放射性核素标记技术课件

放射性核素标记技术放射性核素标记技术 实验核医学实验核医学放射性核素标记技术 实验核医学1一一.几个概念几个概念1.标记及标记化合物：通过一定的实验手段将某种放射性同位标记及标记化合物：通过一定的实验手段将某种放射性同位素和某种生物活性化合物相连接，使之成为某示踪物的方法称之为素和某种生物活性化合物相连接，使之成为某示踪物的方法称之为标记。其产物称之为标记化合物。标记。其产物称之为标记化合物。2.内源性标记：在有机或生物合成过程中，使放射性前身物掺内源性标记：在有机或生物合成过程中，使放射性前身物掺入到某生物活性分子一级结构内的标记方法。特点是标记化合物和入到某生物活性分子一级结构内的标记方法。特点是标记化合物和生物活性物质理化特性完全相同生物活性物质理化特性完全相同.3.理想标记：当化合物中某原子被相同元素的放射性同位素所理想标记：当化合物中某原子被相同元素的放射性同位素所取代，而取代后的分子性质不发生改变取代，而取代后的分子性质不发生改变(如构型如构型,旋光性等旋光性等)这称之这称之为理想标记。它和内源性标记特点相似但方法不同。为理想标记。它和内源性标记特点相似但方法不同。4.非理想标记：在一定条件下，用组成化合物以外的放射性同非理想标记：在一定条件下，用组成化合物以外的放射性同位素原子进行取代该化合物的某些原子的标记称之非理想标记。其位素原子进行取代该化合物的某些原子的标记称之非理想标记。其分子结构或性质均较原化合物有不同程度的改变。分子结构或性质均较原化合物有不同程度的改变。一.几个概念25.末端标记：用化学或酶的方法将放射性同位素连接在完整生末端标记：用化学或酶的方法将放射性同位素连接在完整生物活性分子上的方法。物活性分子上的方法。6.双标记：在某生物活性分子中引进二种元素同位素原子或同双标记：在某生物活性分子中引进二种元素同位素原子或同一元素的二种放射性同位素标记称之为双标记。一元素的二种放射性同位素标记称之为双标记。如如T3，T4分别用分别用125I，131I标记观察脱碘情况。标记观察脱碘情况。22Na，24Na在细胞内外示踪观察在细胞内外示踪观察Na流动情况。流动情况。优点：是在同一实验中可以观察多种指标及代谢变化，排除减少优点：是在同一实验中可以观察多种指标及代谢变化，排除减少个体实验误差。个体实验误差。5.末端标记：用化学或酶的方法将放射性同位素37.标记化合物的术语及符号标记化合物的术语及符号1)定位标记：以定位标记：以S表示表示,标记分子中标记的原子局限于分子的标记分子中标记的原子局限于分子的指定位置指定位置.用以追踪分子中某原子的去向。用以追踪分子中某原子的去向。A-X-B+C-X*-D-A-X-D+C-X*-BA-X-B+C-X*-D-A-X*-D+C-X-B产物产物C-X*-B1式正确式正确.2)非定位标记：标记分子中标记的原子没有特定的位置。非定位标记：标记分子中标记的原子没有特定的位置。3)均匀标记：以均匀标记：以U表示表示,指标记放射性原子在标记物分子中的指标记放射性原子在标记物分子中的分布，相对于分子中所有碳原子而言具有统计学均一性分布，相对于分子中所有碳原子而言具有统计学均一性.如如U-14C葡葡萄糖。萄糖。4)全标记：以全标记：以G表示表示,通常指在氚标记的分子中所有的氢原子通常指在氚标记的分子中所有的氢原子位置均被氚所取代，它和均匀标记的区别是：前者指位置均被氚所取代，它和均匀标记的区别是：前者指C而后者指而后者指氚氚,前者仅表示统计学的均一性前者仅表示统计学的均一性,而后者则是完全或随机取代而后者则是完全或随机取代.如如G-3H-胆固醇。胆固醇。7.标记化合物的术语及符号 45)准定位标记：以准定位标记：以N表示表示,氚原子在预期标记的位置上的分布氚原子在预期标记的位置上的分布低于化合物总氚含量的低于化合物总氚含量的95%。8.标记位置及命名标记位置及命名如如1-14C-醋酸醋酸标记化合物标记化合物 标记位置标记位置核素核素5)准定位标记：以N表示,氚原子在预期标记的位置上的分布5二二.