蛋白质化学14课件

第一章蛋白质化学第一节：概论第二节：氨基酸第三节：蛋白质一级结构及测序第四节：蛋白质空间结构第五节：蛋白质结构与功能的关系第六节：蛋白质的性质第七节：蛋白质的分离与纯化7/22/20241教学大纲了解：了解三四级结构,蛋白质的功能和分类；蛋白质的结构及其与功能的关系；掌握：蛋白质基本的组成单位氨基酸的分类、结构和性质；掌握蛋白质的一、二级结构，蛋白质的理化性质与分离纯化的方法；蛋白质测序方法蛋白质测序方法重点、难点：氨基酸的分类、结构和性质；蛋白质的理化性质、加蛋白质测序方法蛋白质测序方法 7/22/20242第一节：氨基酸第一节：氨基酸一、氨基酸的结构与分类一、氨基酸的结构与分类二、氨基酸的性质二、氨基酸的性质7/22/20243一、蛋白质的水解一、蛋白质的水解 蛋白质完全水解得到各种氨基酸的混合物，部蛋白质完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。所以，氨基酸是蛋白质的混合物。所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元基本结构单元。大多数的蛋白质都是由大多数的蛋白质都是由2020种种氨基酸组成。这氨基酸组成。这2020种氨基酸被称为种氨基酸被称为基本氨基酸基本氨基酸。思考思考7/22/202441.酸水解：（常用：（常用 6 mol/L6 mol/L的盐酸或的盐酸或4 mol/L4 mol/L的硫酸在的硫酸在105-105-110110，2020小时左右）小时左右）特点：酸水解不引起氨基酸的消旋，缺点：但Try完全被破坏，Ser和Thr部分破坏，Asn和Gln的酰胺基被水解2.碱水解：（一般用：（一般用5 mol/L5 mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-2010-20小时。）小时。）特点：碱水解使氨基酸消旋，许多氨基酸被破坏，但Try不被破坏。Arg可脱氨生成鸟氨酸及尿素。常用于测定Try含量3.酶水解：（目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶称蛋白：（目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶称蛋白酶（酶（proteinaseproteinase）已有十多种）已有十多种）特点：酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。但酶水解时间长，反应不完全。7/22/20245（一）基本结构：L氨基酸结构特点：结构特点：1.都是L-氨基酸氨基酸（除脯氨酸外）2.R侧链不同3.天然氨基酸都是天然氨基酸都是L-构型的，（与标构型的，（与标准甘油醛的构型参照得出的）。准甘油醛的构型参照得出的）。7/22/20246以分子中距离醛基或酮基以分子中距离醛基或酮基最远最远的的倒数第二个倒数第二个碳原碳原子上羟基在空间的左右上羟基在空间的左右来判别构型。来判别构型。L-葡萄糖葡萄糖 D-葡萄糖葡萄糖1 12 23 34 45 56 67/22/20247-氨基酸的通式氨基酸的通式(1)7/22/20248-氨基酸的通式氨基酸的通式(2)COO-Rgroup氨基aH=GlycineCH3=AlanineHN3+HJuang RH(2004)BCbasics7/22/20249（二）氨基酸的分类 1.常见的蛋白质(组成蛋白质)氨基酸有(20种)2.不常见蛋白质氨基酸3.非蛋白质氨基酸7/22/202410A.根据侧链的化学结构(R基）分为3大类脂肪族 15种芳香族 3种杂环氨(亚)基酸 2种7/22/202411甘氨酸甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸丙氨酸 （Ala,A）缬氨酸缬氨酸 （Val,V）亮氨酸亮氨酸 （Lue,L）异亮氨酸异亮氨酸 （Ile,I）根据侧链的化学结构分为3大类：1脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸1.1，中性脂肪族氨基酸中性脂肪族氨基酸7/22/2024121.2,含羟基或硫的脂肪族氨基酸含羟基或硫的脂肪族氨基酸丝氨酸丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸苏氨酸 （Thr,T）半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met,M）7/22/2024131.3，酸性氨基酸及酰胺酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸谷氨酸 （Glu,E）天冬酰胺天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺谷氨酰胺 （Gln,Q）7/22/2024141.4，碱性氨基酸，碱性氨基酸赖氨酸赖氨酸 （Lys,K）精氨酸精氨酸 （Arg,R）组氨酸组氨酸 （His,H）杂环杂环7/22/2024152,芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸色氨酸 （Trg,W）7/22/2024163,杂环氨基酸杂环氨基酸组氨酸组氨酸 （His,H）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）7/22/202417B.