蛋白质双向电泳简介课件

22 七月 2024蛋白质双向电泳简介蛋白质双向电泳简介简介n双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。1975年,意大利生化学家O.Farrell发明了双向电泳技术,大大提高了蛋白质分离的分辨率而得以广泛应用,至今已经历了快四十年的发展,双向电泳技术已较为成熟,但在基本技术上仍未改变。双向电泳技术包括蛋白样品制备、干胶条水合、等电聚焦、在平衡液中平衡胶条和SDS-PAGE电泳等步骤。双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术蛋白质组学（proteomics）n概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变化的一门科学n研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最终确定它们的功能仪器设备原理n双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。nIPG干胶pH梯度是通过缓冲复合物与聚丙烯酰胺凝胶共价结合形成的,随着凝胶聚合而将pH梯度固定。即使胶条在高电压下进行较长时间的等电聚焦,仍保持稳定的pH梯度。这是高分辨分离所必需的。IPG胶灌注在塑料片上,然后盖上相同大小的塑料片,机械切割成固定大小而易操作的干胶条。第二向电泳分离的重现性有明显提高,主要是因为使用了预制的SDS-PAGE胶和灌制多板胶的设备,实现了实验系统的标准化,便于实验室内部及实验室之间数据比较和合作。要用到的试剂n样品裂解液:7mol/L尿素,4%CHAPS,10mmol/LTris,2mol/L硫脲。nIPG溶胀液:8mol/L尿素,2%CHAPS,分装成0.5ml/管,-20oC保存。使用前2.5ml IPG溶胀液加入7mg DTT,0.5%IPG缓冲液(310L),少量溴酚蓝。n平衡液:50mmol/LTris-HCl(pH8.8),6 mol/L尿素,30%甘油,2%SDS,少量溴酚蓝。使用前10ml平衡液加入0.1mgDTT。n溴酚蓝溶液:1%溴酚蓝,50mmol/LTris-HCl,分装成0.5ml/管,-20oC保存。n30%丙烯酰胺贮存液:30%丙烯酰胺,0.8%甲叉双丙烯酰胺,0.45um微孔滤膜过滤后,避光贮存于棕色瓶中4度保存。n凝胶缓冲液储存液：1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8),0.45um微孔滤膜过滤后,4度保存。nSDS电泳缓冲液:25mmol/L Tris-HCl(pH8.3),192mmol/L甘氨酸,0.1%SDS 管状胶条的制备管状胶条的制备:n去离子水2.1mln30%丙烯酰胺 0.8mln两性电解质 280uln尿素3.15g,水浴使 尿素溶解。n 20%NP-40 0.3mln10%过硫酸铵20ulnTEMED 2.5uln 摇匀后水平注入内径为 1mm 的玻璃管内,上端留有一定空间静置待凝,每次可灌68 根。nSDS-PAGE均一胶各成分用量双向电泳（2DE）示意图提取的总蛋白溶液等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离SDS-PAGE分离，使得蛋白质按分子量大小排序分子量大小通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离步骤n样品制备n胶条水合n等电聚焦n聚焦后胶条平衡n第二相SDS-PAGEn分离蛋白质的检测与匹配分析样品的制备n取材时应避免因细胞死亡而引起蛋白降解,尽可能快速将材料投入液氮中保存。研磨时,组织样品须在液氮中冷冻,充分研磨成细粉,然后快速加入含蛋白酶抑制剂的裂解液,充分混匀。对于大多数植物样品制备而言,在液氮磨碎的样品中应快速加入蛋白沉淀剂(如丙酮),并在低温下沉淀(-20oC)和离心(4oC)。n在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解性为主要目标。根据目前的实践经验,蛋白质变性成为多肽链便于多肽序列能够与其相应基因序列匹配。二次样品制备的目的是去除干扰双向电泳的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂类、多糖和核酸等)和阻止在双向电泳谱中导致假点的多肽或蛋白修饰。此外,用于样品制备的药剂必须与等电聚焦兼容。n通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质,然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型或两性去污剂以破坏疏水交互作用。样品的溶解n2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段变性剂：变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。杂质的除去n脂质脂质使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI丙酮沉淀n多糖多糖阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pHn盐盐使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮n离子去污剂离子去污剂q如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦q丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度0.25%n固体杂质固体杂质q阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 q过滤样品中核酸的去除样品中核酸的去除n对电泳的影响：对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。