蛋白质组学总结课件

基因组的局限性基因组的局限性全方位蛋白质研究的迫切要求全方位蛋白质研究的迫切要求医药研究开发的巨大需求医药研究开发的巨大需求 高通量分离、鉴定技术的出现高通量分离、鉴定技术的出现计算机信息科学的有力支持计算机信息科学的有力支持蛋白质组学蛋白质组学蛋白质组学诞生的背景蛋白质组学诞生的背景功能基因组与蛋白质组1编辑版ppt4 蛋白质组的基本知识蛋白质组的基本知识1、概念、概念 蛋白质组（蛋白质组（proteome）：）：一种基因组所能表达的全套蛋白质；一种基因组所能表达的全套蛋白质；一种生物中不同细胞的不同蛋白质的组合；一种生物中不同细胞的不同蛋白质的组合；一一个个细细胞胞内内的的全全套套蛋蛋白白质质，反反映映特特殊殊阶阶段段、环环境境、状状态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。2编辑版ppt2、技术路线与相关技术、技术路线与相关技术技术路线技术路线蛋白提取蛋白提取样品样品蛋白混合物蛋白混合物双向电泳双向电泳蛋白图谱蛋白图谱肽段肽段酶切消化酶切消化质谱分析质谱分析质谱数据质谱数据数据库检索数据库检索酶切消化酶切消化肽段混合物肽段混合物双向电泳双向电泳数据库数据库3编辑版ppt第二章第二章 蛋白质组研究方法蛋白质组研究方法 蛋白质组的技术基础蛋白质组的技术基础（三大支撑技术）：（三大支撑技术）：双向电泳双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。），可以分离数千种蛋白质。生物质谱技术生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。，精确测定多肽质量及序列。计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。除上述基本的蛋白质组研究技术外，新技术：除上述基本的蛋白质组研究技术外，新技术：多维色谱与质谱联用：大规模蛋白质分离与鉴定多维色谱与质谱联用：大规模蛋白质分离与鉴定 同同位位素素编编码码亲亲和和序序列列标标签签技技术术（ICAT）：简简化化样样本本、定量。定量。酵酵母母双双杂杂交交技技术术和和免免疫疫共共沉沉淀淀（CoIP）：蛋蛋白白质质间间相相互作用互作用4编辑版ppt2 大规模的蛋白质提取、分离技术大规模的蛋白质提取、分离技术 弥补以弥补以2-DE/MS 为基础的蛋白质组技术方法的不足。为基础的蛋白质组技术方法的不足。1、二维色谱、二维色谱串联质谱技术（串联质谱技术（2D-HPLC-MS-MS）主主要要特特点点：快快速速（1-2小小时时）；易易于于和和质质谱谱连连用用（液液相相系系统统，避避免免胶胶上上回回收收）；适适用用于于各各种种蛋蛋白白质质的的分分离离（疏疏水水性性蛋蛋白白、偏酸偏减性蛋白、过大过小的蛋白）。偏酸偏减性蛋白、过大过小的蛋白）。二二维维色色谱谱有有多多种种组组合合模模式式：第第一一维维常常用用离离子子交交换换色色谱谱或凝胶过滤色谱。第二维常用反相色谱。或凝胶过滤色谱。第二维常用反相色谱。二、色谱质谱技术5编辑版ppt2、同位素、同位素亲和标记亲和标记质谱技术（质谱技术（ICAT）细细胞胞中中蛋蛋白白质质数数目目巨巨大大，酶酶切切后后的的多多肽肽混混合合物物十十分分复复杂杂，现现有有的的2-DE和和2D-HPLC都都难难以以完完全全分分离离。1999年年Gygi 等等人人发发明明同同位位素素亲亲和和标标签签技技术术（Isotope Coded Affinity Tags，ICAT），可可以以简简化化样样本本，并并有有定定量量作作用用。ICAT试试剂由三部分组成：剂由三部分组成：活性基团活性基团，能特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基；，能特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基；连接子连接子，用于结合稳定的同位素；，用于结合稳定的同位素；生生物物素素，作作为为亲亲和和标标签签，能能与与卵卵白白素素结结合合，用用于于选选择择分分离标记的多肽。