根据侧链的极性分为2大类非极性非极性R基氨基酸基氨基酸 8种种极性极性R基氨基酸基氨基酸 12种种 极性极性R基不带电荷的基不带电荷的 7种种 极性极性R基带电荷的基带电荷的 5种种7/22/202418根据侧链的极性分为2大类:1,非极性非极性R R基团氨基酸基团氨基酸7/22/202419极性不带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸7/22/202420带电荷带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸7/22/202421C.根据根据侧链（侧链（R基）酸碱性基）酸碱性分为分为3大类大类酸性氨基酸酸性氨基酸 2 种种碱性氨基酸碱性氨基酸 3种种中性氨基酸中性氨基酸 15种种7/22/202422按R基的极性及酸碱性质可以进行以下分类：非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸 （2020种）种）酸性氨基酸酸性氨基酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸碱性氨基酸碱性氨基酸赖氨酸赖氨酸组氨酸组氨酸精氨酸精氨酸中性氨基酸中性氨基酸极性氨基酸极性氨基酸非极性氨基酸非极性氨基酸丝氨酸丝氨酸苏氨酸苏氨酸半胱氨酸半胱氨酸酪氨酸酪氨酸天冬酰胺天冬酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸色氨酸色氨酸脯氨酸脯氨酸缬氨酸缬氨酸氨氨基基酸酸7/22/202423小结：二十种氨基酸的结构特点小结：二十种氨基酸的结构特点支链氨基酸：支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸含羟基的氨基酸含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸含硫的氨基酸：含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、半胱氨酸（含巯基）、甲硫氨酸（含硫甲基）甲硫氨酸（含硫甲基）含苯环的氨基酸：含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含胍基的氨基酸：含胍基的氨基酸：精氨酸精氨酸含咪唑基的氨基酸：含咪唑基的氨基酸：组氨酸组氨酸亚氨基酸：亚氨基酸：脯氨酸脯氨酸含酰胺的氨基酸：含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺天冬酰胺、谷氨酰胺含吲哚基的氨基酸：含吲哚基的氨基酸：色氨酸色氨酸含含-氨基的氨基酸：氨基的氨基酸：赖氨酸赖氨酸7/22/202424二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号据营养据营养学分类学分类 必需必需非必需非必需据据R基团化基团化学结构分类学结构分类 脂肪族脂肪族A A（中性、含羟基或硫、酸性、碱性）（中性、含羟基或硫、酸性、碱性）芳香族芳香族A(PheA(Phe、TyrTyr、Trp)Trp)杂环杂环(His(His、Pro)Pro)据据R基团基团极性分类极性分类极性极性R基团基团AA非极性非极性R基团基团AA（种）（种）不带电荷不带电荷（种）（种）带电荷：正电荷带电荷：正电荷（种）负电荷（种）（种）负电荷（种）据氨基、羧据氨基、羧基数分类基数分类一氨基一羧基一氨基一羧基一氨基二羧基一氨基二羧基(Glu(Glu、Asp)Asp)二氨基一羧基二氨基一羧基(Lys(Lys、HisHis、Arg)Arg)人的必需氨基酸人的必需氨基酸:LysTrpPheValMetLeuIleThr婴儿时期所需：Arg、His早产儿所需：Tyr、Cys7/22/202425不常见蛋白质氨基酸7/22/202426非蛋白质氨基酸7/22/2024277/22/202428二、氨基酸的性质物理性质化学性质酸碱性质7/22/202429Why?7/22/202430（一）物理性质（一）物理性质1.溶解性：溶解性：多为白色晶体，除胱氨酸和多为白色晶体，除胱氨酸和Tyr外，一般都溶于水，外，一般都溶于水，不溶或微溶于醇不溶或微溶于醇(Pro和和Pro oH能溶于乙醇或乙醚中能溶于乙醇或乙醚中)不溶不溶于丙酮，于丙酮，稀酸和稀碱中溶解性好稀酸和稀碱中溶解性好。氨基酸的熔点一般都。氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于比较高，一般都大于2002.旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性旋光性。3.光谱性质：光谱性质：含苯环氨基酸含苯环氨基酸(色氨酸色氨酸(Trp)、酪氨酸酪氨酸(Tyr)和和苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)大大键有很强的紫外吸收。键有很强的紫外吸收。Tyr:275nm;Phe:257nm;Trp280nm蛋白质的最大光吸收在蛋白质的最大光吸收在280nm7/22/202431Trp,Tyr,Phe 的的紫外吸收光谱紫外吸收光谱酪氨酸的酪氨酸的 max275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max257nm，257=2.0 x102;色氨酸的色氨酸的 max280nm，280=5.6x103;7/22/202432（二）酸碱性质（二）酸碱性质氨基酸的两性电离及等电点：氨基酸的两性电离及等电点：7/22/202433氨氨基基酸酸的的等等电电点点（isoelectric isoelectric pointpointPIPI）可可以以定定义义为为：氨氨基基酸酸所所带带正正负负电电荷荷相相等等,在在电电场场中中既既不不向向阳阳极极也也不不向向阴阴极极移动时的溶液移动时的溶液pHpH。pH=pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷为负净电荷为负7/22/202434左图是甘氨酸的电离酸碱左图是甘氨酸的电离酸碱滴定曲线，滴定曲线，第一个拐点第一个拐点:pK:pK1 1:羧基解离羧基解离50%50%的状态，的状态，第二个拐点第二个拐点:等电点等电点，第三个拐点第三个拐点pKpK2 2:氨基解离氨基解离50%50%的状态。的状态。BA7/22/202435中性氨基酸：PI中性氨基酸中性氨基酸PI=(pK1+pK2)/2BA7/22/202436酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI=(pKpK1 1+pKpK2 2)/2加电离图酸性氨基酸酸性氨基酸pI=(pKpK1 1+pKpK2 2)/27/22/202437碱性氨基酸碱性氨基酸pI=(pKpK2 2+pKpK3 3)/27/22/202438 氨基酸等电点的计算氨基酸等电点的计算 可可见见，氨氨基基酸酸的的pI值值等等于于该该氨氨基基酸酸的的两两性性离离子子状状态态两两侧侧的基团的基团(主要主要)pK值之和的二分之一。值之和的二分之一。pI=2pK1+pK2一氨基一羧基一氨基一羧基AA的等电点计算：的等电点计算：pI=2pK2+pK3二氨基一羧基二氨基一羧基AA的等电点计算：的等电点计算：pI=2pK1+pK2一氨基二羧基一氨基二羧基AA的等电点计算：的等电点计算：7/22/2024391.-氨基参加的反应2.-羧基参加的反应3.侧链参加的反应4.-氨基与-羧基共同参加的反应（三）化学性质（三）化学性质7/22/202440(1)与亚硝酸反应：与亚硝酸反应：(2)与甲醛的反应：与甲醛的反应：1.-1.-氨基参加的反应：氨基参加的反应：(3)与与2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（2,4-DNFB）的反应（）的反应（Sanger反应）：反应）：(4)与苯异硫氰酸酯（与苯异硫氰酸酯（PITC）反应（）反应（Edman反应）：反应）：(5)与丹磺酰氯（与丹磺酰氯（DNS-Cl）的反应：）的反应：(7)形成形成Schiff碱碱(6)与荧光胺反应与荧光胺反应7/22/202441(1)与亚硝酸反应：与亚硝酸反应：此法也是此法也是VanSlyke法测氨基氮的理论基础。法测氨基氮的理论基础。该反应也用来判断蛋白质的水解程度。该反应也用来判断蛋白质的水解程度。N2一半来自氨基酸一半来自氨基酸除除-NH3外，外，-NH3亦可以发生反应，但速度亦可以发生反应，但速度不如不如-NH3快快，前者，前者3-4min即可完成即可完成7/22/202442(2)与甲醛的反应：与甲醛的反应：p135（主要是因为没有合适的指示剂。封闭氨基后（主要是因为没有合适的指示剂。封闭氨基后使氨基酸的滴定范围变小，易于判断滴定终点。）使氨基酸的滴定范围变小，易于判断滴定终点。）此法可以作为氨基酸含量测定的依据此法可以作为氨基酸含量测定的依据 7/22/202443(3)与与2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯（2,4-DNFB）的反应）的反应（Sanger反应）反应）p136DNP-氨基酸为黄色，它氨基酸为黄色，它溶于乙酸乙酯；可用之溶于乙酸乙酯；可用之抽提并与标准的抽提并与标准的DNP-氨氨基酸作比较。