血清学试验-课件

血清学诊断血清学诊断血清学试验血清学试验的概念血清学试验的概念u由于抗体主要存在于由于抗体主要存在于血清中，所以将体外血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应反应称为血清学反应或血清学试验。或血清学试验。血清学试验血清学试验的特点血清学试验的特点u特异性和交叉性 u敏感性 u可逆性 u反应的二阶段性 u最适比例与带现象 u用已知测未知 u 血清学试验特异性和交叉性特异性和交叉性u特异性特异性 抗原只能与相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。u交叉性交叉性 两种不同的抗原之间含有共同的抗原决定簇，则发生交叉反应。血清学试验反应的二阶段性反应的二阶段性 第二阶段第二阶段 抗原抗体复合物出现可见反应阶段。此阶段反应慢、需数分钟、数十分钟或更久。第一阶段第一阶段 抗原与抗体的特异性结合阶段，此阶段反应快、仅数秒至数分钟，但不出现可见反应。血清学试验敏感性敏感性u抗原抗体的结合还具有高度敏感性的特点，不仅可检测定性，还可以定量检测微量、极微量的抗原或抗体。血清学试验最适比例与带现象最适比例与带现象v抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现肉眼可见反应。抗体抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现肉眼可见反应。抗体除除IgM是是5价，价，SIgA 4价外，一般抗体都含有两个结合位点（二价外，一般抗体都含有两个结合位点（二价）；抗原则根据分子大小，有价）；抗原则根据分子大小，有1050个不等的结合点。当抗个不等的结合点。当抗原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结合点，可以原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结合点，可以继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体结合物的未饱和点相联继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体结合物的未饱和点相联结，逐渐形成愈来愈大的复合物，出现了肉眼可见反应。比例结，逐渐形成愈来愈大的复合物，出现了肉眼可见反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物愈多。最适合，出现反应最快，反应产物愈多。v如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之带现象。不出现可见反应，谓之带现象。血清学试验前前带带 后后带带 血清学试验可逆性可逆性u抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这种结合是可逆的，结合条件为040、pH49。如温度超过60或pH降到3以下，或加入解离剂时，则抗原抗体复合物又可重新解离，并且分离后抗原或抗体的性质仍不改变。血清学试验用已知测未知用已知测未知u所有的血清学试验都是用已知抗原测定未知抗体，或用已知抗体测定未知抗原。血清学试验影响血清学试验的因素影响血清学试验的因素u电电解解质质：血血清清学学反反应应须须在在适适当当浓浓度度的的电电解解质质参参与与下下，才出现可见反应。才出现可见反应。0.9%0.9%氯化钠溶液。氯化钠溶液。8-10%8-10%u温温度度：在在一一定定温温度度范范围围内内，温温度度越越高高，抗抗原原、抗抗体体分分子子运运动动速速度度越越快快，这这可可以以增增加加其其碰碰撞撞的的机机会会，加加速速抗抗原抗体结合和反应现象的出现原抗体结合和反应现象的出现 。血清学试验u酸酸碱碱度度：血血清清学学反反应应通通常常用用pH6pH68 8，过过酸酸或或过过碱碱都都可可使使复合物解离，复合物解离，pHpH值在等电点时，可引起非特异凝集。值在等电点时，可引起非特异凝集。u振振荡荡：适适当当的的机机械械振振荡荡能能增增加加分分子子或或颗颗粒粒间间的的相相互互碰碰撞撞，加加速速抗抗原原抗抗体体的的结结合合反反应应，但但强强烈烈的的振振荡荡可可使使抗抗原原抗抗体体复合物解离。复合物解离。u杂杂质质和和异异物物：试试验验介介质质中中如如有有与与反反应应无无关关的的杂杂质质、异异物物存在时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应。存在时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应。u 血清学试验血清学试验的类型血清学试验的类型u凝集试验凝集试验 u沉淀试验沉淀试验 u补体结合试验补体结合试验 u中和试验中和试验 u免疫标记技术免疫标记技术血清学试验凝集试验的概念凝集试验的概念u细细菌菌、红红细细胞胞等等颗颗粒粒性性抗抗原原，或或吸吸附附在在红红细细胞胞、乳乳胶胶等等颗颗粒粒性性载载体体表表面面的的可可溶溶性性抗抗原原，与与相相应应抗抗体体结结合合后后，在在有有适适量量电电解解质质存存在在下下，经经过过一一定定时时间间，复复合合物物互互相相凝凝聚聚形形成成肉肉眼眼可可见见的的凝凝集集团块，称为凝集试验。