流感病毒实验室检测课件

流感监测目的（一）监测流感活动水平和流行动态；（二）及时发现流感病毒变异并作出预警；（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。流感监测目的（一）监测流感活动水平和流行动态；1流感监测内容（一）流感样病例监测（二）流感样病例暴发疫情监测流感监测内容（一）流感样病例监测2流感样病例监测标本采集采集对象：流感样病例流感样病例 发热（体温发热（体温3838），伴咳嗽或咽痛之），伴咳嗽或咽痛之一者一者采集时间：病人发病的头3天内采集采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家哨点医院每周至少采集515份流感样病例的标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时调整）流感样病例监测标本采集采集对象：3暴发疫情标本采集（1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联的死亡病例；（2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内出现流感样病例异常增多。每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当尽量全部采样）。暴发疫情标本采集（1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单4采集标本类型 常规常规特殊特殊咽拭子咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻拭子 鼻洗液痰液 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本采集标本类型常规特殊5采样液常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hanks液或MEM；标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL）采样液常用的采样液有：PH7.4-7.6的Hanks液或6咽拭子采集咽拭子咽拭子 用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。咽拭子采集咽拭子7每日观察细胞病变(CPE)省参比中心的毒株复核鉴定工作（二）流感样病例暴发疫情监测用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。逐步建立流感病毒抗原性、基因特性分析以及耐药性分析能力，相应结果报送至中国疾控中心；CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性有关原始记录应为手写，而非全部打印+签名4）将ViralRNAMinispin柱子取出，将步骤3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去10)无菌眼科剪用70%75酒精消毒鸡胚顶部各实验室毒株在网上送检时需要多点一下送省里（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家哨点医院每周至少采集515份流感样病例的标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时调整）鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去红细胞凝集抑制试验稀释血清2010-2013年度全国网络实验室标本检测结果滴度8的型别鉴定，滴度8核酸鉴定，每周一在系统中反馈结果病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接种，一份（1ml）保存待复核。标本的保存与运送标本采集后应在4条件下，尽快（哨点监测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网络实验室未能送至实验室的，应置-70或以下保存，一周内送实验室冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷藏条件下送到实验室每日观察细胞病变(CPE)标本的保存与运送标本采集后应在48实验室生物安全要求l季节性流感病毒分离鉴定在生物安全级实验室进行。l流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全级实验室的生物安全柜里操作。l用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全级实验室进行实验室生物安全要求季节性流感病毒分离鉴定在生物安全级实验室9标本的接收接收标本时必须核对送检表流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表2）录入到“监测信息系统”标本的接收接收标本时必须核对送检表10标本的处理标本送至实验室后，立即进行处理，未加抗菌素的加入适量的抗菌素。将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测程序实时调整）标本的处理标本送至实验室后，立即进行处理，未加抗菌素的加入适11实验室检测核酸检测病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养胶体金快速检测实验室检测核酸检测12检测流程临床标本采集临床标本采集接种接种MDCK细胞细胞接种鸡胚接种鸡胚红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒红细胞凝集试验红细胞凝集试验寄送国家流感中心寄送国家流感中心流感病毒核酸检测阳性流感病毒核酸检测阳性检测流程临床标本采集接种MDCK细胞接种鸡胚红细胞凝集抑制试13核酸检测核酸提取-QIAamp Viral RNA Mini Kit1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。