（卵白素可结合在固相支持介质。）离标记的多肽。（卵白素可结合在固相支持介质。）6编辑版pptICAT试剂由三部分组成：X代表代表8个氢或者氘原子个氢或者氘原子与蛋白中与蛋白中Cys的的-SH连接连接用于被标记多肽的亲和纯化用于被标记多肽的亲和纯化生物素连接部分（重链或轻链）巯基特异反应基团7编辑版ppt 首先，对蛋白质进行标记。首先，对蛋白质进行标记。接下来，蛋白酶切接下来，蛋白酶切 形成多肽混合物。形成多肽混合物。然然后后再再使使用用亲亲和和色色谱谱分分离离只只有有标标记记肽肽段段被被保保留留（先先洗洗脱脱下下未未标标记记肽肽段段，再再改改变变洗洗脱脱条条件件，洗洗脱脱下下别别标标记记肽段）。这样，肽段）。这样，使样品变得简单。使样品变得简单。比比较较标标记记了了重重链链和和轻轻链链的的肽肽段段在在质质谱谱图图中中的的信信号号强强度度，这样，这样，可以实现对差异蛋白质的定量分析。可以实现对差异蛋白质的定量分析。8编辑版pptC-ICATC-ICATC-ICATC-ICATC-ICATC-ICAT亲和分离亲和分离-ICATC酶切酶切质谱分析-ICATC9编辑版ppt1 细胞裂解的方法 一、温和的裂解方法一、温和的裂解方法 用于比较简单的样品：用于比较简单的样品：组织培养的细胞，血细胞、微生物或细胞器。组织培养的细胞，血细胞、微生物或细胞器。1）渗透裂解：低渗溶液悬浮细胞。）渗透裂解：低渗溶液悬浮细胞。2）冻冻融融裂裂解解：用用液液氮氮迅迅速速冷冷冻冻细细胞胞(1-2 min)，随随后后在在37 融化融化(1-2 min)，反复几次。，反复几次。第三章第三章 双向电泳的蛋白质双向电泳的蛋白质提取与样品制备提取与样品制备10编辑版ppt3）去去污污剂剂裂裂解解：主主要要用用于于组组织织细细胞胞。含含有有去去污污剂剂的的缓缓冲冲液液重悬细胞。重悬细胞。4）酶酶裂裂解解法法：裂裂解解植植物物、真真菌菌和和细细菌菌等等有有细细胞胞壁壁的的细细胞胞。等渗缓冲液含有某种酶：等渗缓冲液含有某种酶：溶菌酶（溶菌酶（lysozyme）细菌细菌 纤纤维维素素酶酶（cellulase）和和果果胶胶酶酶（pectinase）植植物细胞物细胞 溶细胞酶溶细胞酶(lyticase)酵母细胞酵母细胞 上述方法有时可以联合运用，裂解效果更好。上述方法有时可以联合运用，裂解效果更好。11编辑版ppt二、剧烈的裂解方法二、剧烈的裂解方法 用用于于难难以以破破碎碎的的细细胞胞，如如固固体体组组织织内内的的细细胞胞，或或具具有有坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。1）超声裂解法。）超声裂解法。2）弗氏压碎法。）弗氏压碎法。3）研磨法。）研磨法。4）机械匀浆法。）机械匀浆法。5）玻璃珠匀浆法。）玻璃珠匀浆法。12编辑版ppt三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。如有可能，可加入强变性剂：如有可能，可加入强变性剂：8 mol/L 尿素、尿素、10%TCA 或或 2%SDS。但但在在上上述述条条件件时时，仍仍有有些些蛋蛋白白酶酶保保持持一一定定活活性性，所所以以需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。13编辑版ppt分离策略：分离策略：沉沉淀淀蛋蛋白白质质，使使之之与与其其它它成成份份分分开开，再再重重悬悬溶溶解解蛋蛋白白质。质。附带作用：附带作用：浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。注意：注意：某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。四、通过沉淀分离蛋白四、通过沉淀分离蛋白14编辑版ppt1）硫酸铵沉淀（盐析）。）硫酸铵沉淀（盐析）。2）TCA沉淀（三氯乙酸沉淀）。沉淀（三氯乙酸沉淀）。3）丙酮沉淀）丙酮沉淀。4）在冰丙酮中用）在冰丙酮中用TCA沉淀。沉淀。5）苯酚提取，然后在甲醇中用醋酸铵沉淀。）苯酚提取，然后在甲醇中用醋酸铵沉淀。