Lec19-RNA-Metabolism-st

RNA分子RNARNA是由是由DNADNA模板转录模板转录而来的而来的RNARNA以以单链单链起作用，这些起作用，这些RNARNA链本身的回折，很多结构变化链本身的回折，很多结构变化RNARNA是已知唯一在遗传信息的是已知唯一在遗传信息的储存、转移和催化储存、转移和催化过程中同时起过程中同时起作用的大分子作用的大分子具有催化作用的具有催化作用的RNARNA核酶核酶改变了酶的定义改变了酶的定义核酸都与蛋白质形成复合物核酸都与蛋白质形成复合物信使信使RNA(mRNA):RNA(mRNA):编码一个或一组基因指定的一个或多个多编码一个或一组基因指定的一个或多个多肽上的氨基酸顺序肽上的氨基酸顺序转移转移RNA(tRNA):RNA(tRNA):读取读取mRNAmRNA中的编码信息，运输合适的氨基中的编码信息，运输合适的氨基酸至增长的多肽链酸至增长的多肽链核糖体核糖体RNA(rRNA):RNA(rRNA):核糖体的组成成分，合成蛋白质。核糖体的组成成分，合成蛋白质。1第1页/共48页依赖DNA的RNA合成由由RNARNA聚合酶合成聚合酶合成RNARNA一条一条DNADNA模板模板4 4种核苷种核苷5-5-三磷酸和三磷酸和MgMg2+2+合成方向合成方向553 3 碱基配对碱基配对不需要引物去起始不需要引物去起始RNARNA合成合成开始：开始：RNARNA聚合酶结合聚合酶结合启动子启动子的特殊的特殊DNADNA序列序列2第2页/共48页依赖DNA的RNA合成转录泡转录泡DNADNA双螺旋解开一段双螺旋解开一段链，链，17 bp17 bp杂合的杂合的DNA-RNADNA-RNA双螺双螺旋，旋，8 bp8 bpE.Coli:50-90 E.Coli:50-90 nt/snt/s转录前是正超螺旋转录前是正超螺旋转录后形成负超螺旋转录后形成负超螺旋3第3页/共48页依赖DNA的RNA合成模板链：作为模板用于模板链：作为模板用于RNARNA合成的链合成的链非模板链（编码链）：与模板互补的链非模板链（编码链）：与模板互补的链4不对称转录不对称转录第4页/共48页RNA合成起始于启动子5启动子：启动子：特定序列，用来指导特定序列，用来指导DNADNA基因中邻近片段的转录基因中邻近片段的转录RNARNA聚合酶结合到转录起始点之前聚合酶结合到转录起始点之前70bp70bp到转录起始点后到转录起始点后30bp30bpRNARNA分子起始部位的分子起始部位的DNADNA碱基对为正值，之前为负值碱基对为正值，之前为负值-10-10区和区和-35-35区，短序列很相似区，短序列很相似UPUP元件：富含元件：富含ATAT亚基的结合部位亚基的结合部位第5页/共48页RNA合成起始于启动子RNARNA聚合酶结合到启动子上并引发转录的效率在很大程度上取聚合酶结合到启动子上并引发转录的效率在很大程度上取决于这些序列、序列间的间隔和它们与转录起始点的距离决于这些序列、序列间的间隔和它们与转录起始点的距离-35-35区和区和-10-10区区的重要性的重要性影响启动子功能的突变常常涉及这些区域中的一个碱基对影响启动子功能的突变常常涉及这些区域中的一个碱基对共有序列的改变影响着共有序列的改变影响着RNARNA聚合酶的结合与转录起始的效率聚合酶的结合与转录起始的效率仅仅对仅仅对一个碱基对一个碱基对的改变会使结合速率慢几个数量级的改变会使结合速率慢几个数量级启动子序列建立了特定大肠杆菌基因表达的基础水平，随基启动子序列建立了特定大肠杆菌基因表达的基础水平，随基因的不同会有很大差别因的不同会有很大差别6第6页/共48页转录的起始结合阶段结合阶段聚合酶结合到启动子上，形成一个闭合聚合酶结合到启动子上，形成一个闭合的复合体的复合体1215bp1215bp松开，形成一个开放的复合体松开，形成一个开放的复合体起始阶段起始阶段转录开始转录开始启动子出空启动子出空一旦一旦89nt89nt聚合形成新的聚合形成新的RNARNA，亚基就亚基就被释放，聚合酶就离开启动子催化被释放，聚合酶就离开启动子催化RNARNA的的延长延长7第7页/共48页RNA合成的终止RNARNA合成是合成是持续的持续的E.ColiE.Coli的转录终止信号：的转录终止信号：不依赖不依赖因子，简单终止因子，简单终止形成发夹结构的自我互补序列形成发夹结构的自我互补序列RNARNA的的33末端形成一段末端形成一段U U依赖依赖蛋白因子蛋白因子终止子没有重复的终止子没有重复的U