5）重复步骤4。6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液，13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室温静置13分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即实验或20以下保存。核酸检测核酸提取-QIAampViralRNAMi14荧光定量PCR第一次使用前引物稀释1引物工作浓度（40M）配制方法：（1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10总摩尔数总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的量为9.1nmol，加水量为109.191l）（3）将100M的引物2.5倍稀释，此时浓度为40M，可作为工作浓度。2探针工作浓度（10/20M/）配制方法：（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（3）将100M的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20M，可作为工作浓度。荧光定量PCR第一次使用前引物稀释15荧光定量PCR引物和探针稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；涡旋振荡引物和探针；瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。real-timeRT-PCR的试剂QIAGEN公司 QuantiTectProbeRT-PCRKit，CatNo.204443注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。荧光定量PCR引物和探针16荧光定量PCR反应体系和条件试剂：InvitrogenSuperScriptIIIPlatinumOne-StepQuantitativeKit（公司：Invitrogen，货号：11732-020或11745-100）分子级无菌蒸馏水(无RNA酶和DNA酶)正反向引物(40M)双重标记探针(10M)反应条件：逆转录5030min952min（9515s5530s*）45反应体系为25ul注：*在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）荧光定量PCR反应体系和条件17荧光PCR结果阳性样品荧光PCR结果阳性样品18待鉴定病毒确保没有被细菌污染双重标记探针(10M)当细胞病变为3+或4+时，即75100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融12次，以提高收获标本的病毒滴度。红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。4个凝集单位的配制和检测用70%75酒精消毒鸡胚顶部采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家哨点医院每周至少采集515份流感样病例的标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时调整）或发生2例及以上有流行病学关联的死亡病例；滴度8的型别鉴定，滴度8核酸鉴定，每周一在系统中反馈结果每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。9个（30%）省级CDC建成省级流感参比中心80%网络实验室开展病毒分离省参比中心的毒株复核鉴定工作因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。计算所须的4个凝集单位的病毒用量7）将吸附柱放入一新的2ml套管中，加入500ulAW2液，13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。分子级无菌蒸馏水(无RNA酶和DNA酶)常用的采样液有：PH7.2探针工作浓度（10/20M/）荧光PCR结果阴性样品待鉴定病毒确保没有被细菌污染荧光PCR结果阴性样品19荧光PCR结果可疑样品荧光PCR结果可疑样品20病毒分离-MDCK细胞标本接种标本接种MDCKMDCK细胞细胞每日观察细胞病变每日观察细胞病变(CPE)(CPE)MDCKMDCK细胞收获细胞收获3335培养病毒分离-MDCK细胞标本接种MDCK细胞每日观察细胞病变(21接种流程清洗MDCK细胞临床采样标本接种细胞Hanks液清洗细胞，一般清洗2遍3335度吸附12小时Hanks液清洗细胞加入病毒生长液，3335度培养箱培养24小时后，观察细胞病变。