核酸类药物分析课件

核酸类药物分析核酸类药物分析第一节第一节概概述述第二节分析方法第二节分析方法第三节应用实例第三节应用实例核酸类药物分析第一节 概 述第一节第一节概概述述一、结构与分类一、结构与分类核酸类药物可以通核酸类药物可以通过帮助恢复正常代谢或干扰某些异常代过帮助恢复正常代谢或干扰某些异常代谢谢来达到治疗疾病的目的。来达到治疗疾病的目的。核酸是由核酸是由多个单核苷酸多个单核苷酸通过通过，磷酸二酯键聚合而成磷酸二酯键聚合而成的生物大分子，的生物大分子，单核苷酸的基本结构包括核苷和磷酸单核苷酸的基本结构包括核苷和磷酸，核，核苷是苷是含氮碱基含氮碱基（嘌呤碱与嘧啶碱）（嘌呤碱与嘧啶碱）与与戊糖戊糖通过糖苷键缩合通过糖苷键缩合而成。根据戊糖的种类可将核酸分为而成。根据戊糖的种类可将核酸分为核糖核酸核糖核酸和和脱氧核糖脱氧核糖核酸核酸。第一节 概 述一、结构与分类核酸类药物分析课件核酸类药物分析课件核酸、核苷酸类药物核酸、核苷酸类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷和碱基以及它们的类似物或衍生物。核苷和碱基以及它们的类似物或衍生物。按照化学结构和组成可分成四类：按照化学结构和组成可分成四类：核酸碱基及其衍生物，如硫鸟嘌呤、核酸碱基及其衍生物，如硫鸟嘌呤、氟尿嘧啶氟尿嘧啶、阿昔洛韦阿昔洛韦等；等；核苷及其衍生物，如肌苷、核苷及其衍生物，如肌苷、利巴韦林利巴韦林、阿糖胞苷；、阿糖胞苷；核苷酸及其衍生物，如核苷酸及其衍生物，如三磷酸腺苷二钠三磷酸腺苷二钠、胞磷胆碱钠、环磷、胞磷胆碱钠、环磷腺苷；腺苷；多核苷酸，如寡聚核苷酸、核糖核酸多核苷酸，如寡聚核苷酸、核糖核酸、核糖核酸、核糖核酸、抗肿、抗肿瘤免疫核糖核酸等。瘤免疫核糖核酸等。核酸、核苷酸类药物是指具有药用价值的核阿昔洛韦阿昔洛韦其化学名为其化学名为9-(2-羟乙氧甲基）鸟嘌呤。羟乙氧甲基）鸟嘌呤。化学结构式：化学结构式：药理作用：药理作用：抗病毒药抗病毒药。体外对单纯性疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞。体外对单纯性疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒等具抑制作用。病毒等具抑制作用。干扰病毒干扰病毒DNA多聚酶，抑制病毒的复制；多聚酶，抑制病毒的复制；在在DNA多聚酶作用下，与增长的多聚酶作用下，与增长的DNA链结合，引起链结合，引起DNA链的链的延伸中断。延伸中断。本品对病毒有特殊的亲和力，但对哺乳动物宿主细胞毒性本品对病毒有特殊的亲和力，但对哺乳动物宿主细胞毒性低。低。阿昔洛韦二、理化性质二、理化性质溶解性溶解性多核苷酸、核苷酸类药物均为磷酸盐，除环磷腺苷外，在水中均易溶。多核苷酸、核苷酸类药物均为磷酸盐，除环磷腺苷外，在水中均易溶。核苷类药物在乙醇、乙醚等有机溶剂中的溶解度均较差，部分核苷类核苷类药物在乙醇、乙醚等有机溶剂中的溶解度均较差，部分核苷类药物在水中易溶（如利巴韦林），部分核苷类药物在水中微溶（如肌药物在水中易溶（如利巴韦林），部分核苷类药物在水中微溶（如肌苷）。苷）。核酸碱基类药物大多能溶于酸性或碱性溶剂核酸碱基类药物大多能溶于酸性或碱性溶剂，如氟胞嘧啶，在稀，如氟胞嘧啶，在稀盐酸和稀氢氧化钠溶液中易溶盐酸和稀氢氧化钠溶液中易溶。二、理化性质紫外吸收紫外吸收核苷酸的核苷酸的磷酸酯和戊糖磷酸酯和戊糖均没有明显的紫外吸收，而均没有明显的紫外吸收，而嘌呤碱和嘧啶碱嘌呤碱和嘧啶碱等碱基等碱基具有共轭双键结构，在紫外光区有明显吸收。因此多核苷酸、核苷酸和核苷具有共轭双键结构，在紫外光区有明显吸收。因此多核苷酸、核苷酸和核苷与构成它们的碱基具有相似的紫外吸收光谱，最大吸收波长一般在与构成它们的碱基具有相似的紫外吸收光谱，最大吸收波长一般在附近。附近。酸碱性酸碱性核苷酸分子结构中的核苷酸分子结构中的磷酸和戊糖均呈酸性磷酸和戊糖均呈酸性，其中磷酸酸性较强，其中磷酸酸性较强，碱基为含碱基为含氮化合物呈弱碱性氮化合物呈弱碱性，故多核苷酸、核苷酸类和核苷类药物均为，故多核苷酸、核苷酸类和核苷类药物均为两性化合物两性化合物。核酸碱基类药物只有碱基，呈碱性。核酸碱基类药物只有碱基，呈碱性。水解性水解性核苷酸类药物分子结构中磷酸与戊糖间的核苷酸类药物分子结构中磷酸与戊糖间的酯键酯键和戊糖与碱基间的和戊糖与碱基间的糖苷键糖苷键都都会发生水解，同样条件下酯键先水解。会发生水解，同样条件下酯键先水解。