放射免疫测定法课件

第五节、放射免疫测定法第五节、放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)第五节、放射免疫测定法(Radioimmunoassay,一、基本概念一、基本概念放射免疫测定（放射免疫测定（RAI）：根据抗原抗体特异性结合的）：根据抗原抗体特异性结合的原理，以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的原理，以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的多少定性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。多少定性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。同位素（同位素（isotope）：元素周期表中处于相同位置的某）：元素周期表中处于相同位置的某种元素所包含的若干种核素。种元素所包含的若干种核素。放射性核素（放射性核素（radionuclide）：由于核内中子数和质子）：由于核内中子数和质子数的比例不适而自发地发生核衰变，在衰变过程中将放数的比例不适而自发地发生核衰变，在衰变过程中将放射出一种或几种射线而转变为别种核素的不稳定核素。射出一种或几种射线而转变为别种核素的不稳定核素。一、基本概念放射免疫测定（RAI）：根据抗原抗体特异性结合的 1959年年 Yalow和和Berson建立放射免疫测定（建立放射免疫测定（RIA）1960年年 竞争性蛋白结合分析（竞争性蛋白结合分析（CPBA）1968年年 Miles和和Hales建立免疫放射量度分析建立免疫放射量度分析（IRMA）1968年年 放射受体分析法放射受体分析法(RRA)1971年年 Addison和和Hales建立双位点或夹心建立双位点或夹心IRMARIA方法学研究进展方法学研究进展 1959年 Yalow和Berson建立放射免疫测定（基本原理：放射性标记的已知抗原（基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag）和非标记的）和非标记的待检抗原（待检抗原（Ag）同时与限量的特异性抗体进行竞争结合）同时与限量的特异性抗体进行竞争结合或竞争性抑制反应，通过测定结合（或竞争性抑制反应，通过测定结合（*Ag-Ab）的或游）的或游离（离（*Ag）的放射性标记抗原的量，根据标准曲线即可）的放射性标记抗原的量，根据标准曲线即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。推算出被测物含量的一种超微量分析技术。RAI属超微量分析技术，常用于胰岛素、生长激素、药属超微量分析技术，常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。物等微量物质的测定。二、二、RIA原理原理基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag）和非标记的待检抗原（Ag *Ag Ab Bound Free B F B/F10.500.500.670.3320.50.330.670.20.170.83竞争放射分析原理示意图竞争放射分析原理示意图Ag *Ag Ab 常用标记放射性同位素及其性质常用标记放射性同位素及其性质放射性元素放射性元素半衰期半衰期射线种类及能量（百万电子伏特）射线种类及能量（百万电子伏特）14C5720年年0.1553H12.5年年0.0189 125I60天天0035 131I8.05天天0.608，0.335，0.2500.364，0.637，0.722常用标记放射性同位素及其性质放射性元素半衰期射线种类及能量（125I的优点的优点 29种同位素，种同位素，125I最为常用；最为常用；半衰期适中半衰期适中(60天天)，易于商品化和储存，也利于废物处理；，易于商品化和储存，也利于废物处理；发射低能发射低能35kV 线易于测量，井型闪烁效率高；线易于测量，井型闪烁效率高；不发射不发射粒子，标记物自分解速度低；粒子，标记物自分解速度低；标记过程中，标记物免疫损伤小；标记过程中，标记物免疫损伤小；化学性质活泼，标记化学性质活泼，标记Ag和和Ab容易，可得到多种标记物而容易，可得到多种标记物而广泛应用。