当细胞病变为3+或4+时，即75100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融12次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于第7天收获（细胞病变情况：细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）根据使用的细胞瓶的大小，决定接种量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临床标本流程图接种流程清洗MDCK细胞临床采样标本接种细胞Hanks液22MDCK细胞病毒分离lCPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性有关l每日观察细胞病变(CPE)l标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA试验阴性者，继续盲传12代后，HA试验仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴性，标本可弃去 MDCK细胞病毒分离CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差23细胞病变图细胞病变图24鸡胚病毒分离标本接种于标本接种于9 9日龄鸡胚日龄鸡胚33333535培养培养7272小小时时检卵标本准备鸡胚病毒分离标本接种于9日龄鸡胚3335培养72小时检25流感病毒实验室检测课件26鸡胚分离方法-试剂准备1)1)9 91111日龄鸡胚日龄鸡胚2)2)照蛋灯照蛋灯3)70%3)70%7575酒精酒精4)1ml 4)1ml 一次性注射器一次性注射器5)5)鸡蛋开孔器鸡蛋开孔器6)6)无菌胶布或蜡无菌胶布或蜡7)10ml 7)10ml 试管和试管架试管和试管架8)10ml 8)10ml 移液管或移液管或1ml1ml移液器及无菌吸尖移液器及无菌吸尖9)9)无菌镊子无菌镊子10)10)无菌眼科剪无菌眼科剪鸡胚分离方法-试剂准备1)911日龄鸡胚27鸡胚分离方法-标记鸡胚检视标记鸡胚 用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉鸡胚分离方法-标记鸡胚检视标记鸡胚28正反向引物(40M)待鉴定病毒确保没有被细菌污染系统自动生产的送检单，省里和国家均送检待鉴定病毒确保没有被细菌污染双腔接种灯下接种1)911日龄鸡胚经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去7份BY和H3N2混合型（二）及时发现流感病毒变异并作出预警；10)无菌眼科剪荧光PCR结果阳性样品流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表2）录入到“监测信息系统”用70%75酒精消毒鸡胚顶部加入病毒生长液，3335度培养箱培养用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。滴度8的型别鉴定，滴度8核酸鉴定，每周一在系统中反馈结果4）将ViralRNAMinispin柱子取出，将步骤3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全级实验室进行常用的采样液有：PH7.3335oC温箱培养鸡胚23天。稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确（3）将100M的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20M，可作为工作浓度。红细胞凝集抑制试验稀释血清用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全级实验室进行（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。接种病毒方法用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。14家网络实验室结果全部正确省级流感参比中心工作要求开窗接种用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。1引物工作浓度（40M）待鉴定病毒确保没有被细菌污染每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。用70%75酒精消毒鸡胚顶部羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并双重标记探针(10M)有一地市为非正式的报告单，报告人未签名，报告处未盖章加入配制好的红细胞悬液当细胞病变为3+或4+时，即75100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融12次，以提高收获标本的病毒滴度。2探针工作浓度（10/20M/）接种病毒方法接种病毒方法单腔接种 盲种双腔接种 灯下接种 开窗接种鸡胚分离方法鸡胚分离方法正反向引物(40M)稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确29鸡胚分离流程（1）将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样本接种3个鸡胚 用70%75酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10 x6mm窗口 用注射器吸200l处理过的临床标本，装上16 号针头 从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100l标本。将针头退出至 寸，将另外100 l标本 注入鸡胚尿囊腔鸡胚分离流程（1）将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，30鸡胚分离流程（2）用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚将针头弃于合适的生物安全装置中用消毒过的医用胶布封口 3335oC 温箱培养鸡胚23 