团块，称为凝集试验。血清学试验凝集试验的类型凝集试验的类型u直接凝集试验直接凝集试验 u间接凝集试验间接凝集试验 血清学试验直接凝集试验直接凝集试验概概念念：颗颗粒粒性性抗抗原原与与相相应应抗抗体体在在电电解解质质的的参参与与下下，直直接接结结合合，凝凝集集成成团团的的现现象象，称直接凝集试验。称直接凝集试验。类类型型：按按其其操操作作方方法法可可分分为为玻玻片片法法和和试试管管法。法。血清学试验1 1玻片凝集试验玻片凝集试验u方方法法：在在玻玻璃璃板板或或瓷瓷片上进行。片上进行。u特点：特点：简单、快速。简单、快速。u用用途途：定定性性试试验验，如如细细菌菌鉴鉴定定、血血型型鉴鉴定定等。等。血清学试验2 2试管凝集试验试管凝集试验u方法：方法：在试管中进行。在试管中进行。u特点：特点：准确、耗时。准确、耗时。u用途：用途：定量试验，如定量试验，如诊断布氏杆菌病，测诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价。定抗体的凝集价。血清学试验血清学试验v结果判定v结果用“+”表示反应强度。v+：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底。v+：液体透明，菌体基本被凝集沉于管底。v+：液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀。v+：液体透明度不明显或不透明，有不明显的沉淀或有沉淀的痕迹。v ：液体不透明，呈均匀混浊，管底无凝集。有时有少量菌体集中于管底中心，呈脐状，但振摇时，立即散开呈均匀浑浊。v以出现“+”的最高血清稀释倍数即为该份血清的效价，又叫凝集价。大动物（马，牛，骆驼等）以凝集价1：100以上判为阳性，1：50的凝集价判为可疑。中小动物（猪，羊，狗等）以凝集价1：50以上判为阳性，1：25的凝集价判为可疑。v如对照管不符合要求时，试管须废弃重做。血清学试验间接凝集试验间接凝集试验概念：概念：F将将可可溶溶性性抗抗原原或或抗抗体体与与载载体体连连接接后后，再再与与相相应应的的抗抗体体或或抗抗原原作作用用，所所出出现现的的特特异异性性凝凝集集反反应应为为间间接接凝凝集试验。集试验。类型：类型：F 间接血凝试验间接血凝试验 F 乳胶凝集乳胶凝集试验试验 F 协协同凝集同凝集试验试验血清学试验致敏红细胞致敏红细胞红细胞红细胞抗原抗原红细胞红细胞抗原抗原致敏红细胞致敏红细胞被检抗体被检抗体红细胞凝集红细胞凝集间接血凝试验原理间接血凝试验原理血清学试验血清学试验v凝集强度判定v（100%红细胞凝集）：边缘不整齐，有红色颗粒布满孔底）v（50%红细胞凝集）V型孔：孔底可见红色颗粒，中央有少量红细胞沉淀v 红细胞呈点状沉于孔底，无红色颗粒。v能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，为该病毒的红细胞凝集滴度，即一个凝集单位。如表18-1-1的病毒血凝滴度为27，即将病毒原液作27倍稀释，其中含一个血凝单位的病毒。v由于病毒血凝抑制试验中需要的病毒液应含4个血凝单位，因此，需要对原病毒液进行25倍稀释。血清学试验以能使100%红细胞不发生凝集的血清最大稀释倍数为该血清的HI滴度，以2的指数表示。血清学试验沉淀试验的概念沉淀试验的概念u可溶性抗原与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验。血清学试验沉淀试验的类型沉淀试验的类型u环状沉淀试验环状沉淀试验 u琼脂凝胶扩散试验琼脂凝胶扩散试验 u免疫电泳免疫电泳血清学试验环状沉淀试验环状沉淀试验u方法：方法：在小口径试管中进行。在小口径试管中进行。u原原理理：试试管管内内，下下层层沉沉淀淀素素与与上上层层沉沉淀淀原原在在液液界界面面应应形形成成白白色沉淀环。色沉淀环。u用用途途：主主要要用用于于抗抗原原的的定定性性试试验验，如如炭炭疽疽杆杆菌菌的的AscoliAscoli试试验验、链链球球菌菌的的血血清清型型鉴鉴定定、血血迹迹鉴鉴定等。定等。白色沉淀环白色沉淀环沉淀原沉淀原沉淀素沉淀素血清学试验琼脂凝胶扩散试验琼脂凝胶扩散试验u原理原理 1%1%琼琼脂脂凝凝胶胶孔孔径径为为85nm85nm，能能使使许许多多可可溶溶性性抗抗原原与与抗抗体体在在凝凝胶胶中中扩扩散散。当当抗抗原原与与抗抗体体在在凝凝胶胶中中的的一一定定位位置置上上相相遇遇时时，则则两两者者结结合合形形成成沉淀沉淀线线。血清学试验琼脂凝胶扩散试验类型琼脂凝胶扩散试验类型u单向单扩散单向单扩散 u单向双扩散单向双扩散 u双向单扩散双向单扩散 u双向双扩散双向双扩散 F方法方法 F用途用途 血清学试验双向双扩散方法双向双扩散方法u此法系采用1%琼脂倒于平皿或玻片上，制成凝胶板，可按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在37C湿箱中24-72h后观察。