微生物-显微镜和显微技术-课件_002

2 2 显微镜和显微技术显微镜和显微技术8/5/20248/5/20241 18/5/20248/5/20242 2借助于借助于显微镜显微镜观察微生物的方法即显微技术，观察微生物的方法即显微技术，显微技术是微生物检验技术中最常用的技术显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。之一。8/5/20248/5/20243 3显微镜的种类和原理显微观察样品的制备8/5/20248/5/20244 4一、显微镜的种类和原理一、显微镜的种类和原理l(一一)、光学显微镜、光学显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜荧光显微镜荧光显微镜 现在的光学显微镜分辨的最小极限达现在的光学显微镜分辨的最小极限达现在的光学显微镜分辨的最小极限达现在的光学显微镜分辨的最小极限达0.20.20.20.2mmmm。8/5/20248/5/20245 5普通光学显微镜的几个基本概念8/5/20248/5/20246 68/5/20248/5/20247 78/5/20248/5/20248 88/5/20248/5/20249 98/5/20248/5/20241010l1 1、普通光学显微镜、普通光学显微镜由三部分构成由三部分构成照明系统：包括光源和聚光器；照明系统：包括光源和聚光器；光学放大系统：由物镜和目镜光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，目镜和组成，是显微镜的主体，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；物镜都由复杂的透镜组构成；机械装置：用于固定材料和观机械装置：用于固定材料和观察方便察方便 8/5/20248/5/20241111油镜使用油镜使用光镜使用方法光镜使用方法 8/5/20248/5/202412122 2、暗视野显微镜、暗视野显微镜原理：原理：聚光镜中央有挡光片，聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而光线进入物镜，因而视野的视野的背景是黑的，物体的边缘是背景是黑的，物体的边缘是亮的。亮的。适用范围：适用范围：生活细菌运动性生活细菌运动性观察。观察。8/5/20248/5/20241313特点特点:只能看到物体的存在只能看到物体的存在与运动与运动,不能辨清其微细结不能辨清其微细结构构。暗视野显微镜的使用暗视野显微镜的使用8/5/20248/5/20241414l l基本原理基本原理:把透过标本的可见光的光程把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。的对比度，使各种结构变得清晰可见。3 3、相差显微镜、相差显微镜相差显微镜使用相差显微镜使用8/5/20248/5/20241515微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜DIC显显微镜下的硅藻形态微镜下的硅藻形态l l适用范围：适用范围：对透明的活体进行直接观察对透明的活体进行直接观察8/5/20248/5/202416164 4、荧光显微镜、荧光显微镜原理：荧光素吸收紫原理：荧光素吸收紫外线并放出部分波长外线并放出部分波长较长的可见光，发荧较长的可见光，发荧光的物体会在黑暗背光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物景显现为光亮有色物体体8/5/20248/5/20241717绿色：铜绿假单胞菌绿色：铜绿假单胞菌 黄色：蜡样芽孢杆菌黄色：蜡样芽孢杆菌绿色：微管绿色：微管红色：微丝红色：微丝蓝色：核蓝色：核8/5/20248/5/20241818l l1931193119311931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。完成的。完成的。完成的。l l用高速电子束代替光束。放大倍数可达用高速电子束代替光束。放大倍数可达用高速电子束代替光束。放大倍数可达用高速电子束代替光束。放大倍数可达80808080万倍，万倍，万倍，万倍，分辨的最小极限达分辨的最小极限达分辨的最小极限达分辨的最小极限达0.20.20.20.2纳米。纳米。纳米。纳米。（二）电子显微镜（二）电子显微镜透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜8/5/20248/5/202419191 1、透射电子显微镜、透射电子显微镜目前目前TEMTEM的分辨力可达的分辨力可达0.2nm0.2nm。用电子束作光源，用电磁场用电子束作光源，用电磁场作透镜。用于电镜的标本须制作透镜。用于电镜的标本须制成厚度约成厚度约50nm50nm左右的超薄切片。左右的超薄切片。放大倍数最高可达近百万倍放大倍数最高可达近百万倍.由由电子照明系统、电磁透镜成像电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、系统、真空系统、记录系统、电源系统等电源系统等5 5部分构成。部分构成。8/5/20248/5/20242020高尔基体的TEM照片(伪彩色)8/5/20248/5/202421218/5/20248/5/202422222 2、扫描电子显微镜、扫描电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜大肠杆菌扫描电镜图大肠杆菌扫描电镜图工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。主要用于：样品表面结构主要用于：样品表面结构8/5/20248/5/20242323扫描扫描电子电子显微显微镜原镜原理理8/5/20248/5/202424248/5/20248/5/202425253 3、扫描隧道显微镜（、扫描隧道显微镜（STMSTM）扫描隧道显微镜拍摄的扫描隧道显微镜拍摄的7 7个铀原子团个铀原子团 8/5/20248/5/202426268/5/20248/5/202427274 4 原子力显微镜原子力显微镜8/5/20248/5/202428288/5/20248/5/20242929特点特点光学显微镜光学显微镜电子显微镜电子显微镜最高放大倍数最高放大倍数约约1000-15001000-15001010万以上万以上最佳分辨率最佳分辨率0.20.2微米微米0.50.5纳米纳米辐射源辐射源可见光可见光电子束电子束辐射源通过的媒介辐射源通过的媒介空气空气高真空高真空透镜类型透镜类型玻璃玻璃电磁体电磁体反差来源反差来源光吸收的差异或特定波长光吸收的差异或特定波长电子散射电子散射聚焦机械聚焦机械机械调节透镜位机械调节透镜位置置调节电磁透镜的流向调节电磁透镜的流向改变放大倍数的方法改变放大倍数的方法调换物镜或目镜调换物镜或目镜调节电磁透镜的流调节电磁透镜的流向向样品承载样品承载载玻片载玻片金属网（通常为铜金属网（通常为铜网）网）光学显微镜和电子显微镜的特点比较光学显微镜和电子显微镜的特点比较8/5/20248/5/20243030（一）光学显微（一）光学显微镜制样镜制样活体观察活体观察染色染色压滴法压滴法悬滴法悬滴法菌丝埋片法菌丝埋片法活菌活菌死菌死菌美蓝染色美蓝染色简单染色简单染色鉴别染色鉴别染色革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色二、显微观察样品二、显微观察样品的制备的制备8/5/20248/5/20243131l l（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖玻片，观察。