注意事项n双向电泳的最关键步骤之一n制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质胶条水合n首先,要选好IPG干胶条的pH梯度。对一个新样品,最先使用宽范围、线性pH 3.510梯度。但对大多数样品,这样做可能会降低pH 47区域的分辨率,因为许多蛋白质的pI值分布在该区域。利用非线性的pH 3.510 IPG干胶条在一定程度上缓解了这个问题。非线性pH 3.510的胶条在pH47区域的梯度比pH 710更为平坦,保证在大部分碱性蛋白质都能得到分辨的前提下,pH 47区域能得到更好的分离。若用pH4 7的IPG胶条则能在该范围得到更好的分离效果。等电聚焦在样品裂解液中运行。IPG干胶条使用前必须在样品溶液中水合。水合期间,蛋白样品进入IPG胶条,并分布于整个聚焦介质中,该技术实用且易操作。此外,要注意在胶条水合开始时在胶背上应覆盖矿物油,以防止胶条水合或随后的IEF过程中水分散失。IPG 胶的水合及上样胶的水合及上样2-DE 样品样品水合溶液水合溶液水合溶液：水合溶液：8M 尿素尿素2%NP-40 或或 CHAPS2%IPG缓冲液缓冲液(两亲性电解液两亲性电解液)0.28%DTT微量微量 溴酚蓝溴酚蓝IPG 胶条支架胶条支架IPG 胶条胶条 定位定位水合目的：使样品能完全以可溶形式进入水合目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内胶条内蛋白载样量蛋白载样量IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：胶条对蛋白载样量的影响因素：n待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度n样品的复杂度样品的复杂度q复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。nIPG胶条的胶条的pH范围范围q预试验确定预试验确定q先宽后窄先宽后窄q先线性后非线性先线性后非线性q先短后长先短后长等电聚焦n胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否充分的指标n根据胶条长度不同,所需的伏特小时数不同,一般随着胶条加长而增加。伏特小时数范围从7cm胶条的10 kV到24cm胶条的60 kV以上。最佳聚焦时间即IEF分离达到稳定态所需时间,是获得最好图谱质量和重复性的基础。若聚焦时间太短,会导致水平和垂直条纹。但是过度聚焦会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出(电渗),引起蛋白图谱变形,以及在胶条碱性端产生水平条纹和蛋白质的丢失。因此,最佳聚焦时间必须根据不同蛋白质样品、蛋白质上样量和所用特定pH范围及胶条长度来确定。聚焦完成后,胶条既可以在中间电压5001000 V下短时间保持,便于随时进行第二向的平衡,也可以置于-80oC冰箱中进行长期保存。第一向：等点聚焦第一向：等点聚焦1.放置电极垫放置电极垫(?)2.200 V 维持维持 1.5h3.500 V 维持维持 1.5h 4.1000 V 梯度上升梯度上升 1500vh 5.8000 V 梯度上升梯度上升 36000vh时间时间电压电压支架盖支架盖IPG 胶条胶条电极电极电极垫电极垫注意事项n通过高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦n胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持n聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度来确定。胶条平衡n在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的步骤,每步1015 min。n第一步是将IEF胶在375 mmol/L Tris-HClpH8.8缓冲液(含2%SDS、1%DTT或TBP、6mol/L尿素和30%甘油)中浸泡1015 min,尿素和甘油是用于减缓电渗效应,提高蛋白质从第一向到第二向的转移率。第二步是用5%碘乙酰胺替代还原剂DTT的375 mmol/LTris-HCl pH8.8缓冲液,其他组分及相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成羟乙酰半胱氨酸残基,以便巯基不能重组形成二硫键。此外,碘乙酰胺还可以烷基化IEF胶内的自由DTT,否则自由DTT在第二向SDS-PAGE胶迁移,会产生点条纹的假象。为减少酰氨基组的烷基化,最好在pH 89之间进行还原和烷基化。IPG 胶条的平衡胶条的平衡 n平衡液平衡液q6 M 尿素和尿素和30%甘油甘油q减少电内渗减少电内渗n第一步平衡第一步平衡q加加DTTq使变性的非烷基化蛋白处于还原状态使变性的非烷基化蛋白处于还原状态n第二步平衡第二步平衡q加碘乙酰胺加碘乙酰胺q使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化注意事项n等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳之前需进行胶条平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS充分结合，保证SDS-PAGE电泳的顺利进行n一般采用两步平衡法，用含SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT后再平衡一次第二向SDS-PAGEn若分离的蛋白质一旦被还原、烷基化和SDS饱和,将它们转移至第二向是相对简单的事情。