基酸作比较。-NH3、酚羟基、酚羟基也可以有此也可以有此反应，但反应慢，且生成的反应，但反应慢，且生成的DNP-氨基酸不溶于乙酸乙氨基酸不溶于乙酸乙酯，而是保留在水相里。酯，而是保留在水相里。7/22/202444分离过程：这些衍生物是分离过程：这些衍生物是无无色色的，酸性条件下极稳定，的，酸性条件下极稳定，可溶于乙酸乙酯，经高压可溶于乙酸乙酯，经高压液相即可分析出其液相即可分析出其N端的端的氨基酸组成。氨基酸组成。(4)与苯异硫氰酸酯与苯异硫氰酸酯（PITC）反应）反应（Edman反应）：反应）：生成的肽链比原来少一个氨基生成的肽链比原来少一个氨基酸，可以进行下一轮反应，而酸，可以进行下一轮反应，而不需要彻底水解掉不需要彻底水解掉，此法是，此法是自动氨基酸分析仪的基本原理自动氨基酸分析仪的基本原理7/22/202445酸水解生成的酸水解生成的DNS氨基酸（具有氨基酸（具有荧光），用乙酸乙酯抽提，可得荧光），用乙酸乙酯抽提，可得到到DNS氨基酸，用色谱法分析氨基酸，用色谱法分析之，亦可不用分离，直接用纸电之，亦可不用分离，直接用纸电泳或薄层层析法鉴定泳或薄层层析法鉴定用用DNS(二甲基二甲基萘磺酰氯萘磺酰氯)测定测定N端氨基酸端氨基酸 原理与原理与DNFB法相同，但水解后的法相同，但水解后的DNS氨基酸不需分离，可直接用氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定，由于电泳或层析法鉴定，由于DNS有有强烈荧光，灵敏度比强烈荧光，灵敏度比DNFB法高法高100倍，比倍，比Edman法高几到十几法高几到十几倍。可用于微量氨基酸的定量，倍。可用于微量氨基酸的定量，用用Edman降解法提供逐次减少一降解法提供逐次减少一个残基的肽链，灵敏度提高，能个残基的肽链，灵敏度提高，能连续测定。多肽顺序自动分析仪，连续测定。多肽顺序自动分析仪，样品最低用量可在样品最低用量可在5pmol。(5)与丹磺酰氯（与丹磺酰氯（DNS-Cl）的反应：）的反应：Edman降解法的改进方法7/22/202446(6)与荧光胺反应与荧光胺反应1ng即可测出。激发波长：390nm，发射波长475nm 可以用荧光分光光度计进行定量检测定量检测7/22/202447(7)形成形成Schiff碱碱7/22/2024482.2.由由-羧基参加的反应：羧基参加的反应：(1)(1)与碱反应成盐与碱反应成盐 (2)(2)与醇反应成酯与醇反应成酯(3)(3)与酰化试剂反应成酰氯与酰化试剂反应成酰氯(4)(4)脱羧基生成胺脱羧基生成胺 7/22/202449（1）成盐反应）成盐反应RCHCOOH+HClNH2RCHCOOHNH2HCl（2）成酯反应）成酯反应RCHCOOH+C2H5OHNH2RCHCOOC2H5NH2HCl气7/22/202450（3）酰氯化反应）酰氯化反应YNHCRHCOOH+PCl5酰化氨基酸YNHCRHCOCl酰化氨基酰氯使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基结合，在合成肽的工作上常用。（4）脱羧反应）脱羧反应H2NCHRCOOH脱羧酶CO2+RCH2NH2胺7/22/202451试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有有此此反反应应的氨基酸的氨基酸米伦反应HgNO3Hg(NO3)2及HNO3混合物红色Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色紫色Trp坂口反应(Sakaguchi反应)-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基TyrEllman反应二硫硝基苯甲酸DTNB紫色巯基Cys3.蛋白质侧链的反应蛋白质侧链的反应OHN反应名称反应名称7/22/202452Tyr的酚基还可以与重氮化合物结合生成桔黄色化合物(Pauly反应反应)。His的咪唑基亦可发生相似的反应，生成棕红色化合物。侧链反应：侧链反应：Tyr的酚基在3，5位易发生亲电取代反应7/22/202453Arg的侧链胍基在硼酸缓冲液(pH89，2535)与1,2环已二酮反应生成缩合物，但此反应可逆Cys在体内多生成胱氨酸，形成二硫键7/22/202454胱氨酸中的二硫键在稳定蛋白质的构象上起很大的作用，氧化剂和还原剂都可以打开二硫键7/22/2024557/22/202456（2）成肽反应）成肽反应3.-氨基与氨基与-羧基共同参加的反应羧基共同参加的反应7/22/2024577/22/202458 结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End谢谢大家荣幸这一路，与你同行ItS An Honor To Walk With You All The Way演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日