血清学试验双向双扩散用途双向双扩散用途u u 抗抗原原的的比比较较和和鉴鉴定定：在在抗抗原原与与抗抗体体孔孔间间形形成成沉沉淀淀带带。每每一一种种抗抗原原成成分分出出现现一一条条沉沉淀淀带带。如如两两个个相相邻邻孔孔之之间间抗抗原原相相同同，则则沉沉淀淀带带融融合合，如如1 1、2 2；抗抗原原不不同同，则则互互相相交交叉叉，如如3 3；部部分分相相同同则则部部分分融融合合，另外不同部分则交叉，如另外不同部分则交叉，如4 4。血清学试验免疫电泳免疫电泳u免疫电泳技术是把凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫检测技术。即将琼脂扩散置于直流电场中进行，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其扩散方向，在比例合适处形成可见的沉淀带。血清学试验补体结合试验补体结合试验 u试验系统、试验系统、原理原理和结果判定和结果判定 反应系统反应系统已知抗原已知抗原（抗体）（抗体）待检血清待检血清（抗原）（抗原）补体补体绵羊红绵羊红细胞细胞溶血素溶血素如溶血则如溶血则为阴性为阴性如不溶血如不溶血则为阳性则为阳性指示系统指示系统反应结果的判定反应结果的判定血清学试验血清学试验中和试验中和试验u概念：概念：根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验。学试验。u原理：原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易感病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易感动物、鸡胚或细胞活性。动物、鸡胚或细胞活性。u举例举例 IBDVIBDV 9 911d11d鸡鸡胚胚 242448h 48h 鸡鸡胚死亡胚死亡 IBDVIBDV +抗血清抗血清 9 911d11d鸡鸡胚胚 鸡鸡胚不死亡胚不死亡 血清学试验免疫标记技术免疫标记技术u抗原与抗体结合了，但复合物小，不能通过凝集或沉淀用肉眼观察到。该该怎么怎么办办？u将抗体或抗原联结在一个特定的易于检测的物质上，通过检测特定物质的存在，间接反映抗原抗体发生了结合。血清学试验荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术u原理：将荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合后，用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。u荧光素：荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。最常用的是异硫氰酸荧光素(FITC)。血清学试验荧光抗体染色荧光抗体染色F染色方法染色方法 抗补体法抗补体法 直接法直接法 间接法间接法抗抗原原抗体抗体荧光素荧光素抗抗体抗抗体抗抗补补体体抗抗体体血清学试验酶标抗体技术酶标抗体技术u原理：将酶分子标记在抗体或抗原分子上，利用抗原抗体反应的特异性及酶的高催化活性进行检测。u用于标记的酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。u 血清学试验F免疫酶组织化学染色技术 F酶联免疫吸附试验 F斑点-酶联免疫吸附试验酶标抗体技术分类酶标抗体技术分类血清学试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验u试验方法试验方法 F间接法：用于测定抗体 F夹心法：用于测定大分子抗原 F双夹心法：用于测定大分子抗原u原理原理 F通过化学方法将酶与抗体结合通过化学方法将酶与抗体结合起来。酶标记后的抗体仍然保起来。酶标记后的抗体仍然保持着能与相应抗原结合的免疫持着能与相应抗原结合的免疫学活性及酶的催化活性。酶标学活性及酶的催化活性。酶标抗体与抗原结合后，形成酶标抗体与抗原结合后，形成酶标抗体抗体-抗原复合物。复合物上的抗原复合物。复合物上的酶，在遇到相应的底物时，催酶，在遇到相应的底物时，催化底物分解，使底物中的供氧化底物分解，使底物中的供氧体由无色的还原型变成有色的体由无色的还原型变成有色的氧化型，呈现颜色反应，氧化型，呈现颜色反应，用肉用肉眼或酶标仪判定结果。眼或酶标仪判定结果。血清学试验u目前已广泛于应用多种细菌病和病毒病的诊断和检测。如猪传染性胃肠炎、鸡新城疫、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病、蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等传染病的诊断和抗体监测常用此技术。酶联免疫吸附试验应用酶联免疫吸附试验应用血清学试验v方法：v1.样本稀释v2.加样v3.温育v4.洗涤v5.加酶标二抗v6.温育v7.洗涤v8.加底物v9.避光显色v10.终止反应v11.结果测定血清学试验