天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去鸡胚分离流程（2）用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另31鸡胚分离流程（3）收获尿囊液和羊水收获尿囊液和羊水鸡胚在收获前应4过夜或至少放置4小时标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致用70%75酒精消毒鸡胚顶部用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并鸡胚分离流程（3）收获尿囊液和羊水32鸡胚病毒鉴定l经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去鸡胚收获HA试验鸡胚病毒鉴定鸡胚收获HA试验33病毒鉴定红细胞凝集红细胞凝集抑制试验病毒鉴定红细胞凝集34病毒鉴定流程红细胞凝集试验4个凝集单位配制“回滴”红细胞凝集抑制试验判定流感病毒型别病毒鉴定流程红细胞凝集试验4个凝集单位配制“回滴”红细胞凝集35红细胞凝集试验（HA）lMDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度l 原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现结合后，可以抑制凝集现象出现红细胞凝集试验（HA）36红细胞胞鸡火火鸡豚鼠豚鼠人人 O型型 血血 红细胞胞马适用范围流感和禽流感病毒流感和禽流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒终浓度（）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形状U或V型U或V型U型U型U型孵育时间30min30min45min45min60min细胞对照细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成环状细胞沉积成环状细胞沉积成环状红细胞鸡火鸡豚鼠人O型血红细胞马适用范围流感和禽流感病毒流感37AHBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀释完病毒液后加入稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液红细胞悬液50ulPBS稀释病毒加入配制好的红细胞悬液充分混匀，置室温孵育30-60分钟观察记录结果AHBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul5038病毒病毒原液原液1：21：128HA：32HA128 HA：4病毒1：21：128HA：32HA128HA：39红细胞凝集试验（HA）lHA滴度8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；HA滴度8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴度8后，再进行HI测定l若传12代后，HA滴度仍8者，可应用核酸检测方法进行鉴定红细胞凝集试验（HA）HA滴度8，进行红细胞凝集抑制（HI40红细胞凝集抑制（HI）试验 HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。红细胞凝集抑制（HI）试验HA试验完成后，用国家流感中心每41红细胞凝集抑制试验步骤4个凝集单位的配制和检测稀释血清加入25ul4个血凝单位抗原，室温孵育15-30分钟每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。室温孵育30-60分钟观察记录结果红细胞凝集抑制试验步骤4个凝集单位的配制和检测424个凝集单位的配制和检测4个凝集单位的配制读取红细胞凝集试验的结果计算所须的4个凝集单位的病毒用量用50ul检测4个凝集单位时，用凝集效价除以8，所得商即为4个单位的稀释度用红细胞凝集试验“回滴”，复核4个凝集单位用50ul，前4孔完全凝集。此时的抗原即为4个凝集单位4个凝集单位的配制和检测4个凝集单位的配制43原始记录空白项、涂改项50%省CDC建成省级流感参比中心，70%网络实验室开展病毒分离3)70%75酒精1nmol，加水量为109.CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性有关9个（30%）省级CDC建成省级流感参比中心80%网络实验室开展病毒分离盲种CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性有关（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。发热（体温38），伴咳嗽或咽痛之一者流感监测网络实验室的工作人员在完成病毒分离后，24小时内将病毒分离结果录入“监测信息系统”中的“病毒分离、鉴定结果登记一览表”中。用70%75酒精消毒鸡胚顶部将针头弃于合适的生物安全装置中7份BY和H3N2混合型用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。10)无菌眼科剪（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。2010-2013年度全国网络实验室盲样考核情况6的Hanks液或MEM；6)无菌胶布或蜡序列数据提交全国流感监测网络基因序列共享数据库。用70%75酒精消毒鸡胚顶部红细胞凝集抑制试验稀释血清红细胞凝集抑制试验稀释血清12765349810H1血清50ulH3血清50ul50ulPBSB血清50ul25ulPBS25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ulB血清50ulH3血清50ulH1血清50ul原始记录空白项、涂改项红细胞凝集抑制试验稀释血清12765344流感病毒的型别判定标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价20才可以算为阳性 一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判定为此型别的流感病毒流感病毒的型别判定标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价20才45红细胞凝集抑制试验-质量控制使用的试剂可靠无误处理后的血清有无残余非特异性凝集素读取HA试验的结果是否正确4个血凝单位是否准确红细胞阴性对照待鉴定病毒确保没有被细菌污染稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确红细胞凝集抑制试验-质量控制使用的试剂可靠无误46结果录入 流感监测网络实验室的工作人员在完成病毒分离后，24小时内将病毒分离结果录入“监测信息系统”中的“病毒分离、鉴定结果登记一览表”中。