U序列，有时也会有序列，有时也会有一小段可形成发夹结构的序列一小段可形成发夹结构的序列蛋白在特定位点结合蛋白在特定位点结合RNARNA，按，按553 3 方向，追上方向，追上RNARNA聚合酶聚合酶蛋白具有依赖蛋白具有依赖ATPATP的的RNA-DNARNA-DNA解链酶解链酶的活性，释放的活性，释放RNARNA8第8页/共48页真核细胞的RNA聚合酶真核生物有三种真核生物有三种RNARNA聚合酶，有各自的功能，并与特定的启动聚合酶，有各自的功能，并与特定的启动子序列相结合子序列相结合RNARNA聚合酶聚合酶I I（Pol IPol I）：）：只只 与前核糖体与前核糖体RNARNA的合成有关，包含的合成有关，包含了了18S18S、5.8S5.8S和和28S28S的的rRNArRNARNARNA聚合酶聚合酶IIII（Pol IIPol II）：）：主要合成主要合成mRNAmRNA和某些特殊的和某些特殊的RNARNA。能识别成千上万种启动子，有几个共同序列，能识别成千上万种启动子，有几个共同序列，TATATATA盒，盒，InrInrRNARNA聚合酶聚合酶IIIIII（Pol IIIPol III）：）：合成合成tRNAtRNA，5S rRNA5S rRNA以及一些特以及一些特殊的小殊的小RNARNA9第9页/共48页转录与复制的相似和区别都以都以DNADNA为模板为模板需要核苷酸作原料，从需要核苷酸作原料，从5 5到到3 3延长；生成磷酸二酯键以连延长；生成磷酸二酯键以连接核苷酸接核苷酸都遵从碱基配对规律都遵从碱基配对规律都需要依赖都需要依赖DNADNA的聚合酶的聚合酶产物都是很长的多核苷酸产物都是很长的多核苷酸第10页/共48页RNA的加工过程11新合成的新合成的RNARNA分子分子初始转录本初始转录本真核真核mRNAmRNA和细菌及真核和细菌及真核tRNAtRNA的初始转录本都要进一步加工的初始转录本都要进一步加工mRNAmRNA的加工的加工剪接过程剪接过程除去内含子除去内含子连接外显子连接外显子两端都要被修饰两端都要被修饰55帽帽33尾巴尾巴:多聚多聚A A非编码片段非编码片段内含子内含子编码片段编码片段外显子外显子第11页/共48页RNA的加工过程原核和真核生物原核和真核生物tRNAtRNA的初始转录本加工：的初始转录本加工：1.1.切除两端多余的序列切除两端多余的序列2.2.少数情况下还进行除去内含子的剪接少数情况下还进行除去内含子的剪接3.3.分子中的许多碱基和糖基被修饰分子中的许多碱基和糖基被修饰任何任何RNARNA的最终命运都是彻底的降解的最终命运都是彻底的降解RNARNA的转换速率对决定其状态稳定的程度起关键作用的转换速率对决定其状态稳定的程度起关键作用转换速率也决定着细胞何时来关闭那些不再需要产物的基因转换速率也决定着细胞何时来关闭那些不再需要产物的基因12第12页/共48页内含子的剪接细菌中，一条多肽有一段细菌中，一条多肽有一段DNADNA编码，连续对应，不中断编码，连续对应，不中断真核生物，真核生物，编码基因被非编码基因分割编码基因被非编码基因分割内含子与基因的其他部分一起被内含子与基因的其他部分一起被RNARNA聚合酶转录，然后切除内聚合酶转录，然后切除内含子，外显子连接为成熟的功能性含子，外显子连接为成熟的功能性RNARNA13外显子：外显子：400nt400nt，锤头状核酶，锤头状核酶41nt41nt三级结构对其功能非常重要三级结构对其功能非常重要27催化所需的最小序列催化所需的最小序列磷酸二酯键的水解反应磷酸二酯键的水解反应第27页/共48页I型内含子四膜虫四膜虫26 S rRNA26 S rRNA前体前体的自我剪接的自我剪接I I型内含子型内含子的二级结构的二级结构阴影：催化核心阴影：催化核心绿色：外显子绿色：外显子黄色：内含子黄色：内含子红色箭头：红色箭头：55剪接位剪接位点点蓝色箭头：蓝色箭头：33剪接位剪接位点点28第28页/共48页29414nt丢失丢失5端的端的19nt395nt的线状的线状RNAL-19间插序列间插序列(IVS)L-19 IVS 