放射性同位素的选择放射性同位素的选择根据实验选择相应的同位素，应注意：根据实验选择相应的同位素，应注意：1.比放射性比放射性:表示单位重量的元素或示踪所含的放射性多少表示单位重量的元素或示踪所含的放射性多少,以以mCi/mmol或或MBq/mmol等单位表示。由于放射性同位素的比放射等单位表示。由于放射性同位素的比放射性相差悬殊，所以当某示踪中引进相同原子数目的不同种类的放射性相差悬殊，所以当某示踪中引进相同原子数目的不同种类的放射性同位素，则单位时间内的核衰变数就有上千，上万倍的差异，可性同位素，则单位时间内的核衰变数就有上千，上万倍的差异，可见选用高比放射性的同位素进行标记有着重要意义。见选用高比放射性的同位素进行标记有着重要意义。2.丰度：类似于纯度的概念，代表了某示踪物中具有放射性部丰度：类似于纯度的概念，代表了某示踪物中具有放射性部分的比例。丰度的高低直接或间接地影响标记产物的比放射性。分的比例。丰度的高低直接或间接地影响标记产物的比放射性。3.半衰期：半衰期对标记反应的影响首先是对比放射性的影响半衰期：半衰期对标记反应的影响首先是对比放射性的影响,其次是要根据实验目的和时间而选择不同半衰期的放射性同位素。其次是要根据实验目的和时间而选择不同半衰期的放射性同位素。4.稳定性和外辐射稳定性和外辐射:标记用的放射性同位素应有较好的稳定性，标记用的放射性同位素应有较好的稳定性，如如131I较较125I稳定性差，而且有稳定性差，而且有辐射，所以辐射，所以RIA分析常选用分析常选用125I标标记。记。5.探测仪器的计数效率探测仪器的计数效率:氚标记物需要用液闪测量不仅样品制备氚标记物需要用液闪测量不仅样品制备烦琐，而且仪器计数效率低，致使其应用受限。烦琐，而且仪器计数效率低，致使其应用受限。6.标记类型标记类型同位素交换法、化学合成法、生物合成法、同位素交换法、化学合成法、生物合成法、二.放射性同位素的选择6三三.关于被标记的生物活性物的选择关于被标记的生物活性物的选择:被标记的生物活性物是根据实验所确定的，但用于标记的物质被标记的生物活性物是根据实验所确定的，但用于标记的物质必须是高纯度，所谓高纯度包括两个含义：必须是高纯度，所谓高纯度包括两个含义：1.化学纯化学纯2.其中所含的微量杂质不干扰实验内容，就放免而言纯品应有其中所含的微量杂质不干扰实验内容，就放免而言纯品应有足够的免疫纯；杂蛋白的掺入可因其被大量标记而使标记失去意义；足够的免疫纯；杂蛋白的掺入可因其被大量标记而使标记失去意义；类似结构的杂质可因和反应体系内某些物质交叉而干扰实验类似结构的杂质可因和反应体系内某些物质交叉而干扰实验。三.关于被标记的生物活性物的选择:7四标记化合物的主要指标及检查方法四标记化合物的主要指标及检查方法1.核纯度：核纯度：所需放射性活度所需放射性活度核纯度核纯度%=100 样品总放射性活度样品总放射性活度半衰期测定法、能量测定、半衰期测定法、能量测定、2.放化纯度：放化纯度：特定形态的放射性活度特定形态的放射性活度放化纯度放化纯度%=100样品总放射性活度样品总放射性活度层析法、放射自显影层析法、放射自显影、放射性扫描、放射性扫描、HPLC、分段切取测量分段切取测量 四标记化合物的主要指标及检查方法 8放射性核素标记技术课件9待测组分和原点的距离（待测组分和原点的距离（I）Rf=流动相的前沿和原点的距离（流动相的前沿和原点的距离（L）待测组分和原点的10放射性核素标记技术课件11放射性核素标记技术课件123)比活度：比活度比活度：比活度=放射性活度放射性活度/单位化学量单位化学量*每一种放射性核素都有一个比活度的理论值每一种放射性核素都有一个比活度的理论值比活度比活度N=0.693N/T1/2N为一毫克原子（为一毫克原子（mA）的总原子数为）的总原子数为6.0231020=69.6108/T1/2GBq/mA意义是每意义是每mA的某核素比活度的理论值，即每分子接上一个该的某核素比活度的理论值，即每分子接上一个该放射性核素原子的标记化合物的比活度理论值。