平衡后的IPG胶可以被水平或垂直放在SDS-PAGE胶上,用0.8%低熔点琼脂糖封胶,固定IPG胶,以防电泳时滑动或漂移。在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。根据IPG胶的长度,可以制备不同长宽的SDS-PAGE胶,从微型胶大约7X8cm或13X9cm直到大胶25X20cm。各种大小的预制胶可以在一些公司买到。一般来说,胶愈大,分辨率更好,能够运载蛋白质的量也愈多。使被分离的使被分离的蛋白质与蛋白质与SDS完整结合完整结合第二向第二向:SDS-PAGE SDS 平衡平衡 SDS-PAGESDS 平衡液平衡液50 mM Tris-HCl6 M 尿素尿素30%丙三醇丙三醇2%SDS微量微量 溴酚蓝溴酚蓝SDSSDS-PAGESDS-PAGE向电泳缓冲液中加向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖的琼脂糖SDS-PAGE标记纸片标记纸片IPG 胶条胶条注意事项n使得蛋白质按照分子量的大小不同而分离，与普通SDS-PAGE相似n在双向电泳系统中无需浓缩胶，因为第一向等电聚焦已经使得蛋白得到浓缩n胶体考马斯亮蓝染色胶体考马斯亮蓝染色q灵敏度为灵敏度为30100ng，线性范围是，线性范围是20倍倍q可实现可实现PAGE的无背景染色的无背景染色q会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果n胺基黑染色胺基黑染色q转印至聚偏二氟乙烯（转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色）上的蛋白质的染色q转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色n银染银染q可减少胶内蛋白质产量可减少胶内蛋白质产量q对某些种类的蛋白质染色效果差对某些种类的蛋白质染色效果差q对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响染色方法染色方法nSDS-PAGE胶用含25%乙醇、10%冰醋酸的固定液至少固定2h。再进行敏化、银染、显色和终止,每一步骤后都要用去离子水漂洗。染色后,凝胶用Imagescanner高精度扫描仪透射扫描,分辨率采用300dpi。扫描后凝胶置凝胶保存液中保存.分离蛋白质的检测与匹配分析n胶内蛋白显示灵敏度决定于蛋白染色技术。尽管有许多专一的染色方法,但是大多数SDS-PAGE胶用考马斯亮兰或一些银染方法染色。对蛋白质组学研究工作而言,蛋白质染色方法必须与质谱兼容,因而限制了包括戊二醛处理或氧化步骤的银染方法的应用。考马斯亮兰和银染法均与质谱兼容。当配成胶体溶液时,胶体状CBB易用且对环境无害。胶体CBB实际上是一种终点染色方法,SDS-PAGE胶可以染色过夜,过染后可用水清洗。水清洗可以去除胶面上胶体染料颗粒,并且也驱使染料分子进入至胶内蛋白处。因此,水清洗增加了染色胶的信噪比。n胶体CBB是上述三种染色法中灵敏度最低的,检测限度约为每点10 ng蛋白。胶体CBB染色法可以染色多种蛋白质,并能与蛋白量呈两个最高数量级的线性关系。用胶体CBB染色的蛋白点成蓝色,且可以用可见光扫描仪捕获胶图。SYPRO Ruby是一种荧光染色法,也是一种终点染色方法,可以检测到大约1 ng的蛋白点。SYPRO Ruby与蛋白量呈三个最高数量级的线性关系。需用荧光扫描仪显示用SYPRO Ruby染色的蛋白点。银染是一种高灵敏度、非放射性的蛋白染色方法,可以检测到小于1 ng的蛋白点。但线性范围小于二个最高数量级。所有银染方法都是温度依赖的,而且需要精确控时的操作,决定何时终止染色全凭个人的经验,因此,银染是上述三种染色法中重现性最差的。n图像分析软件是高通量蛋白质组学研究的核心。目前常用的图像分析软件有PDQUEST(Bio-Rad)、MELANIE(SIB,GenBio)、Imagemaster(APB)、Advanced 2-D Software(Phoretix)和HT Ivestigator(GSI)。图像分析软件能提供综合管理各种分离和分析过程所必须的控制和分析的功能。尽管胶图能被直观检测,但是大多数蛋白点的客观定量和比较需要计算机的辅助分析。2-D PAGE分析软件确定并定量2-D凝胶上蛋白点,去除背景方式,匹配相关胶图,比较相关胶图上相应蛋白点强度,准备显示报告的凝胶数据以及输出胶图信息到数据库。图像分析软件也能指导手工或点自动切割机械手进行胶上蛋白点的切割,以作进一步的分析。n凝胶成像 将双向凝胶电泳染色后的凝胶置于凝胶成像系统中,以 Artixcan 1010 Microtek 扫描仪扫描成像,调节多个参数,得到清晰的双向凝胶电泳图谱,存储为 TIF 图像文件。应用 ImageMaster2D Elite 3.01 图像分析软件,对蛋白质组 2-DE 图谱进行图像分析硝酸银染色图谱考马斯亮蓝染色图谱 2DE图谱凝胶的图像处理分析凝胶的图像处理分析典型流程典型流程n凝胶图像的扫描凝胶图像的扫描n图像加工图像加工n斑点检测和定量斑点检测和定量n凝胶配比凝胶配比n数据分析数据分析n数据呈递和解释数据呈递和解释n2-DE数据库的建立数据库的建立2-DE 分离的可溶性 E.coli 蛋白