紫外吸收第二节分析方法第二节分析方法各种核酸类药物都含有各种核酸类药物都含有碱基碱基，都具有，都具有弱碱性和紫外吸收弱碱性和紫外吸收性质性质；多核苷酸、核苷酸、核苷类药物中均含有多核苷酸、核苷酸、核苷类药物中均含有戊糖戊糖；多核苷酸和核苷酸结构中都含有多核苷酸和核苷酸结构中都含有磷酸磷酸。因此它们有一些共同的分析方法，如用紫外分光光度法进因此它们有一些共同的分析方法，如用紫外分光光度法进行鉴别或含量测定。行鉴别或含量测定。第二节分析方法 各种核酸类药物都含有碱基，都具有一、鉴别一、鉴别（一）化学鉴别（一）化学鉴别戊糖戊糖的鉴别的鉴别（）（）地衣酚反应地衣酚反应核糖核酸、核糖核苷酸或核糖核苷与酸共热时，水解形成的核糖核酸、核糖核苷酸或核糖核苷与酸共热时，水解形成的戊糖基脱水变为糠戊糖基脱水变为糠醛醛，再与，再与，二，二羟基甲苯（地衣酚）羟基甲苯（地衣酚）反应，缩合生成反应，缩合生成绿色绿色化合物。用三价铁盐或铜盐作催化剂，化合物。用三价铁盐或铜盐作催化剂，可增加呈色的灵敏度。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。可增加呈色的灵敏度。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。绿色绿色 670nm一、鉴别绿色 670nm（）（）二苯胺反应二苯胺反应脱氧核糖核酸、脱氧核苷酸或脱氧核苷与酸共脱氧核糖核酸、脱氧核苷酸或脱氧核苷与酸共热水解产热水解产生的脱氧核糖生的脱氧核糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色蓝色化合物，化合物，在波长处有最大吸收。在波长处有最大吸收。核糖核酸、核糖核苷酸无此反应核糖核酸、核糖核苷酸无此反应。蓝色蓝色 595nm（）二苯胺反应蓝色 595nm磷酸盐磷酸盐的鉴别的鉴别核酸、核苷酸类药物在酸性条件下加热核酸、核苷酸类药物在酸性条件下加热水解水解产生的产生的磷酸与过量磷酸与过量的钼酸铵的钼酸铵（）反应，生成反应，生成磷钼酸铵磷钼酸铵放冷析放冷析出黄色沉淀。此反应为磷酸盐的一般鉴别试验。出黄色沉淀。此反应为磷酸盐的一般鉴别试验。嘌呤碱嘌呤碱的鉴别的鉴别含有嘌呤碱的核酸类药物在水溶液中可与含有嘌呤碱的核酸类药物在水溶液中可与氨制硝酸银氨制硝酸银试液反应，试液反应，生成生成白色的银盐白色的银盐，遇光变为，遇光变为红棕色红棕色。此反应为嘌呤碱的特征鉴别。此反应为嘌呤碱的特征鉴别反应。反应。磷酸盐的鉴别氟元素的鉴别氟元素的鉴别氟尿嘧啶、氟胞嘧啶氟尿嘧啶、氟胞嘧啶等含氟有机化合物遇强氧化剂如等含氟有机化合物遇强氧化剂如三氧化铬三氧化铬的饱和硫酸溶液时，在微热条件下会产生氟化氢，腐蚀玻璃表的饱和硫酸溶液时，在微热条件下会产生氟化氢，腐蚀玻璃表面造成硫酸溶液不能均匀涂于管壁，产生类似油垢的现象。面造成硫酸溶液不能均匀涂于管壁，产生类似油垢的现象。硫元素的鉴别硫元素的鉴别硫鸟嘌呤硫鸟嘌呤分子结构中的元素在分子结构中的元素在甲醇钠甲醇钠溶液中缓缓加热后会转溶液中缓缓加热后会转化成化成硫化氢硫化氢气体，使气体，使醋酸铅试纸显黑色或灰色醋酸铅试纸显黑色或灰色。巯嘌呤分子结。巯嘌呤分子结构中的巯基还可与醋酸铅试液反应生成黄色沉淀。构中的巯基还可与醋酸铅试液反应生成黄色沉淀。氟元素的鉴别（二）光谱鉴别（二）光谱鉴别.紫外吸收光谱法紫外吸收光谱法碱基结构中的碱基结构中的嘌呤环和嘧啶环在紫外光区具有特征吸收嘌呤环和嘧啶环在紫外光区具有特征吸收，可用于鉴别。可用于鉴别。如吸收系数、最大吸收波长及其固定浓度下的吸光度、最如吸收系数、最大吸收波长及其固定浓度下的吸光度、最小吸收波长等。小吸收波长等。（二）光谱鉴别红外吸收光谱法红外吸收光谱法红外吸收光谱法主要分为红外吸收光谱法主要分为标准图谱对照法或对照品对照法标准图谱对照法或对照品对照法，中国药典中国药典主要采用标准图谱对照法。主要采用标准图谱对照法。红外光谱具有叠加性红外光谱具有叠加性，共存组分会使待测组分的红外光谱图发生变化，共存组分会使待测组分的红外光谱图发生变化，因此红外吸收光谱法一般用于纯度较高的原料药的鉴别。因此红外吸收光谱法一般用于纯度较高的原料药的鉴别。影响红外吸收光谱的因素较多影响红外吸收光谱的因素较多:如试样的制备方法、水分、晶型等，因此鉴别时应严格按规定绘制图谱。如试样的制备方法、水分、晶型等，因此鉴别时应严格按规定绘制图谱。