放射性核素原子的标记化合物的比活度理论值。一些常用放射性核素比活度理论值一些常用放射性核素比活度理论值核素 半衰期 Bq/mmol14C 5730Y 2.3G3H 12.33Y 1073G35S 87.4d 55.2T32p 14.28d 338.5T125I 60.2d 80.3T131I 8.04d 600T3)比活度：比活度=放射性活度/单位化学量核素 13五五.标记方法标记方法原料为简单化合物如原料为简单化合物如3H2,Ba14CO3,Na125I等等1)同位素交换法同位素交换法五.标记方法142)化学合成法化学合成法 2)化学合成法 15 3)3)生物合成法生物合成法 3)生物合成法 16多肽或蛋白质的碘化标记多肽或蛋白质的碘化标记 125 125I-Na在氧化剂的作用下氧化成碘分子在氧化剂的作用下氧化成碘分子,与蛋白质与蛋白质或多肽分子中的酪氨酸残基发生碘化作用或多肽分子中的酪氨酸残基发生碘化作用,从而使蛋白或从而使蛋白或多肽碘化多肽碘化.所以只要含有酪氨酸或人为的接上酪氨酸的化所以只要含有酪氨酸或人为的接上酪氨酸的化合物均可用放射性碘标记合物均可用放射性碘标记,除此而外组氨酸除此而外组氨酸,色氨酸残基也色氨酸残基也可生成碘化物可生成碘化物.碘化标记有一氯化碘法碘化标记有一氯化碘法,氯胺氯胺-T法法,过氧化过氧化物酶法物酶法,Iodogen法法,电解标记法电解标记法,连接标记法等这里仅介绍连接标记法等这里仅介绍常用的后四种方法常用的后四种方法.多肽或蛋白质的碘化标记17一一.氯胺氯胺-T法法.1.原理原理:氯胺氯胺-T(对甲基苯磺胺的对甲基苯磺胺的N-氯衍生物氯衍生物)是一种较温和是一种较温和的氧化在水溶液中的氧化在水溶液中,产生次氯酸产生次氯酸,它可以使阴离子它可以使阴离子131I,125I在碘化反应过程中产生一种具有强氧化性的带在碘化反应过程中产生一种具有强氧化性的带正电荷的碘原子对酪氨酸酚环上与负氧正电荷的碘原子对酪氨酸酚环上与负氧(羟基羟基)邻位的碳邻位的碳进行亲进行亲,电攻击电攻击,或对组胺酸咪唑环上与负氮邻位的碳进或对组胺酸咪唑环上与负氮邻位的碳进行亲电攻击行亲电攻击,产生取代反应而碘化多肽或蛋白质产生取代反应而碘化多肽或蛋白质.这种取这种取代反应在某些情况下可以在组胺酰咪唑基或半胱胺酰巯代反应在某些情况下可以在组胺酰咪唑基或半胱胺酰巯基上基上,对于非肽类激素对于非肽类激素,如甾体激素如甾体激素A环第二位的氢也可环第二位的氢也可进行取代进行取代.有关氯胺有关氯胺-T的作用原理尚不清楚的作用原理尚不清楚,可能反应如可能反应如下下:一.氯胺-T法.18放射性核素标记技术课件192.标记过程和实验条件的优化标记过程和实验条件的优化:(以以TSH为例为例)1)碘化程序及条件碘化程序及条件:TSH纯品纯品(碘化级碘化级)2g10l缓冲液缓冲液(0.5MPBPH7.5)20l125I-Nao.5mCi5lCL-T20g20l-反应反应45秒秒室温室温(25)偏重亚硫酸钠偏重亚硫酸钠40g80l-然后用然后用SephadexG-75(120Cm)分离放射性碘分离放射性碘和标记蛋白和标记蛋白.2.标记过程和实验条件的优化:(以TSH为例)20放射性核素标记技术课件21标记过程中应注意的问题是标记过程中应注意的问题是:1)被标记的纯品必须要高纯被标记的纯品必须要高纯度，高活性通常为碘化级。度，高活性通常为碘化级。2)PH对碘化反应有着重要影响对碘化反应有着重要影响,根据被碘化的蛋白质，根据被碘化的蛋白质，多肽不同，所需最适多肽不同，所需最适PH也不同，一般以中性偏弱碱环境也不同，一般以中性偏弱碱环境为宜；为确保反应体系维持适当的为宜；为确保反应体系维持适当的PH则必须要使用足够则必须要使用足够缓冲容量的缓冲液。缓冲容量的缓冲液。