动物基因工程课件

动物基因工程动物基因工程动物基因工程第一第一节基因工程概述基因工程概述基基因因工工程程(Geneticengineering)是是一一种种DNA重重组组技技术术，它它是是在在分分子子水水平平上上进进行行的的遗遗传传操操作作，即即把把供供体体细细胞胞中中的的基基因因或或基基因因组组提提取取出出来来，按按照照预预先先设设计计的的蓝蓝图图，经经过过体体外外加加工工重重组组，或或者者把把人人工工合合成成的的基基因因转转移移到到受受体体细细胞胞并并获获得得新新的的遗遗传传特特性性的的技技术术。由由于于被被转转移移的的基基因因必必须须与与载载体体DNA重重组组后后才才能能实实现现转转移移，所所以以基基因因工工程程也也叫做重组叫做重组DNA技术。技术。基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序包包括括：(1)目目的的基基因因的的分分离离或或合合成成；(2)用用工工具具酶酶对对目目的的基基因因和和载载体体（Vector）进进行行加加工工处处理理，把把目目的的基基因因与与载载体体结结合合成成重重组组DNA分分子子；(3)把把重重组组DNA分分子子引引入入受受体体细细胞胞，并并使使目目的的基基因因和和载载体体上上其其他他基基因因得得以以表表达达；（4）转转化化体体细细胞胞的的扩扩增增；（5）重组体细胞的鉴定与筛选。）重组体细胞的鉴定与筛选。第一节基因工程概述基因工程(Geneticengine基因克隆示意图基因克隆示意图第二节第二节工具酶工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶切割切割DNADNA连接酶连接酶生成生成3-5磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶探针标记、补平探针标记、补平3末端末端反转录酶反转录酶cDNA合成合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记磷酸化、探针标记末端转移酶末端转移酶3末端多聚尾末端多聚尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基常用的工具酶常用的工具酶第二节工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶细菌限制修饰体系细菌限制修饰体系限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶甲基化酶甲基化酶识别特异的位点识别特异的位点酶切位点酶切位点回文结构回文结构46bp出现两种末端出现两种末端粘性末端粘性末端粘端粘端平头末端平头末端平端平端配伍末端配伍末端限制性核酸内切酶二、二、DNA聚合酶聚合酶（一）（一）DNA聚合酶聚合酶I(全酶全酶)(E.coliDNAPolymease)（二）（二）K1enow片段片段(E.co1i)（三）（三）T4DNA聚合酶聚合酶(T4噬茵体感染的噬茵体感染的Eco1i)（四）（四）TaqDNA聚合酶聚合酶(Thermusaqraticus)（五）逆转录酶（五）逆转录酶（reversetranscriptase）（六）末端转移酶（六）末端转移酶二、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶I(全酶)(E.c三、三、DNA连接接酶 在在大大肠肠杆杆菌菌和和动动物物细细胞胞中中都都发发现现了了DNA连连接接酶酶，这这种种酶酶能能够够催催化化DNA中中相相邻邻的的3一一OH和和5一一磷磷酸酸基基末末端端之之间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键。连连接接反反应应的的最最适适温温度度是是37，但但在在此此温温度度下下粘粘性性末末端端之之间间氢氢键键结结合合很很不不稳稳定定。实实验验表表明明，15对对于于连连接接反反应应和和粘粘性性末末端端氢氢键键结结合合的稳定性都是合适的。的稳定性都是合适的。四四、甲基化酶 细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase)(methylase)米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNADNA不被限制不被限制性内切酶切开。真核生物中目前只发现性内切酶切开。真核生物中目前只发现5 5甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶(M5C)(M5C)。三、DNA连接酶在大肠杆菌和动物细胞中都发现了D五、核酸酶五、核酸酶（一）核酸酶（一）核酸酶S1(NucleaseS1)核酸酶核酸酶S1主要用于：主要用于：(1)分析分析DNA：RNA杂交体结构。通过降解成熟杂交体结构。