结果录入流感监测网络实验室的工作人员在完成病毒分离后，247毒株的送检系统自动生产的送检单，省里和国家均送检时限要求包装要求毒株的送检系统自动生产的送检单，省里和国家均送检482012年底年底50%省省CDC建成建成省省级流感参比流感参比中心，中心，70%网网络实验室开展室开展病毒分离病毒分离90%省省CDC建成省建成省级流流感参比中心，感参比中心，90%网网络实验室开展病室开展病毒分离毒分离2015年底年底省级参比中心开始启动9个（30%）省级CDC建成省级流感参比中心80%网络实验室开展病毒分离2012年底50%省CDC建成省级流感参比中心，70%网络492009-2013年度全国网络实验室工作开展情况年度全国网络实验室工作开展情况621199199132481511129710112327681350040030020010002009年年4月份前月份前2009-2010年度年度2010-2011年度年度2011-2012年度年度2012-2013年度年度网网络实验络实验室（家）室（家）开展病毒分离的Lab仅开展核酸检测的Lab未开展工作的Lab80.1%2009-2013年度全国网络实验室工作开展情况80.1%50网网络络实实验验室室数数（家家）正正确确率率（%）2010年年2011年年2012年年2013年年0100200300400500707580859095100未参与考核的家数考核结果有误的lab考核结果全部正确的lab全部正确率（%）2010-2013年度全国网络实验室盲样考核情况年度全国网络实验室盲样考核情况97.5%93.2%96.0%2010-2013年度全国网络实验室盲样考核情况97.5%9512010-2013年度全国网络实验室标本检测结果年度全国网络实验室标本检测结果标标本本数数（份份）2010-2011年度2011-2012年度2012-2013年度40000300002000010000032600286792785230120280372723947381263212728阳性的阳性的标标本数本数进进行行亚亚型型鉴鉴定的定的标标本数本数分离毒株数分离毒株数2010-2013年度全国网络实验室标本检测结果52省级流感参比中心工作要求省级流感参比中心工作要求至少每月至少每月编撰撰1次次监测数据分析数据分析报告，在疫情流告，在疫情流行期每周行期每周编撰撰1次次监测数据分析数据分析报告告，并上，并上报。定期培定期培训和和现场指指导相相结合；合；每年每年组织对本省至少本省至少30%的流感的流感监测网网络实验室及哨点医院室及哨点医院进行督行督导检查，督，督导报告上告上报备案。案。监测数据分析数据分析中国疾控中心每年中国疾控中心每年对省省级流感参比中心流感参比中心和和抽抽查的的1-2家网家网络实验室室进行流感盲行流感盲样标本考核本考核；省省级流感参比中心每年考核本流感参比中心每年考核本辖区内所有网区内所有网络实验室；室；每年每年组织对辖区内的流感区内的流感监测网网络成成员单位位进行行质量量评估估培培训和督和督导考核和考核和评估估省级流感参比中心工作要求监测数据分析至少每月编撰1次监测53省级流感参比中心工作要求省级流感参比中心工作要求4年内，使本省所有流感网年内，使本省所有流感网络实验室均具室均具备有病毒分离有病毒分离能力；能力；本省至少有本省至少有2/3的网的网络实验室每年送国家流感中心的毒室每年送国家流感中心的毒株数不少于株数不少于30株。株。逐步建立流感病毒抗原性、基因特性分析以及耐逐步建立流感病毒抗原性、基因特性分析以及耐药性分性分析能力，相析能力，相应结果果报送至中国疾控中心；送至中国疾控中心；序列数据提交全国流感序列数据提交全国流感监测网网络基因序列共享数据基因序列共享数据库。实验室室监测负责对本本辖区内网区内网络实验室季室季节性流感毒株在性流感毒株在10个工作个工作日内日内进行复核行复核鉴定定；对HA（血凝）滴度（血凝）滴度8的毒株利用的毒株利用HI方法方法进行复核行复核鉴定定；对HA8的毒株的毒株进行核酸分型行核酸分型/亚型型鉴定定；每周一每周一反反馈上周复核上周复核结果。果。实验室室监测实验室室监测省级流感参比中心工作要求实验室监测4年内，使本省所有流感54参比中心近期要求参比中心近期要求成为参比中心4年内，所有流感网络实验室均具备病毒分离能力，并上送毒株省参比中心的毒株复核鉴定工作各实验室毒株在网上送检时需要多点一下送省里毒株国家流感中心省CDC10个工作日内完成复核鉴定滴度8的型别鉴定，滴度8核酸鉴定，每周一在系统中反馈结果参比中心近期要求成为参比中心4年内，所有流感网络实验室均具备55质控考核-考核标本考核标本制备：14份H1N1，14份H3N2，14份 BV，10份H5N1，7份H7N9，10份阴性7份BY和H3N2混合型4份H1N1，H3N2，BY混合型每个地市随机抽取5份标本质控考核-考核标本考核标本制备：56质控考核-新的要求增加混合型B型要求分系考虑到运输问题，均为强阳性质控考核-新的要求增加混合型57质控考核-结果14家网络实验室结果全部正确一些问题：原始记录应为手写，而非全部打印原始记录应为手写，而非全部打印+签名签名原始记录空白项、涂改项原始记录空白项、涂改项有一地市为非正式的报告单，报告人未签有一地市为非正式的报告单，报告人未签名，报告处未盖章名，报告处未盖章质控考核-结果14家网络实验室结果全部正确58祝各位代表工作顺利、生活愉快！祝各位代表59