液相色谱课件

HPLC的环境设置：HPLC的日常操作条件：温度：1030；相对湿度80；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。现在检测糖组分的液相要求检测器的温度是35.2HPLC的环境设置：HPLC的日常操作条件：温度：103一、色谱起源一、色谱起源石油石油醚碳酸碳酸钙颗粒粒色素色素色色谱组分分3一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分3液相色谱流程图液相色谱流程图输液液泵进样器器色色谱柱柱柱温箱柱温箱检测器器溶溶剂数据数据处理理4液相色谱流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器溶剂数据处理4 5 566第二节第二节 基本理论基本理论一、色谱分离过程一、色谱分离过程（一）液（一）液-固吸附色谱固吸附色谱流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用的不同来分离物质。附作用的不同来分离物质。7第二节 基本理论一、色谱分离过程（一）液-固吸附色谱流动相为流动相和固定相都是液体的色谱法即为液流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液液色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂渍于载体上的固定相。种是涂渍于载体上的固定相。（二）液（二）液-液分配色谱液分配色谱流动相极性小于固定相极性的液流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相液色谱法称为正相分配色谱法分配色谱法流动相极性大于固定相极性的液流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相液色谱法称为反相分配色谱法分配色谱法8流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液（二）液-液分配色谱正相正相HPLC 色谱柱色谱柱l 硅胶型硅胶型 l 氰基型氰基型 l 氨基型氨基型 糖类分析糖类分析l 二醇基型二醇基型 蛋白质分析蛋白质分析Silica gelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Modified Si9正相HPLC 色谱柱 硅胶型 Silica gelSi反相反相HPLC 色谱柱色谱柱lC18(ODS)type lC8(octyl)typelC4(butyl)typelPhenyl type lTMS typelCyano type-Si-C18H37SiNon-polar property10反相HPLC 色谱柱C18(ODS)type-Si-C流动相流动相选择注意事项：纯度：采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相配制时的顺序11流动相流动相选择注意事项：11溶溶 剂剂 等等 级级水的等级水的等级纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水去离子水去离子水波长波长(nm)纯化水纯化水去离子水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率吸光率吸光率吸光率12溶 剂 等 级水的等级波长(nm)纯化水去离子水因为HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：1 专门的纯水机或超纯水机；2 去离子水重蒸；3 二次或三次重蒸水；4 采用类似家用的纯水机；5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；6 其它途径；13HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：1 专门的纯水机或超不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。14不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短溶剂前处理 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。15溶剂前处理 过滤：0.45um或更小孔径滤膜15溶剂前处理 脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响：1）柱压波动，流量偏小 2）基线波动 16溶剂前处理 脱气1630mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.22m和0.45m两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。样品过滤头的类型：样品过滤头的类型：17样品过滤头的类型：17滤膜类型滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。18滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：18进样器自动进样器手动进样器 原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入 2）部分注入返回19进样器自动进样器返回19HPLC六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。20HPLC六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器是高效液相色谱系手动进样器的原理图手动进样器的原理图 装填状态装填状态进样状态进样状态返回21手动进样器的原理图 装填状态进样状态返回21虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。22虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。23手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，如20l的定量环最多进样15l的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。24六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10l的定量环，实际是9l还是1ll并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。25可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用045m的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。26进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用进样体体积 检检测测器器响响应应值值定量管体定量管体积的一半的一半3倍定量管体倍定量管体积全量注入全量注入部分注入部分注入进样体积与响应值关系进样体积与响应值关系返回27进样体积 检测器响应值定量管体积的一半3倍定量管体积全量注入泵的保养使用流动相尽量要清洁；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；28泵的保养使用流动相尽量要清洁；28柱的保养：柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提纯；严格控制进样量；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；29柱的保养：柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；29流动相注意点离子对试剂的使用具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开始流动相平衡 加快平衡时间异丙醇的使用30流动相注意点离子对试剂的使用30LC检测器紫外可见检测器（UV/VIS）二极管阵列检测器（PDA）示差检测器（RID）电导检测器（CDD）荧光检测器（RF）电化学检测器（L-ECD）质谱检测器（MS）蒸发光散射检测器（ELSD）31LC检测器紫外可见检测器（UV/VIS）31吸滤头材料：不锈钢烧结，孔径10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用异丙醇（或5稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗32吸滤头材料：不锈钢烧结，孔径10um32单向阀单向阀结构单向阀结构球座吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头抛光面宝石球流动相单向阀原理单向阀原理33单向阀单向阀结构球座吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头 手动进样器手动进样器操作注意点：操作注意点：1 1）进样时，进样针应插到）进样时，进样针应插到底底2 2）不使用时将针头留在进）不使用时将针头留在进样器内样器内3 3）进样应使用液相色谱专）进样应使用液相色谱专用平头进样针用平头进样针4 4）样品溶液）样品溶液pH小于小于10,常用常用密封垫的材质适用密封垫的材质适用pH10,否则换特氟隆材质的密封否则换特氟隆材质的密封垫垫pH10-135 5）清洗应使用专用针口清）清洗应使用专用针口清洗器洗器定子转子针头密封垫弹簧不锈钢套34 手动进样器操作注意点：定子转子针头密封垫弹簧不锈钢套34p经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量pStudyConstantly,AndYouWillKnowEverything.TheMoreYouKnow,TheMorePowerfulYouWillBe写在最后经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量写感谢聆听不足之处请大家批评指导Please Criticize And Guide The Shortcomings结束语讲师：XXXXXX XX年XX月XX日 感谢聆听结束语讲师：XXXXXX