对于可能发生转晶的药物，需按规定重结晶后再绘制图谱，如更昔洛韦的鉴对于可能发生转晶的药物，需按规定重结晶后再绘制图谱，如更昔洛韦的鉴别，别，本品的红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致本品的红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致，如不一致，取本品和对，如不一致，取本品和对照品适量，分别加水制成饱和溶液，滤过，取滤液在照品适量，分别加水制成饱和溶液，滤过，取滤液在以下放置过夜，以下放置过夜，待析出结晶，滤过，滤渣经待析出结晶，滤过，滤渣经干燥后，再次测定。干燥后，再次测定。红外吸收光谱法二、检查二、检查核糖核酸、脱氧核苷酸钠核糖核酸、脱氧核苷酸钠多采用多采用提取法提取法制备，寡聚核苷制备，寡聚核苷酸多采用化学合成法，酸多采用化学合成法，核酸碱基、核苷、核苷酸类药物大多采核酸碱基、核苷、核苷酸类药物大多采用酶解法、发酵法和半合成法制备。用酶解法、发酵法和半合成法制备。核酸类药物的杂质检查包括一般杂质检查、特殊杂质检查核酸类药物的杂质检查包括一般杂质检查、特殊杂质检查和安全性检查。和安全性检查。一般杂质检查主要有一般杂质检查主要有氯化物、硫酸盐、重金属、砷盐、铵氯化物、硫酸盐、重金属、砷盐、铵盐、铁盐、干燥失重、炽灼残渣等，盐、铁盐、干燥失重、炽灼残渣等，安全性检查主要安全性检查主要有细菌内有细菌内毒素、异常毒性、无菌检查等，毒素、异常毒性、无菌检查等，重点介绍从原料中带入或在生重点介绍从原料中带入或在生产过程中引入的杂质、污染物或其他成分等特殊杂质。产过程中引入的杂质、污染物或其他成分等特殊杂质。二、检查（一）多核苷酸类药物的检查（一）多核苷酸类药物的检查吸光度吸光度 核糖核酸、脱氧核苷酸钠多采用提取法从细胞或动物内脏制得，如核糖核酸、脱氧核苷酸钠多采用提取法从细胞或动物内脏制得，如核糖核酸核糖核酸系由健康猪的肝脏提取制得。制备过程中不可避免会系由健康猪的肝脏提取制得。制备过程中不可避免会带入一定带入一定的蛋白质的蛋白质，吸光度检查即为了控制核酸类药物中蛋白质的含量吸光度检查即为了控制核酸类药物中蛋白质的含量。具体方法。具体方法是配制一定浓度的供试液，分别在与的波长处测定是配制一定浓度的供试液，分别在与的波长处测定吸光度，要求该吸光度比值应不得低于吸光度，要求该吸光度比值应不得低于.。纯在和波长处的吸光度比值在纯在和波长处的吸光度比值在.以以上，的吸光度比值为上，的吸光度比值为.左右；当样品中蛋白质含量增加时该比值左右；当样品中蛋白质含量增加时该比值会下降。会下降。（一）多核苷酸类药物的检查核糖核酸中脱氧核糖核酸的检查核糖核酸中脱氧核糖核酸的检查 检查原理检查原理:脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性条件下与脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性条件下与二苯胺反应会生成蓝色化合物二苯胺反应会生成蓝色化合物，在附近有最大，在附近有最大吸收，而核糖核酸无此反应。通过控制处的吸吸收，而核糖核酸无此反应。通过控制处的吸光度，即可控制脱氧核糖核酸的含量。光度，即可控制脱氧核糖核酸的含量。核糖核酸中脱氧核糖核酸的检查增色效应增色效应核酸分子解链变性或断链时，其发色基团核酸分子解链变性或断链时，其发色基团碱基碱基暴露暴露后，会造成紫外吸收增强的现象。但其他的杂质，如后，会造成紫外吸收增强的现象。但其他的杂质，如蛋白质也具有增色效应，故通过要求增色效应不得低于某蛋白质也具有增色效应，故通过要求增色效应不得低于某个数值，可以控制相关杂质。如核糖核酸个数值，可以控制相关杂质。如核糖核酸要求本品的增要求本品的增色效应大于色效应大于.增色效应（二）核苷酸、核苷、核酸碱基类药物的检查（二）核苷酸、核苷、核酸碱基类药物的检查有关物质有关物质结构相似的其他非目标化合物，即有关物质结构相似的其他非目标化合物，即有关物质。以以硫鸟嘌呤硫鸟嘌呤中中“有关物质有关物质”检查为例进行说明。检查为例进行说明。硫鸟嘌呤是硫鸟嘌呤是以鸟嘌呤为原料制备以鸟嘌呤为原料制备而得，终产品中可能带入残而得，终产品中可能带入残留的原料、中间体、副反应产物等结构与硫鸟嘌呤类似的杂留的原料、中间体、副反应产物等结构与硫鸟嘌呤类似的杂质，统称为质，统称为“有关物质有关物质”。该类杂质中，。该类杂质中，鸟嘌呤是已知杂质鸟嘌呤是已知杂质且有对照品且有对照品，采用对照品对照法进行检查；其他杂质则采用，采用对照品对照法进行检查；其他杂质则采用不加校正因子的主成分自身对照法进行检查。不加校正因子的主成分自身对照法进行检查。（二）核苷酸、核苷、核酸碱基类药物的检查含氯量含氯量盐酸阿糖胞苷的生产过程中可能会因盐酸阿糖胞苷的生产过程中可能会因成盐不完全或产生一成盐不完全或产生一些其他的盐酸盐杂质些其他的盐酸盐杂质，造成药物中盐酸的含量发生变化，造成药物中盐酸的含量发生变化，即氯含量发生变化。