广泛应用。125I的优点 29种同位素，125I最为常用；放射性核素标记物制备的主要方法放射性核素标记物制备的主要方法氯胺氯胺T法法活化活化NaI中放射性碘离子中放射性碘离子乳过氧化酶法乳过氧化酶法催化过氧气化氢释放新生态氧，使催化过氧气化氢释放新生态氧，使125I离子活化离子活化双酶标记法双酶标记法葡萄糖氧化酶提供过氧化氢作为乳过氧化酶底物葡萄糖氧化酶提供过氧化氢作为乳过氧化酶底物氯甘脲标记法氯甘脲标记法活化活化NaI中放射性碘离子中放射性碘离子放射性核素标记物制备的主要方法氯胺T法活化NaI中放射性碘离放射性同位素标记化合物的纯化方法放射性同位素标记化合物的纯化方法凝胶过滤法凝胶过滤法分离标记蛋白与无机碘分离标记蛋白与无机碘离子交换法离子交换法用于分离纯化短肽标记物用于分离纯化短肽标记物透析法透析法将标记蛋白与小分子化合物很好地分离将标记蛋白与小分子化合物很好地分离电泳法电泳法分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质亲和层析法亲和层析法利用特异抗体或受体结合分离、纯化标记蛋白质利用特异抗体或受体结合分离、纯化标记蛋白质高效液相层析法高效液相层析法分离效果好、快速分离效果好、快速ConA吸附法吸附法分离标记糖蛋白分离标记糖蛋白放射性同位素标记化合物的纯化方法凝胶过滤法分离标记蛋白与无机二、二、RIA操作程序操作程序配制已知浓度系列标准抗原（配制已知浓度系列标准抗原（Ag）加待测抗原（加待测抗原（Ag）和抗体（）和抗体（Ab）-温育温育加标记抗原（加标记抗原（*Ag）和抗体（）和抗体（Ab）-温育温育分离复合物分离复合物*AgAb（B）和游离）和游离*Ag（F）用用计数器测量放射性计数计数器测量放射性计数根据标准曲线或计算机直接算出根据标准曲线或计算机直接算出二、RIA操作程序配制已知浓度系列标准抗原（Ag）5.5.测量测量4.4.去上清分离去上清分离立即立即1.1.加样加样1.样品或标准品样品或标准品2.标记物标记物3.抗血清抗血清混匀混匀温浴温浴2.2.加分离剂加分离剂分离剂分离剂混匀混匀3.3.离心离心5.测量4.去上清分离立即1.加样1.样品或标准品混匀温浴2动态平衡体系中动态平衡体系中:*Ag与与Ag具有同样的免疫活性和结合反应能力具有同样的免疫活性和结合反应能力 *Ag和和Ab的量恒定的量恒定 Ag+*Ag的分子数大于抗体的分子数的分子数大于抗体的分子数*Ag与与Ag相互竞争同相互竞争同Ab结合，彼此抑制，待测结合，彼此抑制，待测Ag与与*AgAb呈负相关函数关系测抗原（呈负相关函数关系测抗原（Ag）和抗体）和抗体（Ab）-温育温育动态平衡体系中:沉淀法沉淀法加涂有右旋糖酐的活性碳（加涂有右旋糖酐的活性碳（DCCDCC）吸附小分子）吸附小分子F F，离心，离心吸附法吸附法调调pHpH值于值于球蛋白等电点，加入适当浓度球蛋白等电点，加入适当浓度PEGPEG或中性盐或中性盐过滤法过滤法小分子游离的放射性物质小分子游离的放射性物质F F被抽吸通过滤膜而分离被抽吸通过滤膜而分离双抗体法双抗体法固相法固相法SPASPA法法入第二抗体，形成第二抗体复合物，离心入第二抗体，形成第二抗体复合物，离心抗体或抗原固相化，免疫反应在固相载体上完成后洗涤抗体或抗原固相化，免疫反应在固相载体上完成后洗涤金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌A A蛋白促使蛋白促使AgAbAgAb较快速度沉淀较快速度沉淀结合抗原结合抗原(B)与游离抗原与游离抗原(F)分离方法分离方法沉淀法加涂有右旋糖酐的活性碳（DCC）吸附小分子F，离心吸附三、三、三、三、RIARIA法标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制曲线来表示。标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制曲线来表示。