沉淀方法沉淀方法 15编辑版ppt五、清除影响二维电泳图谱的杂质五、清除影响二维电泳图谱的杂质一方面，沉淀分离蛋白，另一方面除去杂质：一方面，沉淀分离蛋白，另一方面除去杂质：1）盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子。）盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子。2）内源性小分子。）内源性小分子。3）离离子子去去污污剂剂。裂裂解解液液中中的的SDS会会影影响响第第一一向向电电泳泳，需需以以含含有有兼兼性性离离子子去去污污剂剂、非非离离子子去去污污剂剂的的裂裂解解液液（或或重重泡泡涨涨液液）将将SDS稀稀释释至至终终浓浓度度低低于于 0.25%，或或其其它它去去污污剂剂与与SDS的比率为的比率为8:1。亦可用丙酮沉淀方法去除。亦可用丙酮沉淀方法去除SDS。4）核酸（）核酸（DNA,RNA）使用使用DNase和和RNase A混合处理样品。混合处理样品。16编辑版ppt2 蛋白质的分步提取技术 硫硫脲脲、sulfobetaine和和 TBP 可可极极大大提提高高样样品品的的溶溶解解度度，联联合合运运用用硫硫脲脲、表表面面活活性性剂剂SB3-10和和TBP，可可构构成成高高效效 IEF裂解液，溶解传统方法难以溶解的蛋白。裂解液，溶解传统方法难以溶解的蛋白。1998年年，Molloy把把分分步步提提取取法法和和高高效效裂裂解解缓缓冲冲液液联联合合起来，得到高分辨率的起来，得到高分辨率的2-DE图谱。图谱。17编辑版ppt具体步骤：具体步骤：第一步第一步以水溶液提取（只溶解偏亲水性蛋白）。以水溶液提取（只溶解偏亲水性蛋白）。第第二二步步以以含含Urea/CHAPS/DTT的的溶溶液液提提取取（传传统统裂裂解解，溶解亲水性、中性和疏水性蛋白）。溶解亲水性、中性和疏水性蛋白）。第第三三步步以以含含硫硫脲脲/SB3-10/TBP 的的溶溶液液提提取取（主主要要溶溶解解疏水性蛋白）。疏水性蛋白）。有有实实验验表表明明，11个个大大肠肠杆杆菌菌的的膜膜蛋蛋白白在在第第三三步步提提取取出出来。来。18编辑版ppt第四章第四章双向电泳与蛋白质分离双向电泳与蛋白质分离利用了蛋白的两个特性对其进行分离。利用了蛋白的两个特性对其进行分离。第一向第一向等点聚焦电泳等点聚焦电泳利用蛋白的等点电进行分离利用蛋白的等点电进行分离第二向第二向SDSPAGE 利用蛋白的相对分子量分离利用蛋白的相对分子量分离原理19编辑版ppt1 等点聚焦电泳原理 构构成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸是是两两性性电电解解质质，决决定定了了蛋蛋白白质质的的在一定的在一定的pH 条件下带有电荷。条件下带有电荷。在低在低pH条件下，蛋白质所带电荷为正；条件下，蛋白质所带电荷为正；在高在高pH条件下，蛋白质所带电荷为负。条件下，蛋白质所带电荷为负。在在某某一一pH条条件件下下，蛋蛋白白质质所所带带净净电电荷荷为为零零时时；则则此此pH为该蛋白的等电点为该蛋白的等电点(pI)。蛋蛋白白质质的的等等电电点点取取决决于于蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸组组成成，是是蛋蛋白白质质的的一个物理化学常数，可以据此特性分离蛋白质。一个物理化学常数，可以据此特性分离蛋白质。20编辑版ppt+pH7.0+pH 7.0pH 9.0pH 4.0 pH 9.0pH 4.0实现聚焦实现聚焦 据据此此，设设计计含含有有pH梯梯度度的的凝凝胶胶，在在外外加加电电场场作作用用下下，蛋白质向与它的等电点一致的蛋白质向与它的等电点一致的pH处泳动，直至聚焦于该处。处泳动，直至聚焦于该处。+pH 7.0pH 9.0pH 4.0pI大于大于pH721编辑版pptIPG胶条的平衡胶条的平衡 在在第第一一向向等等点点聚聚焦焦电电泳泳结结束束之之后后，第第二二向向电电泳泳进进行行之之前，必须对胶条进行平衡。前，必须对胶条进行平衡。