3)碘源和氯胺碘源和氯胺-T的用量：首先注意碘源是丰度，是否的用量：首先注意碘源是丰度，是否有保护剂有保护剂(通常为通常为Na2 2SO3 3等还原剂等还原剂)，有无载体等，实验，有无载体等，实验中氧化剂的用量远大于理论值；当有还原剂时氯胺中氧化剂的用量远大于理论值；当有还原剂时氯胺-T用用量较无还原剂碘源还要相应增大；由于氯胺量较无还原剂碘源还要相应增大；由于氯胺-T的用量也的用量也能将蛋白或多肽的巯基氧化；所以标记还原性强的蛋白能将蛋白或多肽的巯基氧化；所以标记还原性强的蛋白化合物时氯胺化合物时氯胺-T的用量亦应相应增加。氯胺的用量亦应相应增加。氯胺-T的用量有的用量有一临界值一临界值,低于此值，氯胺低于此值，氯胺-T用量不足时标记率很低，用量不足时标记率很低，标记过程中应注意的问题是:1)被标记的纯品必须要高纯度，高活22而用量过大不仅无助于提高标记率反而会明显降低标记化合物的而用量过大不仅无助于提高标记率反而会明显降低标记化合物的免疫和生物活性。氯胺免疫和生物活性。氯胺-T的用量是一实验值，由于氯胺的用量是一实验值，由于氯胺-T水溶液水溶液遇光和空气很不稳定，所以要新鲜配制。遇光和空气很不稳定，所以要新鲜配制。4)温度对标记的影响：如图所示：温度的增加不仅可提高反温度对标记的影响：如图所示：温度的增加不仅可提高反应达平衡的时间，而且在不同温度下反应有着不同平衡常数应达平衡的时间，而且在不同温度下反应有着不同平衡常数K值值.一般选用一般选用20，过高的温度往往造成纯品失活。有人用，过高的温度往往造成纯品失活。有人用4标记标记是为了降低氯胺是为了降低氯胺-T的副作用。的副作用。5)反应体积的影响：通常要小于反应体积的影响：通常要小于100l，目的是提高可被碘化，目的是提高可被碘化的蛋白浓度；以提高碘化率。的蛋白浓度；以提高碘化率。6)反应时间：在某一固定的条件下，反应达到平衡的时间是反应时间：在某一固定的条件下，反应达到平衡的时间是比较衡定的，氯胺比较衡定的，氯胺-T法反应时间一般在一分钟以内；和氯胺法反应时间一般在一分钟以内；和氯胺-T用用量一样增加反应时间非但不能提高碘化率量一样增加反应时间非但不能提高碘化率,反而会因为碘源反而会因为碘源,氧化氧化剂等因素而加大标记化合物的损伤；把反应时间控制在最小是合剂等因素而加大标记化合物的损伤；把反应时间控制在最小是合理的。理的。7)关于终止反应：可通过扩大反应体积或用还原剂如偏重亚关于终止反应：可通过扩大反应体积或用还原剂如偏重亚硫酸钠，其用量为氯胺硫酸钠，其用量为氯胺-T用量的用量的1-2倍倍.而用量过大不仅无助于提高标记率反而会明显降低标记化合物的免疫23二二.乳过氧化物酶法乳过氧化物酶法(LPO)1.原理原理:在含有低浓度的过氧化氢条件下，乳过氧化物酶可以使过氧在含有低浓度的过氧化氢条件下，乳过氧化物酶可以使过氧化氢把负一价碘离子氧化成带正电的碘离子，从而达到碘化的目化氢把负一价碘离子氧化成带正电的碘离子，从而达到碘化的目的。该方法为一酶促反应，底物由过氧化氢，碘和被标记的酚化的。该方法为一酶促反应，底物由过氧化氢，碘和被标记的酚化合物组成。其反应如下合物组成。其反应如下:二.乳过氧化物酶法(LPO)242.LPO和和CL-T法的比较法的比较:LPO法由于过氧化氢的浓度低而副反应少，其标记位点限法由于过氧化氢的浓度低而副反应少，其标记位点限于于LPO能接近的位置，即蛋白分子的表面，远离活性中心；有能接近的位置，即蛋白分子的表面，远离活性中心；有定向特征；其标记产物活性保存较好；定向特征；其标记产物活性保存较好；LPO标记主要作用在立标记主要作用在立体构型上有利于酶缔合的含有酪氨酰基和少量组氨酸残基的蛋体构型上有利于酶缔合的含有酪氨酰基和少量组氨酸残基的蛋白或多肽，这和白或多肽，这和CL-T法相同。二者不同之处是法相同。二者不同之处是:CL-T法不仅限法不仅限于分子表面，分子空间因子对标记的影响不大，而后者于分子表面，分子空间因子对标记的影响不大，而后者(LPO)则则受分子空间因子影响，受分子空间因子影响，CL-T法标记咪唑基困难，而法标记咪唑基困难，而LPO可以较可以较容易的标记组氨酸，除此而外容易的标记组氨酸，除此而外LPO法可用以标记各种细胞及细法可用以标记各种细胞及细胞膜。