抗体标记课件

第十五讲第十五讲抗体的标记抗体的标记第十五讲抗体的标记1抗体的纯化原理、方法抗体的纯化原理、方法v抗体分子有一定的等电点、溶解度、核电性及疏抗体分子有一定的等电点、溶解度、核电性及疏水性，可以用电泳、盐析沉淀或其他层析技术进水性，可以用电泳、盐析沉淀或其他层析技术进行分离、纯化行分离、纯化v根据抗体的用途和来源，确定具体的纯化方法根据抗体的用途和来源，确定具体的纯化方法v标记抗体选择特异性好的亲和柱进行纯化标记抗体选择特异性好的亲和柱进行纯化抗体的纯化原理、方法抗体分子有一定的等电点、溶解度、核电性及2抗体的预处理v过滤：去除脂质颗粒、纤维蛋白和固体颗粒过滤：去除脂质颗粒、纤维蛋白和固体颗粒v低速离心：去除细胞残渣及小颗粒物质，适用于低速离心：去除细胞残渣及小颗粒物质，适用于 血血清、腹水和细菌培养上清清、腹水和细菌培养上清v二氧化硅吸附：适用含大量脂质的腹水、血清二氧化硅吸附：适用含大量脂质的腹水、血清 1.1.用等量的巴比妥缓冲液稀释腹水或血清用等量的巴比妥缓冲液稀释腹水或血清 2.2.加入一定量的二氧化硅粉末，室温搅拌加入一定量的二氧化硅粉末，室温搅拌30min30min 3.2000rpm 3.2000rpm离心离心20min20min，留取上清，留取上清抗体的预处理过滤：去除脂质颗粒、纤维蛋白和固体颗粒3抗体纯化亲和层析法v指在柱材基质上共价连接上配体，利用配体与指在柱材基质上共价连接上配体，利用配体与抗体之间可逆的特异性结合反应，在一定条件抗体之间可逆的特异性结合反应，在一定条件下，使抗体被柱子保留，而其余蛋白被洗掉，下，使抗体被柱子保留，而其余蛋白被洗掉，然后改变条件令抗体被洗脱下来然后改变条件令抗体被洗脱下来v常用配体：蛋白常用配体：蛋白A A、蛋白、蛋白G G或相应抗原或相应抗原抗体纯化亲和层析法指在柱材基质上共价连接上配体，利用配体与4蛋白A亲和层析法v蛋白蛋白A是金黄色葡萄球菌的胞壁蛋白，有是金黄色葡萄球菌的胞壁蛋白，有6个个IgG结合位点，结合位点，5个与个与Fc片段有很强的结合能力，片段有很强的结合能力，且各个位点与抗体的结合都是独立的且各个位点与抗体的结合都是独立的v一个蛋白一个蛋白A至少可以与两个至少可以与两个IgG分子结合，适分子结合，适合纯化合纯化IgG抗体抗体蛋白A亲和层析法蛋白A是金黄色葡萄球菌的胞壁蛋白，有6个Ig5蛋白G亲和层析法v蛋白蛋白G是是G群链球菌的细胞壁蛋白，可与群链球菌的细胞壁蛋白，可与IgG的的Fc区域结合区域结合v比蛋白比蛋白A亲和力强，但与白蛋白有微弱结合亲和力强，但与白蛋白有微弱结合v适合纯化适合纯化IgG抗体抗体蛋白G亲和层析法蛋白G是G群链球菌的细胞壁蛋白，可与IgG的6抗体的保存v防止细菌或真菌的污染：叠氮钠和柳硫汞防止细菌或真菌的污染：叠氮钠和柳硫汞v低温存储，忌反复冻融低温存储，忌反复冻融vpH在在78之间，盐浓度在之间，盐浓度在0150mMv抗体浓度抗体浓度110mg/ml为宜为宜v不标记抗体可加不标记抗体可加BSA作为稳定剂作为稳定剂抗体的保存防止细菌或真菌的污染：叠氮钠和柳硫汞7v液体保存：液体保存：抗体无菌处理，加入抗体无菌处理，加入0.02叠氮钠或叠氮钠或柳硫汞，柳硫汞，4保存保存0.51年；或再加入等体积甘油年；或再加入等体积甘油（含（含3Na2HPO412H2O），），4 保存更久保存更久v低温保存：低温保存：将抗体分管冻存，于将抗体分管冻存，于-20 或或-70 可存放数年可存放数年v冷冻干燥：冷冻干燥：适用纯化后的抗体溶液，冻成干粉于适用纯化后的抗体溶液，冻成干粉于4 存放存放45年年液体保存：抗体无菌处理，加入0.02叠氮钠或柳硫汞，4保8v抗体标记技术抗体标记技术是指用荧光素、放射性核素、酶、胶是指用荧光素、放射性核素、酶、胶体金、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为追踪体金、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为追踪物标记抗体进行的抗原、抗体反应，并借助于荧光物标记抗体进行的抗原、抗体反应，并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行定性和定结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行定性和定位研究或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液位研究或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液中的半抗原、抗原进行定性和定量测定中的半抗原、抗原进行定性和定量测定抗体标记技术是指用荧光素、放射性核素、酶、胶体金、铁蛋白及化9抗体的标记v放射性同位素标记放射性同位素标记v荧光素色素标记荧光素色素标记v酶标记酶标记v生物素标记生物素标记v胶体金标记胶体金标记抗体的标记放射性同位素标记10荧光素色素标记技术荧光素色素标记技术v基本原理：基本原理：将抗原、抗体反应的特异性和敏感性与将抗原、抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合，以荧光素作为