平平衡衡第第一一步步的的作作用用是是让让蛋蛋白白变变性性，当当SDS单单体体浓浓度度高高于于1 mmol/L时时，与与蛋蛋白白定定量量结结合合(1g蛋蛋白白/1.4g SDS)，掩掩盖盖蛋白所带电荷，并使构象均呈蛋白所带电荷，并使构象均呈 雪茄装。雪茄装。平平衡衡的的第第二二步步是是以以碘碘乙乙酰酰胺胺 代代替替第第一一步步中中使使用用的的DTT，否则，否则DTT会影响会影响SDS-PAGE 的电泳效果。的电泳效果。22编辑版ppt2 SDSPAGE原理 在在电电场场的的作作用用下下，带带电电粒粒子子能能在在凝凝胶胶中中迁迁移移，迁迁移移速速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。SDS是是一一种种阴阴离离子子去去污污剂剂，它它能能破破坏坏蛋蛋白白质质分分子子之之间间以以及及其其它它物物质质分分子子之之间间的的非非共共价价键键，所所以以可可使使寡寡聚聚体体解解聚聚成成亚亚基基；在在强强还还原原剂剂如如巯巯基基乙乙醇醇或或二二硫硫苏苏糖糖醇醇的的作作用用下下，蛋蛋白白质质分分子子内内的的二二硫硫键键被被打打开开。这这样样，解解聚聚后后的的多多肽肽分分子子与与SDS充充分分结结合合形形成成带带负负电电荷荷的的蛋蛋白白质质-SDS复复合合物物，其其所所带带的的负负电电荷荷大大大大超超过过了了蛋蛋白白质质分分子子原原有有的的电电荷荷量量，消消除除了了不不同同蛋蛋白白质质分分子子之之间间原原有有的的电电荷荷差差异异。所所带带电电荷荷多多少少与与分分子子大小呈正比（即各种蛋白亚基的荷质比基本一致）。大小呈正比（即各种蛋白亚基的荷质比基本一致）。23编辑版ppt 再再者者，多多肽肽-SDS复复合合物物在在溶溶液液中中的的形形状状像像一一个个长长椭椭圆圆棒棒，不不同同的的蛋蛋白白质质亚亚基基-SDS复复合合物物所所形形成成的的椭椭圆圆棒棒的的短短轴轴基基本本上上相相同同，但但长长轴轴的的长长度度则则与与蛋蛋白白质质分分子子量量的的大大小小成成正正比。比。因因此此，这这种种复复合合物物在在SDS-PAGE系系统统中中的的电电泳泳迁迁移移率率不不再再受受蛋蛋白白质质原原有有电电荷荷与与构构型型的的影影响响，而而主主要要取取决决于于椭椭圆圆棒棒的的长长轴轴长长度度即即蛋蛋白白质质及及其其亚亚基基分分子子量量的的大大小小。当当蛋蛋白白质质的的分分子子量量在在15-200kD之之间间时时，电电泳泳迁迁移移率率与与分分子子量量的的对对数数呈呈线性关系。线性关系。24编辑版ppt3 胶上蛋白检测一、考马斯亮蓝染色一、考马斯亮蓝染色特特点点：简简单单、无无毒毒性性、对对比比度度好好、与与下下游游蛋蛋白白鉴鉴定定方方法法兼兼容。容。缺点缺点：检出限：检出限10 ng、修饰谷氨酸侧链，费时（、修饰谷氨酸侧链，费时（24-48h）二、银染二、银染特点特点：灵敏度：灵敏度200 pg。缺点缺点：醛类特异反应是胶上酶切后肽的回收有一定困难。：醛类特异反应是胶上酶切后肽的回收有一定困难。先银染，再加大上样量进行先银染，再加大上样量进行2-DE，考染，质谱鉴定。，考染，质谱鉴定。25编辑版ppt第五章第五章 图像分析与细胞蛋白谱的建立图像分析与细胞蛋白谱的建立 完完成成2-DE后后，凝凝胶胶图图像像要要扫扫描描保保存存，以以数数字字化化图图像像的的形式储存起来。工作步骤：形式储存起来。工作步骤：1、蛋白质点检测蛋白质点检测2、背景消减背景消减扣除背景染扣除背景染 色对蛋白丰度计算的影响。色对蛋白丰度计算的影响。3、归归一一化化处处理理使使不不同同胶胶上上同同一一蛋蛋白白质质点点准准确确地地相相对对定定量，进行比较。量，进行比较。4、蛋白质点匹配、蛋白质点匹配26编辑版ppt质谱（Mass Spectrometry,MS）特殊的天平：称量离子的质量依据不同方式将样品离子按质荷比 mz分开质量分析器离子源检测器第六章第六章 生物质谱技术与生物质谱技术与蛋白质鉴定蛋白质鉴定27编辑版ppt一、MALDI 离子源原理原理1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱28编辑版ppt特点之一：特点之一：产产生生的的离离子子多多为为单单电电荷荷离离子子 谱谱峰峰与与样样品品各各组组分分的的质质量量数数又又一一一一对对应应关关系系，所所以以 MALDI 最最适适宜宜分分析析多多肽肽及及蛋白混合物。