胞膜。2.LPO和CL-T法的比较:253.LPO法标记条件的探讨法标记条件的探讨:1)反应温度的影响：不同实验内容最适温度各异，通常介于反应温度的影响：不同实验内容最适温度各异，通常介于20-37，本室选用，本室选用20。2)反应时间的影响：理论上每克分子酶每分钟催化反应时间的影响：理论上每克分子酶每分钟催化6.5103克克分子碘进入蛋白。但实验表明其标记率和时间的相关曲线类似于分子碘进入蛋白。但实验表明其标记率和时间的相关曲线类似于CL-T法，达反应平衡的时间远大于法，达反应平衡的时间远大于CL-T法，一般在数分钟之内。法，一般在数分钟之内。3)PH的影响：过氧化物酶在酸性环境中活性最好，有人认为的影响：过氧化物酶在酸性环境中活性最好，有人认为最佳最佳PH以以4.5-5为宜。但实际工作的最佳为宜。但实际工作的最佳PH并不尽相同，其范围并不尽相同，其范围在在3-8之间，这可能由于在不同之间，这可能由于在不同PH环境中蛋白质活性基团的游离，环境中蛋白质活性基团的游离，暴露程度不同有关。暴露程度不同有关。4)过氧化物酶的用量：浓度过低不能有效的碘化，浓度过高过氧化物酶的用量：浓度过低不能有效的碘化，浓度过高碘利用率增加并不显著，而且还能造成自身标记，通常其用量应碘利用率增加并不显著，而且还能造成自身标记，通常其用量应少于被标记蛋白的少于被标记蛋白的1-10%。标记。标记200g的的IgG酶的用量为酶的用量为25g。3.LPO法标记条件的探讨:265)过氧化氢的用量：过氧化氢的用量：过氧化氢系强氧化剂，高浓度过氧化氢过氧化氢系强氧化剂，高浓度过氧化氢(100g分子分子)可抑制可抑制过氧化物酶活性，而且损伤被标记蛋白的活性，过氧化氢浓度过低过氧化物酶活性，而且损伤被标记蛋白的活性，过氧化氢浓度过低致使碘化率太低。一般一克分子的碘用一克分子的过氧化氢为宜。致使碘化率太低。一般一克分子的碘用一克分子的过氧化氢为宜。该方法另一应注意的问题是；过氧化氢不稳定需用前稀释。该方法另一应注意的问题是；过氧化氢不稳定需用前稀释。为了克服过氧化氢对酶和蛋白的损伤作用，有人对此方法进行为了克服过氧化氢对酶和蛋白的损伤作用，有人对此方法进行了改进，利用葡萄糖氧化酶和了改进，利用葡萄糖氧化酶和D-葡萄糖相作用缓慢释放过氧化氢以葡萄糖相作用缓慢释放过氧化氢以减少其抑制和损伤作用。本方法的另一改进是将过氧化物酶偶联到减少其抑制和损伤作用。本方法的另一改进是将过氧化物酶偶联到Sepharose上，固定化酶有利于克服酶自上，固定化酶有利于克服酶自身标记的问题。总之该方法身标记的问题。总之该方法条件温和，标记损伤小是一较为普遍使用的标记方法。条件温和，标记损伤小是一较为普遍使用的标记方法。5)过氧化氢的用量：274.LPO法对脂肪的碘化法对脂肪的碘化:LPO法可以碘化标记磷酸脂，三丙烯酰甘油脂法可以碘化标记磷酸脂，三丙烯酰甘油脂,游游离脂肪酸，溶血磷脂及完整细胞上的脂质，其催化位置离脂肪酸，溶血磷脂及完整细胞上的脂质，其催化位置在饱和及不饱和脂肪酸上进行。在饱和及不饱和脂肪酸上进行。5.LPO法标记对活细胞及细胞膜的碘化法标记对活细胞及细胞膜的碘化:由于由于LPO法标记位点仅限于酶分子所能到达的部位，法标记位点仅限于酶分子所能到达的部位，而细胞膜表面可供碘化的蛋白质分子大量存在，所以严而细胞膜表面可供碘化的蛋白质分子大量存在，所以严格限制条件可以标记活细胞或细胞膜格限制条件可以标记活细胞或细胞膜(具体方法略具体方法略)。注意点注意点:1):1)标记物如果作为探针用必须严格限制标记物如果作为探针用必须严格限制125125I I2 2的生成的生成,防止其进入细胞内侧防止其进入细胞内侧.2).2)碘化细胞膜时要先碘化碘化细胞膜时要先碘化标记然后再分离细胞膜，以消除细胞的自分解干扰。标记然后再分离细胞膜，以消除细胞的自分解干扰。