催化核苷酸转催化核苷酸转移反应移反应使一些寡聚核苷酸延使一些寡聚核苷酸延长了，另一些缩短了长了，另一些缩短了循环的转酯反应循环的转酯反应100个底物个底物/hr比蛋白酶低，但是比比蛋白酶低，但是比非催化反应高非催化反应高1010与蛋白酶一样具有底与蛋白酶一样具有底物诱导、共价催化和物诱导、共价催化和金属离子催化等作用金属离子催化等作用第29页/共48页mRNA的降解基因表达的调控手段之一：基因表达的调控手段之一：该基因的转录产物该基因的转录产物mRNAmRNA的浓度的浓度合成速度和降解速度合成速度和降解速度降解途径确保降解途径确保mRNAmRNA不会在细胞内无意义累积不会在细胞内无意义累积暂时需要的基因产物，暂时需要的基因产物，mRNAmRNA半衰期半衰期 几分钟甚至几秒种几分钟甚至几秒种总是需要的基因产物，总是需要的基因产物，mRNAmRNA保持稳定水平保持稳定水平哺乳动物：平均半衰期哺乳动物：平均半衰期3h3h，每一代细胞，每一代细胞mRNAmRNA更新更新1010次左右次左右细菌：半衰期细菌：半衰期1.5min1.5min降解降解5 5 33，33端带有一段抑制核酸外切酶的序列端带有一段抑制核酸外切酶的序列 (,polyA)polyA)真核细胞：真核细胞：缩短缩短polyApolyA尾巴的长度、尾巴的长度、5 5 端脱帽、端脱帽、5 5 33降解降解30第30页/共48页依赖RNA的RNA合成和DNA合成大多数大多数RNARNA指导的聚合酶来源于指导的聚合酶来源于RNARNA病毒病毒RNARNA复制的发现对中心法则进行了补充复制的发现对中心法则进行了补充31涉及到的酶在重组涉及到的酶在重组DNADNA技术中十技术中十分有用分有用对研究可能存在的前生物期的对研究可能存在的前生物期的自我复制分子的性质具有深远自我复制分子的性质具有深远的意义的意义第31页/共48页反转录酶催化由病毒RNA产生DNAssRNAssRNA病毒基因组和反转录病毒基因组和反转录酶进入宿主细胞酶进入宿主细胞催化合成一条互补催化合成一条互补DNADNA链链降解降解RNA-DNARNA-DNA中的中的RNARNA，并以，并以DNADNA链取代链取代dsDNAdsDNA整合到真核宿主细胞整合到真核宿主细胞基因组中，类似转座子基因组中，类似转座子19621962年，年，Howard TeminHoward Temin预言预言RNARNA病毒中存在反转录酶病毒中存在反转录酶19701970年，年，TeminTemin和和David David BaltimoreBaltimore各自独立检测到这些各自独立检测到这些酶酶证实遗传信息从证实遗传信息从RNARNA回流到回流到DNADNA32反转录病毒反转录病毒第32页/共48页典型的反转录病毒三个基因：三个基因：gaggag、polpol、envenvgaggag和和polpol长的多蛋白质，长的多蛋白质，酶切后产生酶切后产生6 6个功能蛋白质个功能蛋白质gag gag 编码蛋白质组成病毒编码蛋白质组成病毒颗粒的内核颗粒的内核polpol编码能降解这个长多肽编码能降解这个长多肽的蛋白酶、整合酶和反转的蛋白酶、整合酶和反转录酶录酶envenv编码病毒的外壳蛋白编码病毒的外壳蛋白长末端重复序列长末端重复序列(LTR)(LTR)：促：促使病毒整合，提供启动子使病毒整合，提供启动子33第33页/共48页反转录酶催化催化3 3种不同的反应，分别来自酶的不同活性部位种不同的反应，分别来自酶的不同活性部位RNARNA依赖的依赖的DNADNA合成合成RNARNA降解降解DNADNA依赖的依赖的DNADNA合成合成启动启动DNADNA合成的引物：病毒颗粒带有的前一次感染中获得的宿合成的引物：病毒颗粒带有的前一次感染中获得的宿主细胞的主细胞的tRNAtRNA延伸方向：延伸方向：5 5 33类似类似RNARNA聚合酶，也不具有聚合酶，也不具有3 3 55外切核酸酶的校正活性外切核酸酶的校正活性错误率：错误率：1/20 000nt1/20 000nt，不同于正常，不同于正常DNADNA复制复制实验上，以实验上，以RNARNA为模板合成互补为模板合成互补DNADNA34第34页/共48页病毒反转录酶引起癌症和艾滋病大多数病毒反转录酶不能杀伤宿主细胞，但能整合于细胞内大多数病毒反转录酶不能杀伤宿主细胞，但能整合于细胞内的的DNADNA，刺激细胞分裂，刺激细胞分裂人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)(HIV)会引起获得性免疫缺陷综合症会引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS)(AIDS)HIVHIV是反转录病毒，会杀伤许多受感染细胞是反转录病毒，会杀伤