因此通过含氯量测定可控制其纯度。即氯含量发生变化。因此通过含氯量测定可控制其纯度。含氟量含氟量氟尿嘧啶原料药中氟化程度也可通过含氟量来进行控制。氟尿嘧啶原料药中氟化程度也可通过含氟量来进行控制。含氯量三、含量测定三、含量测定核酸类药物结构中的嘧啶碱和嘌呤碱，具有一定的核酸类药物结构中的嘧啶碱和嘌呤碱，具有一定的弱碱性，弱碱性，可采用非水碱量法进行含量测定可采用非水碱量法进行含量测定；其共轭结构具有一定的紫外吸收，可通过测定最大其共轭结构具有一定的紫外吸收，可通过测定最大吸收波长的吸收波长的吸光度吸光度来测定含量，也可用带紫外检测器的来测定含量，也可用带紫外检测器的法法定量。定量。核酸类原料药的杂质较少时，可用非水碱量法或紫外核酸类原料药的杂质较少时，可用非水碱量法或紫外分光光度法定量；分光光度法定量；杂质较多时则需采用具有分离、分析能杂质较多时则需采用具有分离、分析能力的高效液相色谱法。力的高效液相色谱法。三、含量测定（一）非水碱量法原理原理核苷或碱基衍生物、类似物等药物的核苷或碱基衍生物、类似物等药物的碱性较弱碱性较弱，在水，在水溶液中用酸滴定时没有明显的突跃，难以获得满意的测定结溶液中用酸滴定时没有明显的突跃，难以获得满意的测定结果。而在果。而在冰醋酸溶剂冰醋酸溶剂中，弱碱性基团的相对碱强度得到显著中，弱碱性基团的相对碱强度得到显著增加，可被增加，可被高氯酸滴定液定量滴定高氯酸滴定液定量滴定，根据消耗的高氯酸滴定，根据消耗的高氯酸滴定液体积即可计算该类药物的含量。液体积即可计算该类药物的含量。以以更昔洛韦更昔洛韦的含量测定为例：取本品约的含量测定为例：取本品约.，精，精密称定，加冰醋酸，加热使溶解，放冷，加结晶紫密称定，加冰醋酸，加热使溶解，放冷，加结晶紫指示液滴，用高氯酸滴定液（指示液滴，用高氯酸滴定液（.）滴定至溶）滴定至溶液显绿色，并将滴定结果用空白试验校正。每的高氯液显绿色，并将滴定结果用空白试验校正。每的高氯酸滴定液（酸滴定液（.）相当于）相当于.的的。（一）非水碱量法注意事项注意事项该方法准确度高、精密度好，在具该方法准确度高、精密度好，在具弱碱性原料药的含量测定中应用广泛弱碱性原料药的含量测定中应用广泛。但。但该方法受到的影响因素较多，必须注意以下问题。该方法受到的影响因素较多，必须注意以下问题。（）（）水分在冰醋酸中呈碱性，可与高氯酸反应，水分在冰醋酸中呈碱性，可与高氯酸反应，所以反应体系中不应有水分。所以反应体系中不应有水分。（）由于所用溶剂（）由于所用溶剂冰醋酸有挥发性且膨胀系数较大，高氯酸滴定液的浓冰醋酸有挥发性且膨胀系数较大，高氯酸滴定液的浓度受温度和贮存条件影响很大。滴定时与标定时的温度差对高氯酸滴定液浓度的度受温度和贮存条件影响很大。滴定时与标定时的温度差对高氯酸滴定液浓度的影响很大，一般温度差小于影响很大，一般温度差小于时，滴定液的浓度经时，滴定液的浓度经校正校正后即可用于定量计算；后即可用于定量计算；若温度差超过若温度差超过，则应重新标定滴定液的浓度。高氯酸滴定液的浓度校正公，则应重新标定滴定液的浓度。高氯酸滴定液的浓度校正公式如下：式如下：注意事项（）（）冰醋酸溶剂的挥发、弱碱性杂质的存在冰醋酸溶剂的挥发、弱碱性杂质的存在都可能对测定都可能对测定结果造成干扰，故该法必须进行空白校正，即不加供试品，结果造成干扰，故该法必须进行空白校正，即不加供试品，同法操作，所得结果应扣除空白。同法操作，所得结果应扣除空白。（）常用电位滴定法和指示剂法作为终点的指示方法，但（）常用电位滴定法和指示剂法作为终点的指示方法，但指示剂的终点颜色变化需用电位滴定法确定。指示剂的终点颜色变化需用电位滴定法确定。（）冰醋酸溶剂的挥发、弱碱性杂质的存在都可能对测定（二）紫外分光光度法（二）紫外分光光度法嘌呤碱基和嘧啶碱基的紫外吸收特征除了可用嘌呤碱基和嘧啶碱基的紫外吸收特征除了可用于鉴别外，还可用于该类药物的含量测定。于鉴别外，还可用于该类药物的含量测定。中国药典中国药典（年版）（年版）收载的巯嘌呤、收载的巯嘌呤、氟尿嘧啶和别嘌醇的原料药均采用氟尿嘧啶和别嘌醇的原料药均采用紫外分光光度法紫外分光光度法中中的吸收系数法进行含量测定的吸收系数法进行含量测定。（三）高效液相色谱法（三）高效液相色谱法大多数核酸类药物可用常规的反相高效液相色大多数核酸类药物可用常规的反相高效液相色谱法进行分离测定，但部分结构中存在极性基团的核谱法进行分离测定，但部分结构中存在极性基团的核酸类药物采用常规方法分离时，效果较差，需改用一酸类药物采用常规方法分离时，效果较差，需改用一些特殊的高效液相色谱法，如些特殊的高效液相色谱法，如离子对色谱法或离子交离子对色谱法或离子交换色谱法换色谱法。