3)3)为排除细胞内系统催化的碘化和对碘氧化的影响，应同为排除细胞内系统催化的碘化和对碘氧化的影响，应同时作对照实验。时作对照实验。4)4)可溶性蛋白较膜蛋白更易碘化，所以可溶性蛋白较膜蛋白更易碘化，所以标记前需充分洗涤，并加蛋白水解酶抑制剂。标记前需充分洗涤，并加蛋白水解酶抑制剂。4.LPO法对脂肪的碘化:28四四.Iodogen法法1.原理原理:Iodogen(氯甘脲氯甘脲)化学名称为化学名称为1,3,4,6-四氯四氯-3,6-二苯基二苯基甘脲。甘脲。该物质不溶于水，但可溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶该物质不溶于水，但可溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂。它是一较温和的氧化剂，其标记原理和剂。它是一较温和的氧化剂，其标记原理和CL-T法，法，LPO法相似。法相似。2.特点：特点：Iodogen法实际上是一固相氧化剂，条件温和而且易于法实际上是一固相氧化剂，条件温和而且易于控制，它既可以象控制，它既可以象LPO法一样碘化暴露在外的酪氨酸法一样碘化暴露在外的酪氨酸,组氨酸残基，组氨酸残基，也可以象也可以象CL-T一样在碘化酪氨酸残基时不受分子空间因素的影响。一样在碘化酪氨酸残基时不受分子空间因素的影响。利用其不溶于水的特点可以简便地进行细胞标记利用其不溶于水的特点可以简便地进行细胞标记(方法略方法略)。这一方。这一方法目前受到广泛的应用。法目前受到广泛的应用。四.Iodogen法 2.特点：Iodo29三三.电解标记法电解标记法1.原理：原理：碘化反应在坩埚内进行，阴阳极用半透膜分开，阳极碘化反应在坩埚内进行，阴阳极用半透膜分开，阳极区含有被标记的蛋白质和碘源，控制极间电压使氧化电势区含有被标记的蛋白质和碘源，控制极间电压使氧化电势高到能使高到能使I-氧化成氧化成I2，但又低到使任何氨基酸不被氧化，但又低到使任何氨基酸不被氧化，从而达到碘化的目的。从而达到碘化的目的。2.特点：条件温和，蛋白质不和氧化剂接触损伤小，特点：条件温和，蛋白质不和氧化剂接触损伤小，条件易于控制适合较大量蛋白质的碘化，缺点是装置复杂，条件易于控制适合较大量蛋白质的碘化，缺点是装置复杂，通常被标记的蛋白质量较大。通常被标记的蛋白质量较大。三.电解标记法30四四.间接标记法间接标记法1.原理：这种方法是将原理：这种方法是将*I用用CL-T法标记到活泼的化学试剂上，法标记到活泼的化学试剂上，然后将该试剂连接到欲标记的分子上，目前较为成熟的是然后将该试剂连接到欲标记的分子上，目前较为成熟的是Bolton-Hunter试剂，化学名为试剂，化学名为3-(对对-羟基苯羟基苯)丙酸丙酸-N琥珀亚胺酯琥珀亚胺酯(HPNS)，首先用首先用CL-T法将法将HPNS碘化，然后以此酰化剂与蛋白质分子中的游碘化，然后以此酰化剂与蛋白质分子中的游离氨基酸相缩合而引入蛋白质分子中，反应如下离氨基酸相缩合而引入蛋白质分子中，反应如下:四.间接标记法31放射性核素标记技术课件322.特点：由于该方法碘化标记的不是酪氨酸，而是自由的赖特点：由于该方法碘化标记的不是酪氨酸，而是自由的赖氨酸残基，所以特别适用于缺乏酪氨酸或酪氨酸位于活性中心，氨酸残基，所以特别适用于缺乏酪氨酸或酪氨酸位于活性中心，引入碘后就会导致失活的蛋白质。例如引入碘后就会导致失活的蛋白质。例如PA(proteinA)的的4个酪氨个酪氨酸残基有一个被碘化，则酸残基有一个被碘化，则PA将失去结合将失去结合IgG的的Fc能力，故应选用能力，故应选用这种方法。这种方法既避免了蛋白质与氧化这种方法。这种方法既避免了蛋白质与氧化剂的接触，也不和碘剂的接触，也不和碘直接接触；所以损伤最小；缺点是二步反应，碘利用率低，标记直接接触；所以损伤最小；缺点是二步反应，碘利用率低，标记物比活度低，不适用于短肽的标记。物比活度低，不适用于短肽的标记。五五.合成法合成法(偶合法偶合法)标记标记用化学合成法引进放射性同位素在用化学合成法引进放射性同位素在3H，14C标记中极为普遍。