标记物与显微示踪的精确性相结合，以荧光素作为标记物与已知的抗体结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原已知的抗体结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力，然后将荧光素标记的抗体作为标准试结合的能力，然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原，在荧光灯源紫外剂，用于检测和鉴定未知的抗原，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测性、定位或定量的检测荧光素色素标记技术基本原理：将抗原、抗体反应的特异性和敏感性11v荧光：荧光：一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给则发光瞬即停止起发光，停止能量供给则发光瞬即停止v荧光素：荧光素：是一种能吸收激发光的能量而产生荧光，是一种能吸收激发光的能量而产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物并能作为染料使用的有机化合物v要求：要求：具备能与蛋白质分子形成稳定的共价键结合具备能与蛋白质分子形成稳定的共价键结合 的化学基团，荧光效率高的化学基团，荧光效率高 标记抗体后不影响抗原抗体的结合反应标记抗体后不影响抗原抗体的结合反应 标记方法简便标记方法简便 游离的荧光素易与标记后的抗体分离游离的荧光素易与标记后的抗体分离荧光：一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量12v常用于标记抗体的荧光素：常用于标记抗体的荧光素：异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素（FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、四乙基罗丹明vFITC标记方法：标记方法：直接标记法、间接标记法、改良法直接标记法、间接标记法、改良法直接法：直接法：稀释抗体至稀释抗体至20mg/ml，电磁搅拌，电磁搅拌510分钟分钟 称取荧光素称取荧光素0.01mg荧光素荧光素/mg蛋白蛋白 将荧光素加入稀释抗体中，将荧光素加入稀释抗体中，510分钟加完分钟加完 搅拌搅拌1218h，离心，除去少量沉淀物装入，离心，除去少量沉淀物装入透析袋中，用透析袋中，用0.01M PBS透析，透析，4过夜过夜 用用Sephadex G-25或或50过滤，分离游离荧光过滤，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体素，收集标记的荧光抗体常用于标记抗体的荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC)、四甲基异13v间接法：间接法：用用4的的PBS将抗体稀释至将抗体稀释至3040mg/ml，置于三角瓶中，放于冰槽中置于三角瓶中，放于冰槽中 按按0.01mg荧光素荧光素/mg蛋白称取荧光素，用蛋白称取荧光素，用3重碳酸钠水溶液溶解重碳酸钠水溶液溶解 抗体与荧光素等量混合，抗体与荧光素等量混合，4 结合结合1824h 离心，除去少量沉淀物装入透析袋中，用离心，除去少量沉淀物装入透析袋中，用0.01M PBS透析，透析，4过夜过夜 用用Sephadex G-25或或50过滤，分离游离荧光过滤，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体素，收集标记的荧光抗体间接法：用4的PBS将抗体稀释至3040mg/ml，置于14v改良法：改良法：稀释抗体至稀释抗体至10mg/ml，降温至，降温至4 加入加入FITC（抗体蛋白：（抗体蛋白：FITC5080mg:1mg），），4搅拌搅拌1214h 用半饱和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，用半饱和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，再用再用0.01MPBS透析透析 将制备好的荧光抗体加将制备好的荧光抗体加0.01叠氮钠，分叠氮钠，分装保存装保存改良法：稀释抗体至10mg/ml，降温至415v透析标记法：透析标记法：pH99.5，抗体蛋白含量，抗体蛋白含量1040 mg/ml 1)用用0.05M pH99.5的碳酸缓冲液制备浓度为的碳酸缓冲液制备浓度为1mg/ml的的FITC溶液溶液 2)将将10mg/ml抗体溶液对碳酸缓冲液透析过夜抗体溶液对碳酸缓冲液透析过夜 3)搅拌，缓慢滴加一定体积的搅拌，缓慢滴加一定体积的FITC溶液（抗体溶液（抗体:FITC100:1），若），若pH低于低于9，用，用NaOH调节调节 4)室温，避光搅拌室温，避光搅拌24h；将标记液用；将标记液用PBS溶液透析溶液透析48h 5)以以Sephadex G-25层析柱提纯标记物，除去过量层析柱提纯标记物，除去过量FITC，置，置于于4保存保存透析标记法：pH99.5，抗体蛋白含量1040 