蛋白混合物。基质为小分子有机酸及其衍生物，由于：基质为小分子有机酸及其衍生物，由于：极性化合物 溶解样品芳环 吸收激光易结晶 均匀分散样品分子 29编辑版ppt二、线形飞行时间质量检测器 MALDI离离子子源源通通常常用用飞飞行行时时间间(time of flight,TOF)检检测测器器作作为为质质量量分分析析器器，构构成成基基质质辅辅助助激激光光解解吸吸电电离离飞飞行时间质谱行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。离子源离子源+检测器检测器激光激光线形线形 MALDI-TOF 原理图原理图Uacc高真空无场飞行管高真空无场飞行管30编辑版ppt 脉脉冲冲激激光光使使样样本本离离子子化化，在在外外加加电电场场作作用用下下获获得得动动能能，进进入入高高真真空空无无电电场场飞飞行行管管道道，以以在在加加速速电电场场内内获获得得的的速速度度飞行。飞行。质质量量较较小小的的离离子子飞飞行行速速度度快快，到到达达检检测测器器早早；质质量量较较大的离子飞行速度慢，到达检测器晚。大的离子飞行速度慢，到达检测器晚。31编辑版ppt2 肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术特特定定的的质质量量，且且产产生生的的片片段段数数目目亦亦有有特特异异性性，故故称指纹谱。称指纹谱。肽肽质质量量指指纹纹谱谱(peptide mass fingerprinting,PMF)是是指指蛋蛋白白被被酶酶切切位位点点专专一一的的蛋蛋白白酶酶水水解解后后，得得到到的的肽肽片片段段质质量量图谱。由于所产生的图谱。由于所产生的肽段具有肽段具有特定序列、长度，因而具有特定序列、长度，因而具有32编辑版ppt为什么要酶切蛋白样品？为什么要酶切蛋白样品？蛋蛋白白分分子子往往往往有有许许多多的的修修饰饰位位点点，而而且且这这些些修修饰饰未未必必均一，因而，难以通过质量直接确定样品为何种蛋白。均一，因而，难以通过质量直接确定样品为何种蛋白。但但如如果果进进行行酶酶切切后后，产产生生了了多多条条肽肽段段，其其中中有有些些肽肽段段是是没没有有修修饰饰位位点点或或未未被被修修饰饰的的，其其质质量量信信息息，能能准准确确反反应应肽肽段段的的氨氨基基酸酸构构成成情情况况，在在数数据据库库中中查查找找、比比对对时时，便便可可知知这这类类肽肽段段源源于于何何种种蛋蛋白白，进进而而确确定定样样品品是是何何种种蛋蛋白白。这这是对蛋白分子进行胶上酶切的重要原因之一。是对蛋白分子进行胶上酶切的重要原因之一。此此外外，酶酶切切产产生生肽肽段段数数目目固固定定，是是肽肽质质量量指指纹纹图图谱谱的的重要信息；重要信息；18O从头标记也需要对蛋白分子进行酶切。从头标记也需要对蛋白分子进行酶切。33编辑版ppt常用酶类常用酶类要要 求：求：水解为点专一；水解为点专一；切出的肽段适合质谱分析（约几千切出的肽段适合质谱分析（约几千Da），利于检索；），利于检索；酶自身稳定，不易降解。酶自身稳定，不易降解。常用酶类：常用酶类：胰蛋白酶和胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶等。蛋白酶等。34编辑版ppt3 液相色谱电喷雾串联质谱一、电喷雾电离源的工作原理 利用高压电场使进样端的毛细管流出的液滴带电，在N2气流作用下：液滴溶剂蒸发表面积减小表面电荷密度不断增加库伦斥力与表面张力达到雷利极限液滴爆裂为带电的子液滴；这一过程不断重复，最终液滴非常细小，称喷雾状，表面电场强大，使分析物离子化，以带单电荷或多电荷离子形式进入质量分析器。35编辑版ppt36编辑版ppt电喷雾电离产生多电荷离子：可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将质谱仪的质量范围放大的n倍。