标记中极为普遍。碘标记中亦有同样的应用，如欲标记碘标记中亦有同样的应用，如欲标记T2定位将碘标记在定位将碘标记在3，5内环内环位置上，由于内环不能发生置换，取代反应。所以首先把酪氨酸位置上，由于内环不能发生置换，取代反应。所以首先把酪氨酸碘化成碘化成4-羟羟3-5二碘苯基丙酮酸，然后再和非放射性二碘苯基丙酮酸，然后再和非放射性4-羟羟3-5二碘苯二碘苯基丙酮酸偶合，脱盐再用次磷酸和氢碘酸加热去掉基丙酮酸偶合，脱盐再用次磷酸和氢碘酸加热去掉3,5位的碘位的碘,即即得到得到T2(3,5).该方法的优点是可进行定位标记；产率高。该方法的优点是可进行定位标记；产率高。2.特点：由于该方法碘化标记的不是酪氨酸，33标记物的纯化标记物的纯化 当碘化反应终止后可选用各种生化或物理方法当碘化反应终止后可选用各种生化或物理方法将被碘化的物质和游离碘分离，各种方法原理不同，将被碘化的物质和游离碘分离，各种方法原理不同，特性各异要根据实验具体情况来选择。常用的方法特性各异要根据实验具体情况来选择。常用的方法有透析、电泳、各种色谱技术等，透析法简单易行，有透析、电泳、各种色谱技术等，透析法简单易行，回收率较高。但要注意低温和在透析袋外加回收率较高。但要注意低温和在透析袋外加KI载载体。对于某些不稳定的标记物常用分子筛体。对于某些不稳定的标记物常用分子筛Sephadex层析，它不仅可分离游离碘，而且还可层析，它不仅可分离游离碘，而且还可以将标记中的损伤，变性物除去。对于某些定位标以将标记中的损伤，变性物除去。对于某些定位标记的物质，可因碘在不同的位置所致电泳速度不同记的物质，可因碘在不同的位置所致电泳速度不同而借助电泳技术予分离。而借助电泳技术予分离。标记物的34放射性核素标记技术课件35标记物的质量鉴定标记物的质量鉴定1.比放射性测定：比放射性测定：投碘量投碘量碘利用率碘利用率比放射性比放射性()=-100投蛋白质量投蛋白质量比放射性的测定方法：比放射性的测定方法：1）依上述公式直接计算，其中碘利用率的计算方法有）依上述公式直接计算，其中碘利用率的计算方法有:A)有机酸有机酸(如三氯醋酸如三氯醋酸)沉淀法。沉淀法。B)收集洗脱液并绘出层析谱，然后根据蛋白收集洗脱液并绘出层析谱，然后根据蛋白质峰和游离碘峰计算碘利用率。质峰和游离碘峰计算碘利用率。C)取小样作纸层析，根据扫描图计取小样作纸层析，根据扫描图计算碘利用率。算碘利用率。2）用该标记作放免分析标准曲线，以）用该标记作放免分析标准曲线，以T/B对浓度作图，以交于对浓度作图，以交于X轴所代表的该标记物质量和加入标记物的放射性相比轴所代表的该标记物质量和加入标记物的放射性相比(Bq/mol)，即，即为该标记物的比放射性。为该标记物的比放射性。标记物的质量鉴定363）自身取代法）自身取代法:制备标准曲线，在同等条件下加入一定量制备标准曲线，在同等条件下加入一定量的该标记物，分离、测定并计算其取代比率，求出比放射的该标记物，分离、测定并计算其取代比率，求出比放射性。性。3）自身取代法:制备标准曲线，在同等条件下加入一定量的该标记374)选用和被测标记物能谱相差较大的另一种同位素标记该物选用和被测标记物能谱相差较大的另一种同位素标记该物质，以待测标记物作标准曲线，以另一种示踪物的不同浓度作为质，以待测标记物作标准曲线，以另一种示踪物的不同浓度作为样品加入反应体系，同时双道测定两种同位素放射性，求其抑制样品加入反应体系，同时双道测定两种同位素放射性，求其抑制比率，从而计算其比放射性。比率，从而计算其比放射性。实验目的不同所要求的比放射性亦有所不同，对实验目的不同所要求的比放射性亦有所不同，对RIA高比放射高比放射性有利提高方法的灵敏度性有利提高方法的灵敏度,但对但对RBA标记物分子最好是一个分子标标记物分子最好是一个分子标记一个碘原子最为理想。记一个碘原子最为理想。2.