（二）紫外分光光度法离子对色谱法离子对色谱法核苷酸类药物的核苷酸类药物的磷酸基磷酸基在反相高效液相色谱条件下在反相高效液相色谱条件下经常以离子化状态存在，保留很弱，不利于分离和测定。经常以离子化状态存在，保留很弱，不利于分离和测定。离子对高效液相色谱法可以有效改善核苷酸的色谱保离子对高效液相色谱法可以有效改善核苷酸的色谱保留，实现准确定量。留，实现准确定量。中国药典中国药典（年版）（年版）收载的收载的环磷腺苷、三环磷腺苷、三磷酸腺苷二钠和胞磷胆碱钠均采用离子对色谱法进行含量磷酸腺苷二钠和胞磷胆碱钠均采用离子对色谱法进行含量测定测定。离子对色谱法是离子对色谱法是在流动相中加入适量的反离子，使其在流动相中加入适量的反离子，使其与呈解离状态的待测组分形成离子对，增加其在非极性固与呈解离状态的待测组分形成离子对，增加其在非极性固定相上的分配，从而改善其色谱保留与分离行为。定相上的分配，从而改善其色谱保留与分离行为。核苷酸为酸性物质，故其离子对试剂常用核苷酸为酸性物质，故其离子对试剂常用季铵盐阳离季铵盐阳离子试剂子试剂，如，如四丁基溴化铵四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵。离子对色谱、四丁基氢氧化铵。离子对色谱的影响因素较多，包括反离子的性质和浓度、流动相的组的影响因素较多，包括反离子的性质和浓度、流动相的组成、值和离子强度等，需仔细选择。成、值和离子强度等，需仔细选择。离子对色谱法环磷腺苷的含量测定环磷腺苷的含量测定:色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢钾与用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢钾与四丁基溴化四丁基溴化铵铵的混合溶液的混合溶液为流动相；检测波长为。为流动相；检测波长为。取环磷腺苷对照品约，加水使溶解，加取环磷腺苷对照品约，加水使溶解，加的盐酸溶液，水浴加热后冷却，用氢的盐酸溶液，水浴加热后冷却，用氢氧化钠试液调至中性，用水稀释制成每中约含氧化钠试液调至中性，用水稀释制成每中约含.的溶液，取的溶液，取注入液相色谱仪，环磷腺苷峰与相邻杂质峰注入液相色谱仪，环磷腺苷峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求，理论板数按环磷腺苷峰计算不得低于的分离度应符合要求，理论板数按环磷腺苷峰计算不得低于，拖尾因子应小于，拖尾因子应小于.。环磷腺苷的含量测定:离子交换色谱法离子交换色谱法核酸类药物结构中有含氮碱性基团、多羟基糖苷，有些核酸类药物结构中有含氮碱性基团、多羟基糖苷，有些还以磷酸盐形式存在，这些基团会与常规的色谱柱上还以磷酸盐形式存在，这些基团会与常规的色谱柱上的残留硅醇羟基发生氢键吸附，造成峰形拖尾和柱压升的残留硅醇羟基发生氢键吸附，造成峰形拖尾和柱压升高，不利于分离测定。利用该类药物在适当条件下可发生离高，不利于分离测定。利用该类药物在适当条件下可发生离子化的性质，子化的性质，改用离子交换树脂改用离子交换树脂（如磺化交联的苯乙烯二（如磺化交联的苯乙烯二乙烯基共聚物）乙烯基共聚物）作为固定相填料，通过离子交换原作为固定相填料，通过离子交换原理进行分离，可以有效改善拖尾的问题。理进行分离，可以有效改善拖尾的问题。中国药典中国药典从年版开始改用阳离子交换色从年版开始改用阳离子交换色谱法对利巴韦林进行含量测定，结果有明显改善谱法对利巴韦林进行含量测定，结果有明显改善。离子交换色谱法利巴韦林的含量测定利巴韦林的含量测定。色谱条件与系统适用性试验用磺化交联的色谱条件与系统适用性试验用磺化交联的苯乙烯苯乙烯二乙烯基共聚物的氢型阳离子交换树脂二乙烯基共聚物的氢型阳离子交换树脂为填充剂；以水（用为填充剂；以水（用稀硫酸调节值至稀硫酸调节值至.）为流动相；检测为流动相；检测波长为。理论板数按利巴韦林峰计算不低于波长为。理论板数按利巴韦林峰计算不低于。离子交换色谱常使用水缓冲溶液作流动相，有时也通过加入离子交换色谱常使用水缓冲溶液作流动相，有时也通过加入适量有机溶剂如甲醇或乙醇来提高分离度或改善样品的溶解适量有机溶剂如甲醇或乙醇来提高分离度或改善样品的溶解度。度。利巴韦林的含量测定。第三节应用实例一、巯嘌呤一、巯嘌呤巯嘌呤为次黄嘌呤类似物，通过抑制核酸合成而发挥巯嘌呤为次黄嘌呤类似物，通过抑制核酸合成而发挥抗肿瘤抗肿瘤作用。药用为含作用。药用为含一个结晶水的巯嘌呤。本品主要经化学合成法制备。