玻片，观察。l l（2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液，）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液，翻转置于特制的凹载玻片上，观察。翻转置于特制的凹载玻片上，观察。l l（3）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养，板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养，取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。光学显微镜样品制备活体观察光学显微镜样品制备活体观察特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察 8/5/20248/5/20243232 用途：微生物的细致形态和结构用途：微生物的细致形态和结构 染色前需要对染色前需要对样品固定样品固定.常用固定方法：常用固定方法：酒精火焰加热酒精火焰加热、化学固定化学固定光学显微样品制备染色观察光学显微样品制备染色观察8/5/20248/5/20243333l l1)1)、简单染色法：涂片、简单染色法：涂片干燥干燥固定固定染染色色水洗水洗干燥干燥镜检镜检l l2 2）、革兰氏染色法：涂片）、革兰氏染色法：涂片固定固定结晶紫结晶紫色染色色染色水洗水洗碘液媒染碘液媒染水洗水洗酒精脱酒精脱色色番红复染番红复染水洗水洗干燥干燥观察观察8/5/20248/5/20243434（二）、电子显微镜的制样（二）、电子显微镜的制样 样品在进行电镜观察前必须进行固定和干样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，制样时一般燥，制样时一般采用重金属盐染色或喷镀采用重金属盐染色或喷镀，提高在电镜下的反差。提高在电镜下的反差。8/5/20248/5/2024353511、透射电镜的样品制备、透射电镜的样品制备负染技术负染技术投影技术投影技术超薄切片技术超薄切片技术冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术8/5/20248/5/20243636负负 染染 法法将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染法。将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染法。一般是采用电子密度高，本一般是采用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，如磷样品不起反应的物质，如磷钨酸的钠盐将样品包围，同钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会进入观察对象时染色剂还会进入观察对象的内部，这样，既能显示外的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反映形，又可在一定程度上反映样品的内部结构。样品的内部结构。负染法原理负染法原理8/5/20248/5/20243737负染色法观察的鞭毛负染色法观察的鞭毛用途：可以观察用途：可以观察细菌细胞、病毒细菌细胞、病毒等。等。8/5/20248/5/20243838在在真空条件真空条件下，用下，用电子散射能电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品力强的重金属原子来喷镀样品表面表面，这样在样品和没有喷镀，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影了解样品的立体影，根据投影了解样品的立体形状、高度。形状、高度。投投 影影 法法8/5/20248/5/20243939投影法观察的噬菌体投影法观察的噬菌体用途：用途：观察细菌的鞭观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒毛或病毒的颗粒8/5/20248/5/20244040这是最常用的方法，可以观这是最常用的方法，可以观察细胞或其它样品内部的细察细胞或其它样品内部的细微结构。微结构。样品固定样品固定脱水脱水包埋包埋切切片片。只有在只有在2010020100纳米厚度的纳米厚度的切片用透射电子显微镜才能切片用透射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成一个细胞要分割成1010片到片到5050片。片。超超 薄薄 切切 片片 法法超薄切片法观察超薄切片法观察的一种厌氧弧菌的一种厌氧弧菌8/5/20248/5/20244141样品样品-196-196迅速冷冻迅速冷冻加温到加温到-100-100切割样品切割样品升华升华(真空真空)掉断口处的冰掉断口处的冰重金属喷镀断口表面重金属喷镀断口表面电子显微镜观察电子显微镜观察冰冻蚀刻法冰冻蚀刻法8/5/20248/5/20244242冰冻蚀刻法制备的酵冰冻蚀刻法制备的酵母菌内部结构图母菌内部结构图优点优点:可以避免在固定、可以避免在固定、脱水和包埋过程中造脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改成细胞结构的人为改变而形成的假象。变而形成的假象。8/5/20248/5/202443432 2、扫描电镜样品的制备、扫描电镜样品的制备样品先要经过固定、脱水等处理，以免在真样品先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。子，表面要喷涂重金属和碳原子。8/5/20248/5/20244444扫描电子显微镜扫描电子显微镜拍的葡萄球菌的拍的葡萄球菌的表面表面人类血细胞人类血细胞SEM照片照片8/5/20248/5/20244545