通过降解成熟mRNA与放射性标记基因组、与放射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位。的杂交体确定内含子部位。(2)切除切除DNA片段上的单链末端，形成平末端。片段上的单链末端，形成平末端。(3)切开切开cDNA合成过程中形成的合成过程中形成的发夹环。发夹环。(4)在限制酶位点上产生小缺失。在限制酶位点上产生小缺失。(二二)核酸外切酶核酸外切酶III（三）核酸外切酶（三）核酸外切酶VII（四）（四）DNA酶酶I（五）（五）RNA酶酶A(牛胰牛胰)（六）（六）RNA酶酶TI（七）（七）RNA酶酶H五、核酸酶（一）核酸酶S1(Nuclease第三节基因工程的载体第三节基因工程的载体（Vector）到目前为止，用于基因工程的载体有到目前为止，用于基因工程的载体有8类：类：细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体。细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体。噬菌体衍生载体。噬菌体衍生载体。柯柯斯斯质质粒粒(Cosmid)载载体体：一一种种由由质质粒粒和和A噬噬菌菌体体cos尾尾巴构建巴构建 的复合载体。的复合载体。噬噬菌菌体体M13衍衍生生载载体体一一类类专专门门用用于于Sanger法法测测序序的的载载体。体。Phag9m5d载载体体：一一类类由由噬噬菌菌体体功功能能片片段段和和质质粒粒构构建建的复合的复合 载体。载体。酵酵母母质质粒粒载载体体：由由酵酵母母2u质质粒粒构构建建的的酵酵母母基基因因工工程程载载体。体。真核病毒载体：包括动物病毒、植物病毒衍生载体。真核病毒载体：包括动物病毒、植物病毒衍生载体。杆状病毒和杆状病毒和Bacmid载体；载体；第三节基因工程的载体（Vector）到目前为止，用于基因工作为基因工程的载体它们都具备以下一些作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的基本特点：共同的基本特点：作作为为基基因因工工程程的的载载体体它它们们都都具具备备以以下下一一些些共共同同的基本特点：的基本特点：在宿主细胞中能独立自主地复制。在宿主细胞中能独立自主地复制。表达载体含有强启动于，能驱动靶基因在宿表达载体含有强启动于，能驱动靶基因在宿 主细胞中表达。主细胞中表达。容易从宿主细胞中分离纯化。容易从宿主细胞中分离纯化。载载体体DNA基基因因组组中中有有一一段段不不影影响响它它们们复复制制的的非非必必需需区区域域，插插在在其其中中的的靶靶片片段段能能被被动动地地跟跟着着载载体体DNA一一起起复复制制，就就像像载载体体的的正正常常成成分分一样。一样。作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的基本特点：作为基一、质粒载体一、质粒载体(plasmidvector)（1）质粒的一般性质）质粒的一般性质1质质粒粒的的概概念念质质粒粒是是细细菌菌细细胞胞染染色色体体外外存存在在于于细细胞胞质质中中能能进进行行自自我我复复制制的的一一类类小小型型DNA分分子，大部分质粒为双链环状。子，大部分质粒为双链环状。2质粒的大小质粒的大小3质粒的拷贝数质粒的拷贝数4质粒的不亲和性质粒的不亲和性5质粒的宿主范围质粒的宿主范围一、质粒载体(plasmidvector)（1）质粒的一质粒质粒存在于细菌染色体外的小型环状双存在于细菌染色体外的小型环状双链链DNA分子分子理想的质粒理想的质粒1.拷贝数多拷贝数多;2.两三个抗药性基因两三个抗药性基因terrampr筛选标志筛选标志3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）合适的限制性内切酶酶切位点（单一）质粒存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子动物基因工程课件（二）（二）噬菌体载体噬菌体载体(Phagevector)噬噬菌菌体体是是一一种种温温和和噬噬菌菌体体，由由于于它它的的遗遗传传结结构构和和宿宿主主大大肠肠杆杆菌菌的的遗遗传传结结构构研研究究得得比比较较清清楚楚，并并能能在在细细菌菌中中大大量量繁繁殖殖，所所以以成成为为广广泛泛采采用用的的载载体体。噬噬菌菌体体还还有有一一大大优优点点，即即使使它它的的DNA丢丢失失25仍仍不不失失活活，这这部部分分丢丢失失的的空空档档正正好可以装载外源好可以装载外源DNA。与与质质粒粒载载体体相相比比，噬噬菌菌体体作作为为载载体体可可以以克克隆隆更更大大一一些些的的DNA片片段段，欲欲构构件件一一个个基基因因文文库库，往往可以减少文库中克隆的数量。往往可以减少文库中克隆的数量。