一个结晶水的巯嘌呤。本品主要经化学合成法制备。巯嘌呤主要以氰乙酸乙酯为原料进行合成。在加热的无水乙醇与乙醇钠溶液中，巯嘌呤主要以氰乙酸乙酯为原料进行合成。在加热的无水乙醇与乙醇钠溶液中，氰乙酸乙酯先与硫脲环合生成巯基氨基羟基嘧啶，经亚硝基化、还原氰乙酸乙酯先与硫脲环合生成巯基氨基羟基嘧啶，经亚硝基化、还原得巯基，二氨基羟基嘧啶，然后在活性镍的作用下，消除巯基得，得巯基，二氨基羟基嘧啶，然后在活性镍的作用下，消除巯基得，二氨基羟基嘧啶，进一步与甲酸环合成羟基嘌呤，然后在吡啶溶液中与二氨基羟基嘧啶，进一步与甲酸环合成羟基嘌呤，然后在吡啶溶液中与五硫化二磷在五硫化二磷在反应制得巯嘌呤。反应制得巯嘌呤。第三节应用实例一、巯嘌呤核酸类药物分析课件（一）鉴别（一）鉴别（）本品加乙醇溶解后，与醋酸铅乙醇溶液反应，生成巯嘌呤铅黄色沉淀。（一）鉴别（）巯嘌呤分子上的巯基（）与强氧化剂浓硝酸作用，被氧化成嘌呤亚磺酸，进一步氧化成黄色的嘌呤磺酸，再与氢氧化钠试液反应，生成呈黄棕色的嘌呤磺酸钠。（）巯嘌呤分子上的巯基（）与强氧化剂浓硝酸作（）巯嘌呤分子上的巯基（）与氨试液反应，生成铵盐，溶解度增大，溶液变澄清，再与硝酸银试液反应，生成溶解度较小的巯嘌呤银白色絮状沉淀，在热硝酸中不溶。（）本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。（）巯嘌呤分子上的巯基（）与氨试液反应，生成（二）检查（二）检查.羟基嘌呤羟基嘌呤羟基嘌呤为巯嘌呤的合成中间体，其结构与巯嘌羟基嘌呤为巯嘌呤的合成中间体，其结构与巯嘌呤仅差一个取代基：一个是羟基取代，一个是巯基取代。呤仅差一个取代基：一个是羟基取代，一个是巯基取代。精制不完全会有残留，对巯嘌呤的安全使用有影响。精制不完全会有残留，对巯嘌呤的安全使用有影响。中国药典中国药典（年版）（年版）利用两者在紫外吸利用两者在紫外吸收图谱上的差异，采用紫外可见分光光度法对羟基收图谱上的差异，采用紫外可见分光光度法对羟基嘌呤的量进行控制，嘌呤的量进行控制，巯嘌呤在处具有强烈的紫巯嘌呤在处具有强烈的紫外吸收，而羟基嘌呤的最大吸收波长在、外吸收，而羟基嘌呤的最大吸收波长在、处基本无吸收，处基本无吸收，故通过规定与故通过规定与波长处的吸光度比值不得过波长处的吸光度比值不得过.，即可对，即可对羟基嘌呤的量进行控制。羟基嘌呤的量进行控制。（二）检查.硫酸盐硫酸盐本品在生产过程中可能产生硫酸盐杂质，本品在生产过程中可能产生硫酸盐杂质，中国药典中国药典（年（年版）版）采用在盐酸溶液中，不得与氯化钡反应产生浑浊现象来控制硫酸盐采用在盐酸溶液中，不得与氯化钡反应产生浑浊现象来控制硫酸盐杂质。杂质。.水分水分对于含有结晶水的药物需对其水分进行测定，巯嘌呤水分的含量约为对于含有结晶水的药物需对其水分进行测定，巯嘌呤水分的含量约为.，中国药典中国药典（年版）（年版）规定采用费休氏法测定水规定采用费休氏法测定水分，含量应在分，含量应在.。.硫酸盐.重金属 巯嘌呤分子结构中含有可与重金属结合的巯基，采用第一法进行重金属检查会产生假阴性的结果，故中国药典（年版）采用第二法（炽灼后的硫代乙酰胺法）对巯嘌呤中的重金属进行检查。该法需先将供试品高温炽灼破坏成无机物后再进行重金属检查，炽灼温度对检查结果影响较大，温度越高，重金属损失越多，因此炽灼温度应控制在。.重金属（三）含量测定（三）含量测定巯嘌呤具有很强的紫外吸收，在巯嘌呤具有很强的紫外吸收，在.盐酸溶液中，其最大吸收盐酸溶液中，其最大吸收波长处的吸收系数可达。波长处的吸收系数可达。中国药典中国药典（年版）（年版）采用采用紫外分光光度法紫外分光光度法中的吸收系数法对其进行含量测定。中的吸收系数法对其进行含量测定。具体方法：取本品，精密称定，加具体方法：取本品，精密称定，加.盐酸溶液溶解并定量稀释至盐酸溶液溶解并定量稀释至每中约含每中约含的溶液，照紫外可见分光光度法，在的波长的溶液，照紫外可见分光光度法，在的波长处测定吸光度，处测定吸光度，的吸收系数（）为，计的吸收系数（）为，计算即得。算即得。（三）含量测定 巯嘌呤具有很强的紫外吸收，在二、三磷酸腺苷二钠二、三磷酸腺苷二钠三磷酸三磷酸腺苷腺苷二钠为核苷酸衍生物，直接参与体内脂肪、蛋白质、糖、核二钠为核苷酸衍生物，直接参与体内脂肪、蛋白质、糖、核酸以及核苷酸的代谢，与组织生长、修补及再生均有密切关系，酸以及核苷酸的代谢，与组织生长、修补及再生均有密切关系，是体内能量的是体内能量的主要来源主要来源，能扩张冠状动脉及周围血管，具有改善机体代谢的作用。，能扩张冠状动脉及周围血管，具有改善机体代谢的作用。药用三磷酸腺苷二钠为二钠盐，含个结晶水。