许多受感染细胞(T(T淋巴细胞淋巴细胞)而引起肿瘤而引起肿瘤HIVHIV反转录酶的错误率比其他已知的反转录酶高反转录酶的错误率比其他已知的反转录酶高1010倍多，倍多，高突变率高突变率35Rous肉瘤病毒基因肉瘤病毒基因致癌基因高水平表达致癌基因高水平表达促进细胞不规则分裂并导致癌症促进细胞不规则分裂并导致癌症Src编码一种酪氨酸特异性蛋白激酶编码一种酪氨酸特异性蛋白激酶影响细胞分裂、细胞间相互作用和通讯影响细胞分裂、细胞间相互作用和通讯除反转录病毒基因外，除反转录病毒基因外，HIV还包含具还包含具有多种功能的几个小基因有多种功能的几个小基因第35页/共48页真核生物的DNA转座子具有与反转录病毒相似的结构，有时也称具有与反转录病毒相似的结构，有时也称反转座子反转座子反转座子缺少一个反转座子缺少一个envenv基因，不能形成病毒颗粒基因，不能形成病毒颗粒从一个位置转移到另一个位置是从一个位置转移到另一个位置是依靠依靠RNARNA做媒介做媒介，可能通过反，可能通过反转录酶合成转录酶合成RNARNA的的DNADNA拷贝，接着拷贝，接着DNADNA的整合的整合不同于细菌的转座子不同于细菌的转座子反转录酶是一种多细胞生物演化之前出现的古老的酶反转录酶是一种多细胞生物演化之前出现的古老的酶36Ty因子（酵母）因子（酵母）Copia因子（果蝇属）因子（果蝇属）第36页/共48页I型和II型内含子的反转录除自我剪接活性外，还编码促进其转移的除自我剪接活性外，还编码促进其转移的DNADNA内切核酸酶内切核酸酶内切核酸酶在一个内切核酸酶在一个寻靶寻靶的过程中促进内含子插入到另一个不的过程中促进内含子插入到另一个不包含该内含子的同源基因拷贝的同一位点包含该内含子的同源基因拷贝的同一位点37寻靶内切核酸酶的产生寻靶内切核酸酶的产生寻靶内切核酸酶寻靶内切核酸酶初级转录本初级转录本剪接的剪接的I型内含子型内含子第37页/共48页I型和II型内含子的反转录I I型内含子型内含子寻靶寻靶是通过是通过DNADNA介导介导的的38寻靶寻靶核酸内切酶切开核酸内切酶切开b上对应上对应于于a内含子的位点内含子的位点双链断裂修复双链断裂修复b中产生该内含子中产生该内含子的新拷贝的新拷贝第38页/共48页I型和II型内含子的反转录IIII型内含子型内含子寻靶寻靶是通过是通过RNARNA介导介导的的内切核酸酶与反转录酶活性内切核酸酶与反转录酶活性相缔合相缔合RNARNA内含子插入内含子插入DNADNA内含子的逆转录内含子的逆转录随时间的推移，一个种群中随时间的推移，一个种群中特定基因的每一个拷贝都可特定基因的每一个拷贝都可能得到这种内含子能得到这种内含子39反寻靶反寻靶第39页/共48页端粒酶特化的反转录酶端粒端粒线性染色体的端位结构，许线性染色体的端位结构，许多重复的短寡核苷酸序列多重复的短寡核苷酸序列一条一条T Tx xG Gy y链和互补的链和互补的C Cy yA Ax x链链(x,y1-(x,y1-4)4)TGTG链比互补链长，链比互补链长，33端具有一段长端具有一段长达几百个达几百个ntnt的单链的单链DNADNA端粒酶：端粒酶：RNARNA和蛋白质和蛋白质RNA150ntRNA150nt，包含，包含1.51.5拷贝的拷贝的C Cy yA Ax x重复重复序列，端粒合成模板序列，端粒合成模板染色体染色体33端作为引物端作为引物553 3 方向进行方向进行40聚合及聚合及杂交杂交转位及转位及重杂交重杂交进一步聚合进一步聚合第40页/共48页RNA世界假说1960s1960s，Carl Woese,Francis CrickCarl Woese,Francis Crick和和Leslie OrgelLeslie Orgel提出大提出大分子分子RNARNA可能充当了信息载体和催化剂两种角色可能充当了信息载体和催化剂两种角色RNARNA世界可能在从世界可能在从“前生命化学前生命化学”过渡到生命的过程中起重要过渡到生命的过程中起重要作用作用米勒模拟实验：米勒模拟实验：产生了产生了0.5%0.5%的腺嘌呤的腺嘌呤腺嘌呤被认为是出现在地球上的第一种腺嘌呤被认为是出现在地球上的第一种 也是数量最丰富的一种核苷酸组成成分也是数量最丰富的一种核苷酸组成成分虽然腺苷在辅因子中没有起直接作用，但大部分的辅因子都以腺苷作虽然腺苷在辅因子中没有起直接作用，但大部分的辅因子都以腺苷作为他们的结构组分为他们的结构组分RNARNA世界假说要求核苷酸聚合体自身繁殖世界假说要求核苷酸聚合体自身繁殖41第41页/共48页42四膜虫的自剪接四膜虫的自剪接rRNA内含内含子可催化一个鸟苷酸残基子可催化一个鸟苷酸残基对对5剪接点的可逆攻击剪接点的可逆攻击由由RNA模板来决定产物的模板来决定产物的排列顺序，从短链排列顺序，从短链RNA变变为长链为长链RNA聚合体聚合体第42页/共48页RNA到底是不是生命的起源呢？