mg/16v荧光抗体的鉴定：荧光抗体的鉴定：特异性和敏感性鉴定特异性和敏感性鉴定v荧光抗体的保存：荧光抗体的保存：4或或-20低温保存，最低温保存，最好加入好加入1:500010000的柳硫汞或的柳硫汞或1:10005000的叠氮钠，分装，真空干燥更易长期保存的叠氮钠，分装，真空干燥更易长期保存荧光抗体的鉴定：特异性和敏感性鉴定17放射性同位素标记技术放射性同位素标记技术v将被标记物分子中某个原子或几个原子被放射性同将被标记物分子中某个原子或几个原子被放射性同位素取代形成同位素标记化合物，是将同位素分析位素取代形成同位素标记化合物，是将同位素分析的高灵敏度于与抗原的高灵敏度于与抗原-抗体反应的特异性相结合，抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法v特异性强、灵敏度高、重复性强、样品及试剂用量特异性强、灵敏度高、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化少、测定方法易规范化和自动化放射性同位素标记技术将被标记物分子中某个原子或几个原子被放射18v可利用其衰变时放出的放射线进行测量，测量较可利用其衰变时放出的放射线进行测量，测量较灵敏而方便灵敏而方便vH3,C14,I131,I125vH3,C14：不改变抗原的结构及其免疫学活性，标记：不改变抗原的结构及其免疫学活性，标记的抗体可长期使用，标记繁琐，测定麻烦的抗体可长期使用，标记繁琐，测定麻烦v方法：氯胺方法：氯胺T碘化法和碘化法和Indogen包被法包被法可利用其衰变时放出的放射线进行测量，测量较灵敏而方便19v氯胺氯胺T法：法：原理：原理：氯胺氯胺T是一种氧化剂，在水溶液重产生次氯是一种氧化剂，在水溶液重产生次氯酸，可使带有负电荷的放射性碘离子氧化成碘分子，酸，可使带有负电荷的放射性碘离子氧化成碘分子，使产生的自由碘分子与蛋白质中的酪氨酸残基（少使产生的自由碘分子与蛋白质中的酪氨酸残基（少量的组氨酸残基）发生卤化反应使之成为含有放射量的组氨酸残基）发生卤化反应使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链，然后和被测物反应，生成性碘化酪氨酸的多肽链，然后和被测物反应，生成带有放射性的化合物带有放射性的化合物 优点：优点：标记效率高，重复性好，试剂便宜易得标记效率高，重复性好，试剂便宜易得氯胺T法：20v步骤：步骤：在细胞冻存管内加入纯化的在细胞冻存管内加入纯化的100g/100 L McAb，再加入，再加入10 L0.05MPBS，再加入，再加入10 L I125 加入加入10 L 氯胺氯胺T，迅速振荡，室温下反应，迅速振荡，室温下反应40s 加入加入100 L 还原剂偏重亚硫酸钠还原剂偏重亚硫酸钠 加入加入200 L KI溶液溶液 将碘化反应混合液注入将碘化反应混合液注入PD10柱，洗脱柱，洗脱v保存：保存：加入加入1/8体积的异丙醇，分装，置于铅罐重体积的异丙醇，分装，置于铅罐重-20储存备用，避免反复冻融储存备用，避免反复冻融步骤：在细胞冻存管内加入纯化的100g/100 L Mc21酶标记技术酶标记技术v通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查，色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查，也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存在，从而证明了发生了相应的免疫反应在，从而证明了发生了相应的免疫反应酶标记技术通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶标抗体22v常用于标记的酶：常用于标记的酶：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)：由主酶和辅基结合而成的过由主酶和辅基结合而成的过氧化物酶，能催化过氧化物（氧化物酶，能催化过氧化物（H2O2）对某些物质的）对某些物质的氧化，释放出的氧将无色的供氢体氧化，释放出的氧将无色的供氢体(OPD,TMB)氧化成氧化成有色的产物有色的产物 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKP）：）：作用于底物，形成磷酰基作用于底物，形成磷酰基-酶酶的中间产物，再进一步将磷酰基转变为无机磷的中间产物，再进一步将磷酰基转变为无机磷常用于标记的酶：23v戊二醛（戊二醛（GA）交联法：）交联法：GA是一种双功能基团是一种双功能基团试剂，通过醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨试剂，通过醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶基共价结合，形成酶-GA-免疫球蛋白结合物，免疫球蛋白结合物，适用适用AKP1）用）用100mol/l Ph6.8的的PBS稀释稀释GA至终浓度为至终浓度为0.15 mol/l2）将）将10mgHRP溶于溶于0.2ml上述上述GA溶液中，室温溶液中，室温下搅拌反应下搅拌反应18h戊二醛（GA）交联法：GA是一种双功能基团试剂，通过醛基分别243）PBS透析过夜，过透析过夜，过Sephadex