37编辑版ppt多电荷离子的有关计算：对于蛋白质，产生的多电荷离子为：M+nHn+系列离子。假设某一质谱峰(m/z)1 对应的离子为M+nHn+,另一相邻质谱峰(m/z)2 对应的离子为M+(n+1)H(n+1)+,且两个峰均为同一蛋白质产生，则可通过建设联立方程组来得到M和n的具体数值:解方程组得到 M 和 n。可以编制程序将所有相关的峰进行计算并取平均值，则可得到较精确的分子量信息。这一过程称作解卷积(Deconvolution)。38编辑版ppt二、液相色谱电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)ESI后后连连接接串串联联质质谱谱，可可检检测测离离子子结结构构碎碎片片和和质质荷荷比比，提提供供离离子子结结构构（比比如如序序列列）的的信信息息，应应用用于于核核酸酸、多多肽肽及及蛋白的鉴定和翻译后修饰的分析。蛋白的鉴定和翻译后修饰的分析。串联质谱仪串联质谱仪离子源离子源多级质量分析器多级质量分析器碰撞室碰撞室一级质量分析器一级质量分析器总离子母离子碰撞室二级质量分析器二级质量分析器子离子产生产生分析核质比分析核质比母离子经高速惰性气体碰撞诱导解离，产生碎片离子/子离子39编辑版ppt三级四极杆质量分析器是怎样测定多肽序列的？三级四极杆质量分析器是怎样测定多肽序列的？由由三三个个顺顺序序连连接接的的四四极极杆杆构构成成，第第一一、三三个个四四级级杆杆分分别用于母离子和子离子选择，第二个充当碰撞室。别用于母离子和子离子选择，第二个充当碰撞室。由由电电喷喷雾雾离离子子源源生生成成的的总总离离子子经经过过第第一一个个四四极极杆杆（一一级级质质量量分分析析器器），筛筛选选出出特特定定离离子子母母离离子子进进入入后后续续检检测测；母母离离子子进进入入第第二二个个四四极极杆杆（碰碰撞撞室室），经经高高速速惰惰性性气气体体碰碰撞撞诱诱导导解解离离，产产生生碎碎片片离离子子（子子离离子子）；子子离离子子由第三个四极杆（二级质量分析器）分析其质荷比。由第三个四极杆（二级质量分析器）分析其质荷比。最最后后，根根据据母母离离子子产产生生的的各各种种子子离离子子的的质质荷荷比比计计算算出出子子离离子子的的质质量量，根根据据断断裂裂处处相相邻邻的的子子离离子子的的质质量量差差，确确定定氨基酸残基，进而推算出氨基酸序列。氨基酸残基，进而推算出氨基酸序列。40编辑版ppt小肽断裂碎片离子定义b y四四 肽肽a、b、c 型离子保留肽链型离子保留肽链 N 端，电荷留在离子端，电荷留在离子 C 端端x、y、z 型离子保留肽链型离子保留肽链 C 端，电荷留在离子端，电荷留在离子 N 端端41编辑版ppt二、18O 标记从头测序技术 肽肽段段的的断断裂裂主主要要形形成成b或或y型型离离子子，但但判判断断受受样样品品纯纯度度、溶溶液液中中盐盐分分因因素素制制约约，有有时时不不易易读读出出。同同时时为为保保证证能能够够只只读出含有肽段原始末端的读出含有肽段原始末端的y型离子，解决办法型离子，解决办法 蛋蛋白白质质在在酶酶解解时时，酶酶解解液液中中H218O和和H216O各各占占50%，这这样样酶酶解解后后肽肽段段的的羧羧基基端端上上的的羟羟基基氧氧的的18O/16O同同位位素素丰丰度度比比为为1：1，使使得得y型型离离子子系系列列的的M+2/M的的同同位位素素峰峰的的丰丰度度比比远远高高于于正正常常未未标标记记18O离离子子的的同同位位素素峰峰的的丰丰度度比比，从从而而比比较较容容易易地地分分辩辩出出y系系列列离离子子，用用这这种种方方法法可可以以较较准准确确地地读读出出10个以上的氨基酸序列。个以上的氨基酸序列。42编辑版ppt四极滤质器（Quadrupole Mass Filter）四极滤质器（四极杆）由四根平行金属杆组成，理想的四杆为双曲线，但常用的是四支圆柱形金属杆，被加速的离子束穿过对准四根极杆之间空间的准直小孔。在四极杆上加上直流电压U和射频电压V，在电场力的作用下，只有mz合适的离子才会通过稳定的振荡进入检测器。通过调节电压并保持UV比值恒定时，可以实现不同mz的检测。