临床上主要用于心力衰药用三磷酸腺苷二钠为二钠盐，含个结晶水。临床上主要用于心力衰竭、心肌炎、脑动脉硬化、脑出血后遗症、急性脊髓灰质炎、进行性肌肉萎缩竭、心肌炎、脑动脉硬化、脑出血后遗症、急性脊髓灰质炎、进行性肌肉萎缩等疾病的治疗。目前三磷酸腺苷二钠生产方法主要为等疾病的治疗。目前三磷酸腺苷二钠生产方法主要为发酵法发酵法。以腺嘌呤核苷酸。以腺嘌呤核苷酸为原料，在啤酒酵母的发酵条件下生成三磷酸腺苷，然后进一步纯化、结晶成为原料，在啤酒酵母的发酵条件下生成三磷酸腺苷，然后进一步纯化、结晶成三磷酸腺苷二钠。三磷酸腺苷二钠。二、三磷酸腺苷二钠（一）鉴别（一）鉴别（）取本品约，加稀硝酸溶解后，加钼酸铵试（）取本品约，加稀硝酸溶解后，加钼酸铵试液，水浴加热，放冷，即析出黄色沉淀。此鉴别反应可验液，水浴加热，放冷，即析出黄色沉淀。此鉴别反应可验证其是否为证其是否为磷酸盐磷酸盐。（）取本品水溶液（）取本品水溶液（），加，二），加，二羟基甲苯乙醇溶液（羟基甲苯乙醇溶液（）.，加硫酸亚铁铵盐酸溶，加硫酸亚铁铵盐酸溶液（液（），置水浴中加热，即显绿色。），置水浴中加热，即显绿色。此此鉴别反应为核糖基的地衣酚反应。鉴别反应为核糖基的地衣酚反应。（）（）本品的红外吸收图谱应与对照的图谱（本品的红外吸收图谱应与对照的图谱（药品红外光谱集药品红外光谱集图）一致图）一致。主要比较下列几个特征吸收谱带的峰型、峰位及相对强度。主要比较下列几个特征吸收谱带的峰型、峰位及相对强度是否一致。是否一致。（）本品为钠盐，也需对其进行鉴别。（）本品为钠盐，也需对其进行鉴别。中国药典中国药典规定采用焰色反应进行鉴别。规定采用焰色反应进行鉴别。（一）鉴别（二）检查（二）检查三磷酸腺苷二钠主要采用发酵法进行制备，以腺嘌呤三磷酸腺苷二钠主要采用发酵法进行制备，以腺嘌呤核苷酸为原料，在啤酒酵母的发酵条件下生成三磷酸腺苷，核苷酸为原料，在啤酒酵母的发酵条件下生成三磷酸腺苷，然后进一步纯化、结晶成三磷酸腺苷二钠。然后进一步纯化、结晶成三磷酸腺苷二钠。根据生产过程及贮藏过程中可能产生杂质的情况，需要根据生产过程及贮藏过程中可能产生杂质的情况，需要进行酸度、溶液的澄清度与颜色、进行酸度、溶液的澄清度与颜色、有关物质有关物质、水分、氯化物、水分、氯化物、重金属、铁盐和细菌内毒素等项检查。重金属、铁盐和细菌内毒素等项检查。（二）检查.酸度酸度三磷酸腺苷二钠虽然为钠盐，但总体仍呈现为酸性，质量标准要求本品用三磷酸腺苷二钠虽然为钠盐，但总体仍呈现为酸性，质量标准要求本品用水制成的溶液，其值应为水制成的溶液，其值应为.。.有关物质有关物质本品对温度较敏感，在常温下易分解为本品对温度较敏感，在常温下易分解为二磷酸腺苷二钠和一磷酸腺苷钠二磷酸腺苷二钠和一磷酸腺苷钠。发。发酵过程中产生的二磷酸腺苷、一磷酸腺苷等副产物在纯化、结晶过程中也会酵过程中产生的二磷酸腺苷、一磷酸腺苷等副产物在纯化、结晶过程中也会一起形成二磷酸腺苷二钠和一磷酸腺苷钠，结构与三磷酸腺苷二钠类似，难以一起形成二磷酸腺苷二钠和一磷酸腺苷钠，结构与三磷酸腺苷二钠类似，难以完全除去。完全除去。本品的有关物质检查主要控制的就是这两个杂质的含量，具体检查本品的有关物质检查主要控制的就是这两个杂质的含量，具体检查内容如下：照含量测定项下三磷酸腺苷二钠的重量比的方法测定，按下式计算内容如下：照含量测定项下三磷酸腺苷二钠的重量比的方法测定，按下式计算不得大于不得大于.。.酸度.水分水分三磷酸腺苷二钠含有个结晶水，理论含水量为三磷酸腺苷二钠含有个结晶水，理论含水量为.，中国药典中国药典（年版）采用卡氏水分测定法测定其（年版）采用卡氏水分测定法测定其含水量应在含水量应在.。由于三磷酸腺苷二钠几乎不溶于乙醇、乙醚、三氯甲烷由于三磷酸腺苷二钠几乎不溶于乙醇、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂，在甲醇中溶解度低，因此采用乙二醇无水甲醇等有机溶剂，在甲醇中溶解度低，因此采用乙二醇无水甲醇（）作为溶剂。检测时搅拌速度、时间对测定结果影）作为溶剂。检测时搅拌速度、时间对测定结果影响较大，一般需搅拌左右，使样品完全溶解后再滴响较大，一般需搅拌左右，使样品完全溶解后再滴定。定。.水分（三）含量测定（三）含量测定由于二磷酸腺苷二钠和一磷酸腺苷钠等杂质的干扰难以除去，故本品采用先测由于二磷酸腺苷二钠和一磷酸腺苷钠等杂质的干扰难以除去，故本品采用先测定定总核苷酸含量总核苷酸含量和和三磷酸腺苷二钠三磷酸腺苷二钠的重量比，然后通过计算获得三磷酸腺苷二钠的的重量比，然后通过计算获得三磷酸腺苷二钠的准确含量，具体方法如下。准确含量，具体方法如下。.