（二）噬菌体载体(Phagevector)（三）柯斯质粒载体（三）柯斯质粒载体（Cosmidvector）柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是一种由人工构建的含有一种由人工构建的含有DNA的的cos序列和序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒在结构组成上具有斯质粒在结构组成上具有 噬菌体的特性、噬菌体的特性、也具有质粒载体的特性和高容量的克隆也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入能力，一般可插入3540kb的外源基因，的外源基因，这是构建真核生物基因文库的主要载体。这是构建真核生物基因文库的主要载体。柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克隆。隆。（三）柯斯质粒载体（Cosmidvector）（四）（四）YAC载体载体 YACYAC是是 酵酵 母母 人人 工工 染染 色色 体体（Yeast Yeast artificial artificial chromosomechromosome）的的缩缩写写，是是目目前前能能容容纳纳最最大大外外源源DNADNA片片段段的的载载体体。简简单单地地说说，酵酵母母人人工工染染色色体体载载体体有有两两个个臂臂，之之间间有有着着丝丝粒粒，每每个个臂臂的的末末端端有有一一个个端端粒粒，另另外外，染染色色体体上上还还有有供供选选择择的的标标记记基基因因；当当外外源源DNADNA片片段段连连接接进进两两个个臂臂中中以以后后，通通过过选选择择标标记记人人们们可可以以从从酵酵母母宿宿主主细细胞中筛选出重组的人工染色体。胞中筛选出重组的人工染色体。实实验验结结果果证证明明，每每个个YACYAC都都可可以以装装进进100100万万碱碱基基以以上上的的DNADNA片片段段，这这种种大大小小比比柯柯斯斯质质粒粒的的装装载载能能力力要要大大数数倍倍，所以可以保证基因结构的完整性。所以可以保证基因结构的完整性。（四）YAC载体YAC是酵母人工染色体（Yeas(五五)动物病毒动物病毒 动动物物病病毒毒作作为为载载体体可可用用于于外外源源基基因因向向真真核核细细胞胞的的转转入入。作作为为基基因因介介导导的的动动物物DNA载载体体，必必须须具具备备以以下下条条件件：(1)具具有有动动物物病病毒毒的的复复制制起起始始部部位位及及启启动动子子，以以便便外外源源基基因因能能有有效效的的转转染染动动物物细细胞胞，以以及及提提供供必必要要的的转转录录信信号号：(2)具具有有可可供供选选择择的的标标志志基基因因，因因为为重重建建的的病病毒毒转转染染力力很很低低，一一般般仅仅为为105107，只只有有利利用用标标志志基基因因才才能能选选出出转转化化细细胞胞株株；(3)具具有有适适当当的的多多种种单单一一内内切切酶位点供外源基因插入。酶位点供外源基因插入。目目前前常常用用的的基基因因转转移移载载体体有有：(1)猴猴空空泡泡病病毒毒(Simianvirus40简简称称SV40)；(2)腺腺病病毒毒(Adenovirus)；(3)乳乳 头头 状状 病病 毒毒(Papilloma virus)；(4)逆逆 转转 录录 病病 毒毒(Retrovirus);(5)牛牛痘痘(Vaccinia)病病毒毒;(6)牛牛疣疣病病毒毒(Bovinepapillomavirus)等。等。(五)动物病毒动物病毒作为载体可用于外源基三、获得目的基因的方法三、获得目的基因的方法(一一)利用理化方法分离基因利用理化方法分离基因 理理化化方方法法分分离离基基因因是是依依据据DNADNA双双链链结结构构的的特特点点和和四四种种碱碱基基互互补补的的氢氢键键差差异异，其其方法有以下四种：方法有以下四种：1 1密度梯度超速离心法密度梯度超速离心法 2 2单链酶法单链酶法 3 3多聚赖氨酸法多聚赖氨酸法 4 4分子杂交法分子杂交法三、获得目的基因的方法(一)利用理化方法分离基因(二二)利用生物学方法分离基因利用生物学方法分离基因 利利用用噬噬菌菌体体转转染染或或质质粒粒转转化化等等微微生生物物学学技技术术分分离离基基因因的的方方法法，我我们们把把它它叫叫做做生生物物学学方方法法。这种方法应用于原核基因的分离提取。这种方法应用于原核基因的分离提取。用用适适当当的的限限制制性性内内切切酶酶(Restriction(Restriction endonuclease endonuclease)将将整整个个染染色色体体或或DNADNA分分子子切切成成许许多多相相当当于于一一个个或或略略大大于于一一个个基基因因的的片片段段，然然后后把把全全部部DNADNA片片段段与与质质粒粒组组成成重重组组DNADNA分分子子，并并转转化化到到某某特特定定基基因因营营养养缺缺陷陷型型受受体体菌菌内内，进进行行纯系繁殖，再经分离鉴定，选出所需基因。纯系繁殖，再经分离鉴定，选出所需基因。(二)利用生物学方法分离基因利用噬菌体转染或质粒(三三)基因的人工合成基因的人工合成1.化学合成法化学合成法2.2.