仪器分析高效液相色谱分析课件

2024/8/5第三章第三章高效液相色谱分析高效液相色谱分析High Performance Liquid Chromatography,HPLC2023/8/192023/8/19第三章第三章第三章第三章高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析1 12024/8/53-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法：高效液相色谱法：一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典液相色谱的基础上，引入气相色它在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、高灵敏度检测器。高灵敏度检测器。2023/8/193-1 2023/8/193-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 2 22024/8/52023/8/192023/8/193 32024/8/51.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高压：高压：HPLC采用高压输液设备采用高压输液设备,150-350*105 Pa 高速：高速：HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分流速大增，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。时。高效：高效：化学键和固定相化学键和固定相,30000塔板塔板/米米 高灵敏：高灵敏：10-9g（紫外检测）、（紫外检测）、10-11g（荧光检测）（荧光检测）2023/8/191.2023/8/191.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较4 42024/8/52、HPLC与与GC的区别的区别分析对象及范围分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子可以分析高沸点、高分子量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种采用的流动相中为有限的几种“惰性惰性”气体，气体，只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流采用的流动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。改进分离。操作温度操作温度：GC需高温；需高温；HPLC通常在室温下进行。通常在室温下进行。2023/8/1922023/8/192、HPLC HPLC与与与与GC GC的区别的区别的区别的区别5 52024/8/53-2 3-2 高效液相色谱法理论基础高效液相色谱法理论基础1.速率理论速率理论 P69 =2l l dp+Cd Dmu+Cm dP2 CSmdP2 Cs df2Dm Dm Ds+uH=A+CuBu 由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：2023/8/193-2 2023/8/193-2 高效液相色谱法理论基础速率理论高效液相色谱法理论基础速率理论高效液相色谱法理论基础速率理论高效液相色谱法理论基础速率理论 6 62024/8/5速率方程：速率方程：H=A+B/u+Cu（1）液液体体的的扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体的的万万分分之之一一，HPLC中中速率方程中的速率方程中的分子扩散项分子扩散项分子扩散项分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，较小，可以忽略不计，（2）影响柱效的主要因素是）影响柱效的主要因素是传质项。传质项。传质项。传质项。2023/8/192023/8/19速率方程：速率方程：速率方程：速率方程：H=A+B/u+Cu H=A+B/u+Cu7 72024/8/52、提高柱效的途径：、提高柱效的途径：提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择薄壳形担体）薄壳形担体）选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流动相粘度动相粘度;减小粒度是最有效的途径减小粒度是最有效的途径.2023/8/1922023/8/192、提高柱效的途径：、提高柱效的途径：、提高柱效的途径：、提高柱效的途径：8 82024/8/53-3 3-3 高效液相色谱法高效液相色谱法主要类型及分离原理主要类型及分离原理1 1、液液分配色谱法、液液分配色谱法、液液分配色谱法、液液分配色谱法2 2、液固吸附色谱法、液固吸附色谱法、液固吸附色谱法、液固吸附色谱法3 3、离子交换色谱法、离子交换色谱法、离子交换色谱法、离子交换色谱法4 4、离子对色谱、离子对色谱、离子对色谱、离子对色谱5 5、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法 2023/8/193-3 2023/8/193-3 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法9 92024/8/51 1、液液-液分配色谱液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；分离机制分离机制：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；流流动动相相：对对于于亲亲水水性性固固定定液液，采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定液液的的极极性性（正正相相色色谱谱），反反之之，流流动动相相的极性大于固定液的极性（的极性大于固定液的极性（反相反相色谱色谱）。）。