G-25凝胶柱，收集流凝胶柱，收集流出的棕色液体，浓缩至出的棕色液体，浓缩至1ml4）将）将5mg抗体溶于抗体溶于1ml PBS，加入上述液体终，并加，加入上述液体终，并加入入0.1ml，pH9.6，1M的碳酸盐缓冲液的碳酸盐缓冲液5）4反应反应24h，然后加入，然后加入1ml,1M,pH7.0的赖氨酸溶的赖氨酸溶液，液，4继续反应继续反应2h6）PBS透析过夜透析过夜7）过）过Sephadex G-200层析柱，分管收集，将层析柱，分管收集，将A280 nm的第一峰收集，的第一峰收集，-20 冻存冻存3）PBS透析过夜，过Sephadex G-25凝胶柱，收集25v改良过碘酸钠法：过碘酸钠将改良过碘酸钠法：过碘酸钠将HRP表面的糖分子表面的糖分子氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成希氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成希夫碱，后者可用夫碱，后者可用NaBO4(或乙醇胺或乙醇胺)还原生成稳定还原生成稳定的酶标记物的酶标记物1）将）将5mgHRP溶于溶于1ml蒸馏水中蒸馏水中2）加入）加入0.2ml新配制的新配制的0.1M过碘酸钠溶液，室温避过碘酸钠溶液，室温避光搅拌光搅拌20min改良过碘酸钠法：过碘酸钠将HRP表面的糖分子氧化为活泼的醛基263）1mM（pH4.4）醋酸钠缓冲液透析，）醋酸钠缓冲液透析，4过夜过夜4）加）加20l，0.2M（pH9.5）碳酸盐缓冲液，使以）碳酸盐缓冲液，使以上醛化的上醛化的HRP的的pH升高至升高至99.5，然后立即加，然后立即加入入10mg抗体，避光室温搅拌抗体，避光室温搅拌2h5）加入）加入0.1ml新配的新配的4mg/ml NaBO4溶液，混匀，溶液，混匀，4，2h6）0.15M（pH7.4）PBS透析，透析，4过夜过夜3）1mM（pH4.4）醋酸钠缓冲液透析，4过夜27胶体金标记抗体胶体金标记抗体v是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原-抗抗体反应的一种新型免疫标记技术体反应的一种新型免疫标记技术v胶体金是由氯金酸在还原剂的作用下，聚合胶体金是由氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态一种稳定的胶体状态v 结合力与溶液结合力与溶液pH和蛋白质等电点有关和蛋白质等电点有关胶体金标记抗体是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原-抗体反应28vpH等于或稍偏于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，等于或稍偏于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子于胶体金颗粒相互间的静电作用较此时蛋白质分子于胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，轻易吸附于金颗粒表明弱的水化状态，轻易吸附于金颗粒表明v在低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体在低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，两者极易静电结合形成大的聚合物金带负电荷，两者极易静电结合形成大的聚合物vpH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合粒的负电荷相互排斥而不能互相结合pH等于或稍偏于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分29v透析除盐：透析除盐：除去蛋白质中多余的电解质除去蛋白质中多余的电解质v去除蛋白质中的沉淀：去除蛋白质中的沉淀：离心离心v标记：标记：用用K2CO3或或HCl调节金溶液至所需调节金溶液至所需pH 加入最佳标记量的蛋白质溶液，电磁搅拌加入最佳标记量的蛋白质溶液，电磁搅拌23min加入加入1PEG20000至终浓度至终浓度0.05 10000100000g离心离心3060min,吸取上清吸取上清 将沉淀悬浮于含将沉淀悬浮于含0.20.5mg/mlPEG20000溶液中，离心溶液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，加入叠氮钠，沉淀后，再用同一缓冲液恢复，加入叠氮钠，4保存保存 用用Sephadex G-200柱进行纯化，用柱进行纯化，用0.1BSA洗脱洗脱透析除盐：除去蛋白质中多余的电解质30生物素标记技术生物素标记技术v原理：生物素的琥珀酰亚胺同抗体的自由氨原理：生物素的琥珀酰亚胺同抗体的自由氨基反应基反应v特点：不影响标记抗体的生物活性特点：不影响标记抗体的生物活性 结合快速，具有高度特异性和稳定性结合快速，具有高度特异性和稳定性生物素标记技术原理：生物素的琥珀酰亚胺同抗体的自由氨基反应31