逆转录法逆转录法(Reverse transcription)(Reverse transcription)逆转录法也叫逆转录法也叫cDNAcDNA法，它是一种酶促合法，它是一种酶促合成法，即以成法，即以mRNAmRNA为模板，在反转录酶的为模板，在反转录酶的作用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料作用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料合成合成DNA(cDNA)DNA(cDNA)，再经复制后即成双链，再经复制后即成双链DNADNA。3.聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(三)基因的人工合成化学合成法四、重组四、重组DNADNA分子分子1.粘性末端连接粘性末端连接连接效率高连接效率高相同酶切末端相同酶切末端配伍末端配伍末端2.平端连接平端连接连接效率低连接效率低3.同聚物接尾法同聚物接尾法4.人工接头法人工接头法四、重组DNA分子1.粘性末端连接连接效率高动物基因工程课件五、基因的转移五、基因的转移(Genetransfer)(一一)、重组、重组DNA向细菌细胞转入向细菌细胞转入把把以以质质粒粒为为载载体体的的重重组组DNA分分子子引引入入受受体体细细胞胞的的过过程程叫叫做做转转化化(Transformation)；把把以以噬噬菌菌体体或或病病毒毒为为载载体体的的重重组组DNA分分子子引引入入受受体体细细胞胞的过程叫做转染的过程叫做转染(Transfetion)。对对细细菌菌细细胞胞进进行行转转化化或或转转染染的的关关键键是是细细胞胞处处在在感感受受态态，所所谓谓感感受受态态细细胞胞，就就是是受受体体细细胞胞处处于于摄摄入入外外源源DNA的的状状态态。一一般般用用0.010.05M/L氯氯化化钙钙处处理理受受体体细细胞胞，可可以以引引起起细细胞胞膨膨胀胀，增增大大细细胞胞的的通通透透性性，使使重重组组DNA进进入入细细胞胞，提提高高转化效率。转化效率。五、基因的转移(Genetransfer)(一)、重组D转导作用转导作用transduction病毒、噬菌体介导病毒、噬菌体介导溶菌途径溶菌途径溶原菌途径溶原菌途径转导作用transduction(二二)、外源目的基因向真核细、外源目的基因向真核细胞转入胞转入向向真真核核细细胞胞中中转转移移基基因因的的方方法法可可分分为为两两大大类类，类类需需借借助助于于载载体体，另另类类不不需借助于载体。需借助于载体。1借助于载体的基因转移借助于载体的基因转移2不需载体的基因转移不需载体的基因转移 磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 脂质体介导法脂质体介导法 血影细胞血影细胞(Bloodshadowcell)介导法介导法(二)、外源目的基因向真核细胞转入向真核细六、转化细胞的筛选与鉴定六、转化细胞的筛选与鉴定转化或转染的效率是很低的转化或转染的效率是很低的(一般为一般为105106)，也就是说，只有极少数细胞接受到，也就是说，只有极少数细胞接受到重组重组DNA分子，能实现基因的转移。所分子，能实现基因的转移。所以必须从大量的培养细胞中筛选出已被以必须从大量的培养细胞中筛选出已被外源外源DNA转化了的细胞，然后建立无性转化了的细胞，然后建立无性繁殖系，使所需基因大量扩增和表达。繁殖系，使所需基因大量扩增和表达。六、转化细胞的筛选与鉴定转化或转染的效率是很低的(一般为1重组体的筛选重组体的筛选screening/selection1.直接选择法直接选择法抗药性标志选择抗药性标志选择标志补救标志补救表达产物与营养缺陷互补表达产物与营养缺陷互补互补互补蓝白斑筛选蓝白斑筛选分子杂交分子杂交探针探针原位杂交原位杂交/Southern印迹法印迹法限制性酶切图谱限制性酶切图谱/PCR2.非直接选择法非直接选择法免疫学方法免疫学方法重组体的筛选screening/selection七七克隆基因的表达克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件载体有转录、翻译的元件密码子通用密码子通用1、原核表达体系原核表达体系原核表达载体的标准原核表达载体的标准合适的筛选标志合适的筛选标志强启动子强启动子翻译控制序列翻译控制序列多克隆位点多克隆位点七克隆基因的表达融合蛋白融合蛋白包涵体包涵体大肠杆菌表达体系的不足大肠杆菌表达体系的不足1.缺乏转录后加工机制，只能表达缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA2.缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化基化3.融合蛋白形成包涵体，复性后才有活融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性性4.