43编辑版ppt44编辑版ppt三、肽序列标签鉴定技术（peptide sequence tag,PST）数据库检索鉴定蛋白质时，可用读出的部分氨基酸序列结合此段序列前后的离子质量和肽段母离子质量，在数据库中查寻，这一鉴定法称为肽序列标签技术。PST检索鉴定实例：从马心肌红蛋白的胰蛋白酶酶切肽段中选取母离子进行串联质谱分析及蛋白质鉴定。N端 G-L-S-D-G-E-W-Q-Q-V-L-N-V-W-G-K C端1257.8 y10309.3 y345编辑版ppt第七章第七章 蛋白质翻译后修饰的鉴定蛋白质翻译后修饰的鉴定 蛋蛋白白质质翻翻译译后后修修饰饰与与其其活活性性有有关关，是是蛋蛋白白质质鉴鉴定定的的一一项重要内容。项重要内容。修修饰饰基基团团有有20多多种种类类型型，常常见见的的有有磷磷酸酸化化、糖糖基基化化和和乙酰化等。乙酰化等。46编辑版ppt1 磷酸化蛋白质的鉴定四、蛋白质磷酸化位点的分析四、蛋白质磷酸化位点的分析2、磷酸肽的识别、磷酸肽的识别（4）中性丢失扫描中性丢失扫描（neutral loss scan mode）第第一一个个（Q1）和和第第三三个个（Q3）四四级级杆杆同同步步扫扫描描，但但扫扫描描范范围围不不一一样样，二二者者之之间间保保持持一一个个特特定定的的电电压压差差值值，这这个个电电压压差差所所代代表表的的质质核核比比m/z值值代代表表某某一一中中性性分分子子的的质质量量。第第二二个个四四级级杆杆（Q2）为为碰碰撞撞室室，将将Q1输输送送过过来来的的离离子子碰碰撞撞诱诱导导裂裂解解，再再送送入入Q3。这这样样只只有有在在Q2中中解解离离后后丢丢失失某某一一特特定定中性分子的离子才会通过中性分子的离子才会通过Q3，到达检测器。，到达检测器。47编辑版pptQ1Q2Q3+选择选择 母离子母离子总离子总离子母离子母离子子离子子离子碰撞诱导裂解子离子中性碎片+P+P+P+P+P+P+PUQIUQ3对应的质核比对应的质核比98（离子带一个电荷时）（离子带一个电荷时）49（离子带两个电荷时）（离子带两个电荷时）选择丢失选择丢失H3PO4的子离子的子离子+P48编辑版ppt（5）前体离子扫描前体离子扫描（precursor ion scanning）又又称称母母离离子子扫扫描描（parent ion scanning），是是连连续续扫扫描描第第一一个个质质量量分分析析器器Q1，让让各各种种核核质质比比的的离离子子依依次次通通过过Q1，在在Q2诱诱导导碰碰撞撞解解离离。设设定定Q3分分析析器器的的电电压压和和频频率率，使使之之只只能能传传输输某某一一特特定定核核质质比比的的离离子子。检检测测器器在在得得到到子子离离子子信信号号时时，已已知知前前体体离离子子通通过过Q1时时的的电电压压，据据此此可可知知前前体体离离子子的的质量。质量。49编辑版pptQ1Q2Q3+母离子母离子扫描扫描总离子总离子母离子母离子子离子子离子碰撞诱导裂解子离子中性碎片+P+A+P+PO3-子离子子离子+P+A+AP50编辑版ppt3、磷酸化氨基酸位点的确定、磷酸化氨基酸位点的确定串联质谱产物离子扫描串联质谱产物离子扫描 将将选选定定的的磷磷酸酸肽肽在在CID室室打打碎碎，检检测测其其全全部部碎碎片片离离子子，根根据据碎碎片片离离子子质质量量数数推推断断肽肽段段的的序序列列和和磷磷酸酸化化位位点点。磷磷酸酸肽肽在在CID室室碰碰撞撞诱诱导导解解离离后后，易易产产生生丢丢失失80 Da（HPO3）和和98 Da（H3PO4）的的碎碎片片离离子子，这这些些离离子子形形成成的的峰峰很很高高，易分辨。易分辨。51编辑版ppt-9852编辑版ppt2 糖基化蛋白质的鉴定 糖糖基基化化蛋蛋白白简简称称糖糖蛋蛋白白，广广泛泛存存在在于于动动物物、植植物物、微微生生物和病毒中。糖蛋白在各种生命现象中发挥重要作用：物和病毒中。糖蛋白在各种生命现象中发挥重要作用：细细胞胞识识别别、信信号号转转导导、免免疫疫与与应应答答、分分化化与与反反分分化化等等均均与糖蛋白的糖链结构和功能有关。与糖蛋白的糖链结构和功能有关。真真核核细细胞胞表表达达的的糖糖蛋蛋白白药药物物，如如干干扰扰素素（IFN）和和促促红红细胞生成素细胞生成素（EPO）都需要正确的糖基化修饰。）