这种曲线表示了结合抑制的程度与抑制物浓度两者之间的这种曲线表示了结合抑制的程度与抑制物浓度两者之间的特定函数关系，也称为剂量反应曲线。特定函数关系，也称为剂量反应曲线。标准曲线的手工绘制形态标准曲线的手工绘制形态 标准曲线的形态可因所用的反应变量表达形式的不同，标准曲线的形态可因所用的反应变量表达形式的不同，或所采用坐或所采用坐 标系统不同而有不同的形态。标系统不同而有不同的形态。标准曲线的基本数学函数式标准曲线的基本数学函数式 放射免疫分析从抗原抗体反应动力学分析，反应是双放射免疫分析从抗原抗体反应动力学分析，反应是双向性的，服从质量作用定律。向性的，服从质量作用定律。三、RIA法标准曲线标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制 7550 30 100110100 1000未标记抗原浓度（未标记抗原浓度（ng/ml)结合结合/未结合的放射活性（未结合的放射活性（%）待测待测AgAg与与*AgAbAgAb呈负相关函数关系呈负相关函数关系 7550 30 100110100 1000未标记抗原浓RIA竞争抑制曲线类型竞争抑制曲线类型注：横坐标为标记抗原（注：横坐标为标记抗原（*Ag）的浓度）的浓度RIA竞争抑制曲线类型四、建立放射免疫分析方法的必备条件四、建立放射免疫分析方法的必备条件对标准抗原的基本要求对标准抗原的基本要求 (1)标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致。标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致。(2)抗原必须纯度高。抗原必须纯度高。(3)标准抗原的量必须准确。标准抗原的量必须准确。(4)标准抗原应有很好的稳定性。标准抗原应有很好的稳定性。对抗血清的要求对抗血清的要求 抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。检查抗血清质量的指标主要抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。检查抗血清质量的指标主要 有亲和常数有亲和常数(K)、免疫交叉反应率及滴度、免疫交叉反应率及滴度(或抗体效价或抗体效价)。对标记抗原的要求对标记抗原的要求 (1)标记抗原的免疫活性与待测抗原及标准品必须一致。标记抗原的免疫活性与待测抗原及标准品必须一致。(2)标记抗原要有适当高的放射性比活度。标记抗原要有适当高的放射性比活度。(3)标记抗原应具有足够高的放射化学纯度标记抗原应具有足够高的放射化学纯度四、建立放射免疫分析方法的必备条件对标准抗原的基本要求衡量抗体质量的指标衡量抗体质量的指标亲和力亲和力:抗体结合的强度是抗体结合的强度是RIA的前提的前提特异性特异性:不受交叉反应物质影响的程度不受交叉反应物质影响的程度滴度滴度:抗体的效价抗体的效价抗体实际应用时的稀释倍数抗体实际应用时的稀释倍数衡量抗体质量的指标亲和力:抗体结合的强度是RIA的前提斜率斜率KAKAB/FB/F3 30 01 1Ag-Ab浓度浓度亲和力测定（亲和力测定（Scatchard作图）作图）斜率KAB/F301Ag-Ab浓度 100 50 01 2 3 4 5 6复合物放射性复合物放射性Log竞争剂浓度竞争剂浓度特异性的测定交叉反应检测特异性的测定交叉反应检测交叉反应率交叉反应率 A50/B50100A AB BC C 1 2 3 B%100 80 60 40 20 0100 1000 10000 100000100 1000 10000 100000抗血清稀释度抗血清稀释度抗体滴度测定抗体滴度测定B%100 1000 10000 10000五、放射免疫分析的设计方法五、放射免疫分析的设计方法 标讥抗原和抗体用量最佳化设计标讥抗原和抗体用量最佳化设计:1 1、标记抗原用量选择。、标记抗原用量选择。2 2、抗血清的使用滴度选择及其方法。、抗血清的使用滴度选择及其方法。