很难表达大量的可容性蛋白很难表达大量的可容性蛋白融合蛋白包涵体动物基因工程课件2真核表达体系真核表达体系筛选标志筛选标志NeorG418转染方法转染方法磷酸钙沉淀磷酸钙沉淀DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔脂质体转染脂质体转染显微注射显微注射瞬时转染瞬时转染目的基因不整合进宿主基因组目的基因不整合进宿主基因组稳定转染稳定转染目的基因整合进宿主基因组目的基因整合进宿主基因组真核表达体系第三节第三节 转基因动物技术转基因动物技术一、转基因动物的概念一、转基因动物的概念 转转基基因因技技术术是是将将外外源源DNA导导入入细细胞胞的的一一种种技技术术。它它是是在在DNA重重组组技技术术的的基基础础上上发发展展起起来来的的。1981年年Gordon和和Ruddle首首次次用用显显微微注注射射法法(Microinjection)把把外外源源基基因因导导入入小小鼠鼠受受精精卵卵的的雄雄核核，并并将将注注射射后后的的受受精精卵卵植植入入假假孕孕母母鼠鼠子子宫宫，产产生生了了的的78只只小小鼠鼠，其其中中有有2只只的的所所有有细细胞胞中中(包包括括生生殖殖细细胞胞)都都含含有有外外源源基基因因，但但因因缺缺乏乏启启动动子子而而不不能能表表达达，他他们们把把出出生生后后带带外外源源基基因因的的小小鼠鼠叫叫做做转转基基因因小小鼠鼠(TransgenicMice)，自自此此以以后后，凡凡带带有有外外源源基基因因的的动动物物都都叫叫做做转转基基因因动动物物(Transgenicanimal)。第三节转基因动物技术一、转基因动物的概念二、转基因动物技术的一般步骤二、转基因动物技术的一般步骤(1)选择能有效表达的蛋白质；选择能有效表达的蛋白质；(2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因；克隆与分离编码这些蛋白质的基因；(3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节序列；因调节序列；(4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或小鼠中预先检验其表达情况；胞或小鼠中预先检验其表达情况；(5)把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中；把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中；(6)把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发(7)检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代中的传递情况。情况以及外源基因在其后代中的传递情况。二、转基因动物技术的一般步骤(1)选择能有效表达的蛋白质；三、导入基因的方法三、导入基因的方法 导入外源基因的方法有多种，一些方导入外源基因的方法有多种，一些方法已在上一节作过叙述，如：法已在上一节作过叙述，如：反转录反转录病毒转染法；病毒转染法；磷酸钙沉淀法；磷酸钙沉淀法；脂质脂质体介导法；体介导法；血影细胞血影细胞(Bloodshadowcell)介导法。在此再介绍一些方法，介导法。在此再介绍一些方法，1）DNA微注射法；微注射法；2）精子载体法；）精子载体法；3)胚胎干细胞（胚胎干细胞（ES）介导法；）介导法；4)染色体片染色体片段注入法；段注入法；5)电转移法等。在转基因动电转移法等。在转基因动物中，物中，DNA微注射法比较常用。微注射法比较常用。三、导入基因的方法导入外源基因的方法有多种，一些四、基因的选择与转基因动物四、基因的选择与转基因动物的研究现状的研究现状(一一)转入基因的选择转入基因的选择(二二)转基因动物的研究意义转基因动物的研究意义1提高动物生长、生产性能的研究提高动物生长、生产性能的研究2改变奶蛋白成分和性质的设想改变奶蛋白成分和性质的设想3利用家畜产品生产药物蛋白的研究利用家畜产品生产药物蛋白的研究四、基因的选择与转基因动物的研究现状(一)转入基因的选择第四节第四节 动物克隆技术动物克隆技术一、动物克隆的概念一、动物克隆的概念 所谓克隆所谓克隆(Cloning)(Cloning)就是无性繁殖，就是无性繁殖，动物克隆动物克隆(Animal cloning)(Animal cloning)就是不经过就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法。克受精过程而获得动物新个体的方法。克隆动物隆动物(cloninganimal)就是指不经过生就是指不经过生殖细胞而直接由体细胞获得新的动物个殖细胞而直接由体细胞获得新的动物个体。体。第四节动物克隆技术一、动物克隆的概念二、克隆动物的一般步骤二、克隆动物的一般步骤送入子宫，完成胚胎发育送入子宫，完成胚胎发育克隆的动物克隆的动物二、克隆动物的一般步骤送入子宫，完成胚胎发育克隆的动物