都需要正确的糖基化修饰。53编辑版ppt（2）糖蛋白的平均分子量及糖含量测定）糖蛋白的平均分子量及糖含量测定 与普通蛋白不同，与普通蛋白不同，糖蛋白分子结构具有不均一性：糖蛋白分子结构具有不均一性：微微不不均均一一性性（不不同同的的糖糖链链连连接接与与同同一一位位点点），糖糖蛋蛋白白的微不均一性，使得分子离子峰变宽，检测灵敏度降低。的微不均一性，使得分子离子峰变宽，检测灵敏度降低。显著不均一性显著不均一性（同一蛋白质不同的氨基酸位点连接糖）。（同一蛋白质不同的氨基酸位点连接糖）。54编辑版ppt第八章第八章 蛋白质间连锁图的建立蛋白质间连锁图的建立利利用用酵酵母母双双杂杂交交建建立立基基因因组组蛋蛋白白连连锁锁图图（Genome Protein Linkage Map）众众多多的的蛋蛋白白质质之之间间在在许许多多重重要要的的生生命命活活动动中中都都是是通通过过相互作用，彼此协调来发挥作用的。相互作用，彼此协调来发挥作用的。通通过过基基因因组组的的测测序序和和序序列列分分析析发发现现了了很很多多新新的的基基因因和和EST序序列列，将将所所有有已已知知基基因因和和EST序序列列为为诱诱饵饵，在在表表达达文文库库中中筛筛选选与与诱诱饵饵相相互互作作用用的的蛋蛋白白，从从而而找找到到基基因因之之间间的的联联系系，建建立立基基因因组组蛋蛋白白连连锁锁图图。对对于于认认识识一一些些重重要要的的生生命命活活动动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。如信号传导、代谢途径等有重要意义。55编辑版ppt1 酵母双杂交 一、正向酵母双杂交 酵酵母母双双杂杂交交系系统统的的建建立立得得益益于于对对真真核核生生物物转转录录起起始始过过程的认识。程的认识。酵酵母母的的GAL4蛋蛋白白是是一一种种典典型型的的转转录录因因子子，其其DNA结结合合结结构构域域（binding domain,BD）结结合合酵酵母母半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的上上游激活位点（游激活位点（UAS）。）。而而GAL4的的转转录录激激活活结结构构域域（activation domain,AD）可可与与RNA 聚聚合合酶酶或或转转录录因因子子TFIID相相互互作作用用，提提高高RNA 聚聚合酶的活性。合酶的活性。56编辑版ppt 二二个个结结构构域域可可在在其其连连接接区区适适当当部部位位打打开开，仍仍具具有有各各自自的的功功能能，但但不不再再具具有有完完整整的的GAL4DE 特特异异激激活活能能力力，只只有有重建以后才可以。重建以后才可以。如如果果X蛋蛋白白与与BD融融合合形形成成“诱诱饵饵”（bait）蛋蛋白白、Y蛋蛋白白与与AD融融合合形形成成“猎猎物物”（prey）蛋蛋白白后后，若若能能激激活活报报告告基因的表达，就可证明基因的表达，就可证明X蛋白和蛋白和Y蛋白之间存在相互作用。蛋白之间存在相互作用。57编辑版pptGal 4-ADGal 4-BDGal 4-ADGal 4-BDX和和Y之间没有相互作用之间没有相互作用 转转 录录 水水 平平 提提 高高 报报 告告 基基 因因 报报 告告 基基 因因 Gal 4 的结合位点的结合位点 Gal 4 的结合位点的结合位点XXYYX和和Y之间具有相互作用之间具有相互作用58编辑版ppt2 免疫共沉淀技术一、免疫共沉淀技术原理 （免免疫疫共共沉沉淀淀，coimmunoprecipitation,CoIP）是是检检测测蛋蛋白白与与蛋蛋白白之之间间相相互互作作用用的的体体内内实实验验技技术术。细细胞胞裂裂解解后后在在非非变变性性条条件件下下制制备备总总蛋蛋白白提提取取物物。以以一一种种蛋蛋白白的的抗抗体体（结结合合于于固固相相亲亲和和介介质质）特特异异地地免免疫疫沉沉淀淀这这种种蛋蛋白白，然然后后用用第第二二种种蛋蛋白白或或更更多多种种蛋蛋白白的的抗抗体体做做免免疫疫印印迹迹，检检测测它它们们是是否否被第一种蛋白共沉淀。被第一种蛋白共沉淀。59编辑版ppt二、免疫共沉淀基本二、免疫共沉淀基本 步骤步骤60编辑版ppt