到底是不是生命的起源呢？支持支持RNARNA为生命起源假说的证据：为生命起源假说的证据：如果我们能找到完全或者主要依赖如果我们能找到完全或者主要依赖RNARNA进行生命活动的生进行生命活动的生物；物；如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能性性RNARNA的的“痕迹痕迹”；如果我们能够从随机如果我们能够从随机RNARNA序列库中筛选到能够完成基本生序列库中筛选到能够完成基本生命活动的命活动的RNARNA序列。序列。RNA世界假说第43页/共48页RNA Recognizes Other Molecules1、Tuerk,.C.;Gold,L.Science 1990,249,505-10;2、Ellington,A.D.;Szostak,J.W.Nature 1990,346,818-223、Robertson,D.L.&Joyce,G.F.1990，Nature 344,467468第44页/共48页RNA世界假说建立新方法，快速搜寻建立新方法，快速搜寻RNARNA库中具有异常活性的库中具有异常活性的RNARNASELEX(Systematic evolution of ligands by exponential SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)enrichment)45核酸适配体核酸适配体(aptamer)(aptamer)指数富集配体系统进化方法指数富集配体系统进化方法第45页/共48页Aptamers:Designer DNA/RNA Probes“Aptus”meaning“to fit”Oligonucleotides which bind to target molecules with high affinity and specificityDNA/RNA探针，与目标分子的结合有很高的亲和力、特异性核酸适体：Aptamer:核酸适体从人工合成的从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶标分子结文库中筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。合的单链寡核苷酸。第46页/共48页本章小结依赖依赖DNADNA的的RNARNA合成合成转录转录RNARNA的加工的加工内含子的剪接内含子的剪接真核真核mRNAmRNA的两端修饰的两端修饰tRNAtRNA和和rRNArRNA的加工的加工核酶核酶依赖依赖RNARNA的的RNARNA合成和合成和DNADNA合成合成反转录病毒反转录病毒真核真核DNADNA转座子转座子I I、IIII型的内含子型的内含子端粒酶端粒酶47第47页/共48页TermsTranscription Transcription Messenger RNA(mRNA)Messenger RNA(mRNA)Transfer RNA(tRNA)Ribosomal RNA Transfer RNA(tRNA)Ribosomal RNA(rRNA)(rRNA)Promoter Promoter Consensus sequenceConsensus sequenceRibozymes Primary Ribozymes Primary transcripttranscriptRNA splicing RNA splicing SpliceosomeSpliceosomeReverse transcription Reverse Reverse transcription Reverse transcriptasetranscriptaseRetrovirus Retrovirus Complementary DNA(cDNA)Complementary DNA(cDNA)Telomerase AptamerTelomerase Aptamer48第48页/共48页