涤基基质质质谱鉴定质谱鉴定寡寡沉沉淀淀免免疫疫沉沉淀淀Meng Z,Camalier C E,Lucas D A,et al.Probing early growth response 1 interacting proteins at the active promoter in osteoblast cells using oligoprecipitation and mass spectrometryJ .J Proteome Res,2006,5(8):193121939Meng 等于2006年在免疫共沉淀基础上建立了寡沉淀方法,39减量式定量免疫沉淀减量式定量免疫沉淀(quantitative immunoprecipitation combined with knockdown,QUICK)2006 年,Mann实验室将SILAC，RNA干扰和免疫共沉淀技术结合,建立了研究真实相互作用的新方法QUICK。Selbach M,Mann M.Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown(QUICK)J .Nat Methods,2006,3(12):9812983减量式定量免疫沉淀2006 年,Mann实验室将SILAC，40QUICK 流程图流程图QUICK 流程图41QUICKQUICK基本原理基本原理利用轻、重稳定同位素标记培养基中氨基酸，分别利用轻、重稳定同位素标记培养基中氨基酸，分别供给供给2 2 组靶蛋白表达细胞代谢生长；组靶蛋白表达细胞代谢生长；采用采用RNA RNA 干扰技术降低其中干扰技术降低其中1 1组细胞的靶蛋白表达量；组细胞的靶蛋白表达量；利用免疫共沉淀方法分别从利用免疫共沉淀方法分别从2 2组细胞中获得与靶蛋组细胞中获得与靶蛋白相互作用的蛋白质复合体；白相互作用的蛋白质复合体；混合混合2 2 组复合体组复合体,进行定量质谱分析；进行定量质谱分析；由于其中由于其中1 1组细胞靶蛋白量的减少组细胞靶蛋白量的减少,导致与其真实相导致与其真实相互作用形成的复合体量也相应降低互作用形成的复合体量也相应降低,在质谱图上应表在质谱图上应表现为非等量的相邻峰现为非等量的相邻峰,而等量的相邻峰则代表了分离而等量的相邻峰则代表了分离纯化时与抗体或基质结合的非特异相互作用蛋白质。纯化时与抗体或基质结合的非特异相互作用蛋白质。QUICK基本原理利用轻、重稳定同位素标记培养基中氨基酸，分42