标准抗原剂量设计标准抗原剂量设计 1 1、标准抗原剂量范围、标准抗原剂量范围 2 2、标准曲线工作范围、标准曲线工作范围 加样顺序设计加样顺序设计 反应介质反应介质 反应容积与温度及时间反应容积与温度及时间 1 1、缩缩小小反反应应容容积积可可相相应应减减少少抗抗体体和和标标记记抗抗原原的的绝绝对对用用量量，使使非标记抗原的竞争力相应增强，有利于提高灵敏度。非标记抗原的竞争力相应增强，有利于提高灵敏度。2 2、抗抗原原、抗抗体体结结合合反反应应的的平平衡衡结结合合常常数数K K与与温温度度有有关关，必必须须通通过实验来确定最佳工作条件。过实验来确定最佳工作条件。与与F F分离方法选择分离方法选择 样品采集与保存样品采集与保存五、放射免疫分析的设计方法 标讥抗原和抗体用量最佳化设计:六、放射免疫分析的质量控制六、放射免疫分析的质量控制 误差和放射免疫误差的来源误差和放射免疫误差的来源 (1)(1)误差及其分类误差及其分类 (2)(2)放射免疫分析误差来源放射免疫分析误差来源 掌握质量控制与质控样品掌握质量控制与质控样品 (1)(1)放射免疫分析的质量控制内容放射免疫分析的质量控制内容 (2)(2)质量控制样品质量控制样品 质量控制指标：灵敏度、精密度、偏倚和准确度、特异性、质量控制指标：灵敏度、精密度、偏倚和准确度、特异性、稳定性、临床有效性。稳定性、临床有效性。实验室内部质量控制：精密度的评价、批内偏倚的评价和实验室内部质量控制：精密度的评价、批内偏倚的评价和批间重现性评价。批间重现性评价。实验室间的外部质量评价。实验室间的外部质量评价。六、放射免疫分析的质量控制 误差和放射免疫误差的来源(一一)、液相法、液相法已知放射标记抗原已知放射标记抗原待检非标记抗原待检非标记抗原+抗原抗原抗体抗体抗原抗体结合抗原抗体结合+分离分离 沉淀物沉淀物抗原抗体复合物抗原抗体复合物上清液中上清液中游离抗原游离抗原七、七、RIA技术类型和应用技术类型和应用(一)、液相法已知放射标记抗原待检非标记抗原+抗原抗体抗原抗1.直接法直接法IRMA示意图示意图标记抗体标记抗体 抗原抗原固相抗原固相抗原离心离心测定测定（二）、固相法二）、固相法二）、固相法二）、固相法1.直接法IRMA示意图标记抗体抗原固相抗原离心测定（二）2.双位点法双位点法IRMA示意图示意图测定测定标记抗体标记抗体洗涤洗涤抗体抗体抗原抗原2.双位点法IRMA示意图测定标记抗体洗涤抗体抗原八、免疫放射分析（八、免疫放射分析（IRMA）基本原理：用过量的核素标记抗体与待测抗原形成复合基本原理：用过量的核素标记抗体与待测抗原形成复合物，并用固相免疫吸附剂作为物，并用固相免疫吸附剂作为B或或F的分离手段除去多的分离手段除去多余的游离抗体，测量抗原抗体复合物的放射性。余的游离抗体，测量抗原抗体复合物的放射性。Ag *Ab Ag*Ab八、免疫放射分析（IRMA）基本原理：用过量的核素标记抗固相抗体固相抗体抗原抗原过量的标记抗体过量的标记抗体抗原抗原固相抗原固相抗原过量标记的抗体过量标记的抗体双位点双位点IRMA 单位点单位点IRMA 固相抗体抗原过量的标记抗体抗原固相抗原过量标记的抗体双位点I结合率（结合率（%）Ag剂量剂量RIAIRMAIRMA和和RIARIA曲线形态比较曲线形态比较结合率（结合率（%）Ag剂量剂量IRMA结合率（%）Ag剂量RIAIRMA和RIA曲线形态比较结合率IRMA与与RIA的工作原理的主要区别的工作原理的主要区别项目项目RIARIAIRMAIRMA反应机制反应机制竞争性反应竞争性反应非竞争性全量反应灵敏度提高非竞争性全量反应灵敏度提高（10-100倍）倍）反应试剂反应试剂三种三种 标记抗原标记抗原二种二种 标记抗体标记抗体分离方法分离方法抗原只需一个抗原只需一个抗原决定簇抗原决定簇 一般需单抗作分离剂，抗原需一般需单抗作分离剂，抗原需两个或两个以上决定簇两个或两个以上决定簇待测抗原复合物待测抗原复合物放射性放射性 与待测抗原呈负相关与待测抗原呈负相关与待测抗原呈正相关与待测抗原呈正相关非特异性结合非特异性结合主要影响高剂量反应主要影响高剂量反应主要影响低剂量反应主要影响低剂量反应待检抗原性质待检抗原性质半抗原及大分子半抗原及大分子蛋白质、酶等生物大分子蛋白质、酶等生物大分子IRMA与RIA的工作原理的主要区别项目RIAIRMA反应机