总核苷酸的含量测定总核苷酸的含量测定取本品适量，精密称定，加取本品适量，精密称定，加.磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠液（取磷酸氢二钠.，加水至作为液，取无水磷酸二氢钾，加水至作为液，取无水磷酸二氢钾.，加水至作为液，取液适量，加入液中，调值，加水至作为液，取液适量，加入液中，调值至至.，使溶解并定量稀释制成每中含，使溶解并定量稀释制成每中含的溶液，照紫外可见分光的溶液，照紫外可见分光光度法测定，在的波长处测定吸光度，按光度法测定，在的波长处测定吸光度，按的吸收系数（的吸收系数（）为计算。）为计算。（三）含量测定.三磷酸腺苷二钠的重量比的测定三磷酸腺苷二钠的重量比的测定照高效液相色谱法测定照高效液相色谱法测定（）色谱条件与系统适用性试验（）色谱条件与系统适用性试验用末端封尾的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以用末端封尾的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以.磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠.，磷酸氢二钾，磷酸氢二钾.，加水溶解，用氢氧化钠溶液调节，加水溶解，用氢氧化钠溶液调节值至值至.，加入加入四丁基溴化铵四丁基溴化铵.，加水至，加水至，摇匀）摇匀）甲醇（甲醇（）为流动相，柱温为）为流动相，柱温为，检测波长为，检测波长为，理论板数按三磷酸腺苷二钠峰计算不低于，理论板数按三磷酸腺苷二钠峰计算不低于，出峰次序依次为一磷酸腺苷钠、二磷酸腺苷二钠与三磷酸腺苷二钠，出峰次序依次为一磷酸腺苷钠、二磷酸腺苷二钠与三磷酸腺苷二钠，各色谱峰的分离度应符合要求（图）各色谱峰的分离度应符合要求（图）.三磷酸腺苷二钠的重量比的测定照高效液相色谱法测定（）测定法（）测定法取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每含成每含.的溶液，精密量取的溶液，精密量取注入液注入液相色谱仪，记录色谱图，计算三磷酸腺苷二钠在总核苷酸相色谱仪，记录色谱图，计算三磷酸腺苷二钠在总核苷酸中的重量比。中的重量比。（）测定法.三磷酸腺苷二钠含量的计算 三磷酸腺苷二钠含量三磷酸腺苷二钠含量（总核苷酸三磷酸腺苷二钠的重量比）式中各符号的含义同有关物质检查的计算公式。.三磷酸腺苷二钠含量的计算一、鉴别一、鉴别（一）化学鉴别（一）化学鉴别戊糖戊糖的鉴别的鉴别（）（）地衣酚反应地衣酚反应（）（）二苯胺反应二苯胺反应磷酸盐的鉴别磷酸盐的鉴别嘌呤碱的鉴别嘌呤碱的鉴别（二）光谱鉴别（二）光谱鉴别.紫外吸收光谱法紫外吸收光谱法.红外吸收光谱法红外吸收光谱法一、鉴别（一）化学鉴别二、检查二、检查核糖核酸、脱氧核苷酸钠多采用核糖核酸、脱氧核苷酸钠多采用提取法提取法制备，制备，核酸碱基、核苷、核苷酸类药物大多采用酶解法、核酸碱基、核苷、核苷酸类药物大多采用酶解法、发酵法发酵法和半合成法制备。和半合成法制备。（一）多核苷酸类药物的检查（一）多核苷酸类药物的检查吸光度吸光度核糖核酸中核糖核酸中脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸的检查的检查增色效应增色效应（二）核苷酸、核苷、核酸碱基类药物的检查（二）核苷酸、核苷、核酸碱基类药物的检查有关物质有关物质结构相似的其他非目标化合物，即有关物质结构相似的其他非目标化合物，即有关物质。2含氯量含氯量含氟量含氟量二、检查核糖核酸、脱氧核苷酸钠多采用提取法制备，三、含量测定1、核酸类药物结构中的嘧啶碱和嘌呤碱，具有一定的弱碱性，、核酸类药物结构中的嘧啶碱和嘌呤碱，具有一定的弱碱性，可采用非可采用非水碱量法进行含量测定水碱量法进行含量测定；2、其共轭结构具有一定的紫外吸收，可通过测定最大吸收波长的、其共轭结构具有一定的紫外吸收，可通过测定最大吸收波长的吸光度吸光度来测定含量来测定含量3、紫外检测器的、紫外检测器的法法定量。定量。大多数核酸类药物可用常规的反相高效液相色谱法进行分离测定，大多数核酸类药物可用常规的反相高效液相色谱法进行分离测定，但部分结构中存在极性基团的核酸类药物采用常规方法分离时，效果但部分结构中存在极性基团的核酸类药物采用常规方法分离时，效果较差，需改用一些特殊的高效液相色谱法，如较差，需改用一些特殊的高效液相色谱法，如离子对色谱法或离子交离子对色谱法或离子交换色谱法换色谱法。三、含量测定1、核酸类药物结构中的嘧啶碱和嘌呤碱，具有一定的