固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用;目前应用最广的固定相目前应用最广的固定相:化学键合固定相化学键合固定相 2023/8/1912023/8/191、液、液、液、液-液分配色谱液分配色谱液分配色谱液分配色谱 固定固定固定固定10102024/8/5正相色谱与反相色谱比较正相色谱与反相色谱比较正相色谱与反相色谱比较正相色谱与反相色谱比较正相色谱正相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙丙醇醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己己烷烷煤油煤油(最小最小)采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相相的的极极性性或或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2023/8/193.2023/8/193.流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择 在选择流动相时，在选择流动相时，在选择流动相时，在选择流动相时，24242024/8/53-6 3-6 高效高效液相色谱仪器液相色谱仪器2023/8/193-6 2023/8/193-6 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器25252024/8/5液相色谱仪（液相色谱仪（1）2023/8/192023/8/19液相色谱仪（液相色谱仪（液相色谱仪（液相色谱仪（1 1）26262024/8/5液相色谱仪（液相色谱仪（2）2023/8/192023/8/19液相色谱仪（液相色谱仪（液相色谱仪（液相色谱仪（2 2）27272024/8/5流程及主要部件流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.1.流程流程高压输液系统进样系统色谱柱检测系统数据记录及处理系统2023/8/192023/8/19流程及主要部件流程及主要部件流程及主要部件流程及主要部件 process and process and 28282024/8/52.主要部件主要部件(1)高压输液系统（储液器、高压泵、过滤器）高压输液系统（储液器、高压泵、过滤器）高压泵高压泵为为了了获获得得高高柱柱效效，HPLC使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（2000排阻色谱排阻色谱2023/8/193-7 2023/8/193-7 高效液相色谱分离类型选择高效液相色谱分离类型选择高效液相色谱分离类型选择高效液相色谱分离类型选择 ch ch37372024/8/52 2、根据溶解度选择、根据溶解度选择、根据溶解度选择、根据溶解度选择样品溶于水不离解样品溶于水不离解反相色谱反相色谱样品溶于水并能离解样品溶于水并能离解离子交换色谱离子交换色谱样品溶于烃类（苯或异辛烷）样品溶于烃类（苯或异辛烷）液固吸附色谱液固吸附色谱样品溶于甲醇样品溶于甲醇反相色谱反相色谱3 3、根据分子结构选择、根据分子结构选择、根据分子结构选择、根据分子结构选择异构体异构体液固吸附色谱液固吸附色谱同系物同系物正相色谱、反相色谱正相色谱、反相色谱2023/8/1922023/8/192、根据溶解度选择、根据溶解度选择、根据溶解度选择、根据溶解度选择38382024/8/52023/8/192023/8/1939392024/8/53-8 3-8 HPLC的的应用应用 application of HPLC 1.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：示差折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2023/8/193-8 HPLC2023/8/193-8 HPLC的应用的应用的应用的应用 applicaapplica40402024/8/52.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器2023/8/192.2023/8/192.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为稠环芳烃多为稠环芳烃多为稠环芳烃多为41412024/8/53-9 3-9 液相制备色谱液相制备色谱 制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效方法。方法。分析分析HPLC制备制备HPLC目的目的目的目的样品组成信息样品组成信息纯品回收纯品回收通常研究大部分或全部样通常研究大部分或全部样品组分品组分通常只对一种或几种样品通常只对一种或几种样品组分感兴趣组分感兴趣2023/8/193-9 2023/8/193-9 液相制备色谱液相制备色谱液相制备色谱液相制备色谱 制备色谱制备色谱制备色谱制备色谱42422024/8/51.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）分析柱：分析柱：不影响柱效时的最大进样量；制备柱：制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。制备柱允许超载制备柱允许超载（以柱效下降一半或容量因子（以柱效下降一半或容量因子k降低降低10%为宜）为宜）2023/8/191.2023/8/191.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）43432024/8/52.2.液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率使用制备柱，超载提高效率(图图3-28）；）；（2）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离成为主成分（富集）后，再次分离制备。制备。2023/8/192.2023/8/192.液相制备色谱的方法收集组分时，通常有液相制备色谱的方法收集组分时，通常有液相制备色谱的方法收集组分时，通常有液相制备色谱的方法收集组分时，通常有44442024/8/53.3.液相制备色谱仪液相制备色谱仪 液相制备色谱仪液相制备色谱仪：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；检测器后增加馏分收集器。制备柱制备柱：内径2050mm，柱长50cm。2023/8/193.2023/8/193.液相制备色谱仪液相制备色谱仪液相制备色谱仪液相制备色谱仪 液相制备色谱仪液相制备色谱仪液相制备色谱仪液相制备色谱仪4545