放化纯度放化纯度:标记后要通过不同的方法将游离碘和被标记的蛋白质分开，分标记后要通过不同的方法将游离碘和被标记的蛋白质分开，分离的效果直接影响放化纯度鉴定方法包括各种层析离的效果直接影响放化纯度鉴定方法包括各种层析 技术技术(常用的柱层析常用的柱层析,硅胶板硅胶板,纸层析等纸层析等)，电泳等。标记贮存一定时，电泳等。标记贮存一定时间后由于放射损伤，脱碘等原因引起放化纯度下降，须用同样的方间后由于放射损伤，脱碘等原因引起放化纯度下降，须用同样的方法进一步纯化，放化纯一般应法进一步纯化，放化纯一般应90%。4)选用和被测标记物能谱相差较大的另一383.活性鉴定活性鉴定活性鉴定因不同实验内容而不同，活性鉴定因不同实验内容而不同，RIA中主要检查标记物的免疫原性，非特中主要检查标记物的免疫原性，非特异结合异结合(NSB)85%。RBA则则主要检查其生物活性，虽然具体指标不同，但内容基本相同。主要检查其生物活性，虽然具体指标不同，但内容基本相同。4.稳定性稳定性导致标记的蛋白质，多肽生物活性和免疫活性损伤，改变的主要因素有导致标记的蛋白质，多肽生物活性和免疫活性损伤，改变的主要因素有:1)蛋白质分子上碘原子的参入量蛋白质分子上碘原子的参入量:由于碘置换到酪氨酸残基系非同位素的非理由于碘置换到酪氨酸残基系非同位素的非理想标记，所以碘化程度对其生物活性的改变就有决定的影响，引入碘的数目越少，想标记，所以碘化程度对其生物活性的改变就有决定的影响，引入碘的数目越少，活性改变就越小。反之亦然，所以比放射性要控制在一定的范围。同等的碘参入活性改变就越小。反之亦然，所以比放射性要控制在一定的范围。同等的碘参入量对不同的物质所造成的活性改变也不相同，这和蛋白质本身的特性及分子量的量对不同的物质所造成的活性改变也不相同，这和蛋白质本身的特性及分子量的大小有关。大小有关。2)酪氨酸在被标记物的位置和地位对标记的稳定有重要关系。如前所述，如酪酪氨酸在被标记物的位置和地位对标记的稳定有重要关系。如前所述，如酪氨酸位于活性中心则碘化很容易造成标记物的损伤。氨酸位于活性中心则碘化很容易造成标记物的损伤。3)氧化反应损伤氧化反应损伤:氧化损伤是由氧化剂和碘分子引起，主要涉及蛋氨酸、色氨氧化损伤是由氧化剂和碘分子引起，主要涉及蛋氨酸、色氨酸及二硫键。酸及二硫键。4)辐射损伤辐射损伤:高比放射性时射线可引起标记物聚合，二硫键断裂致使标记物失高比放射性时射线可引起标记物聚合，二硫键断裂致使标记物失活，另一方面射线可造成溶液水电离而损伤标记物。为此标记物需贮存在低温，活，另一方面射线可造成溶液水电离而损伤标记物。为此标记物需贮存在低温，有有BSA或其它还原剂的溶液中贮存。或其它还原剂的溶液中贮存。3.活性鉴定 39标记化合物比活度贮存状态贮存温度贮存浓度14C标记化合物氨基酸核苷酸碳水化合物与核苷甾体化合物3H标记化合物氨基酸核苷酸碳水化合物与核苷甾体化合物32P-核苷酸35S-氨基酸125I-三碘甲腺原氨酸125I-甲状腺素低高低高低高低高低高低高低高低高低55.5GBq/mg1.85GBq/mg1.48GBq/mg冷冻干燥体含2%乙醇的灭菌水溶液含50%乙醇的缓冲溶液冷冻干燥固体含2%乙醇的灭菌水溶液含5-10%乙醇的苯溶液冷冻干燥固体含2%乙醇的水溶液含2%乙醇水溶液含2%乙醇的水溶液含乙醇的苯溶液含50%乙醇的溶液水溶液（冲氮气）水溶液（含0.1%巯醇）乙醇：水=3：150%丙二醇水溶液-200C/00C-200C00C-200C20C/-1400C20C20C-200C20C20C/-1400C -200C/-1400C-800C 20C/-1400C20C20C1.85-3.7MBq/ml1.85-3.7MBq/ml1.85-3.7MBq/ml37MBq/ml37MBq/ml37MBq/ml37MBq/ml185MBq/ml185MBq/ml11-15MBq/ml37MBq/ml11.1MBq/ml标记化合物比活度贮存状态贮存温度贮存浓度14C标记化合物低冷40放射性核素标记技术课件41放射性核素标记技术课件42放射性核素标记技术课件43