质粒的提取与纯化-课件

实验一 质粒的提取(碱法)实验一质粒的提取(碱法)11.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤5.实验结果及讨论实验目的2实验目的实验目的l了解碱法提取质粒的原理；了解碱法提取质粒的原理；l掌握碱法提取质粒的方法。掌握碱法提取质粒的方法。实验目的了解碱法提取质粒的原理；3实验原理l质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。l这种方法是根据共价闭合环状质粒这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性与线性染色体染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在拓扑学上的差异来分离它们。实验原理质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价4结构的三大要素：结构的三大要素：多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位种类：种类：质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体 表达载体等结构的三大要素：5质粒的提取与纯化-课件6pBC SK mappBC SK mappBCSKmap7T-载体T-载体8在碱性条件（在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体）下，线性染色体DNA的双螺的双螺旋结构解开而变性，质粒旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构9实验仪器、材料与试剂实验仪器、材料与试剂（一）（一）仪器仪器 1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速台式离心机5.微量取液器实验仪器、材料与试剂（一）仪器10质粒的提取与纯化-课件11质粒的提取与纯化-课件12质粒的提取与纯化-课件13质粒的提取与纯化-课件14质粒的提取与纯化-课件15（二）（二）材料材料 l含pBCKS质粒的大肠杆菌DH5。l含重组质粒的大肠杆菌DH5。（二）材料含pBCKS质粒的大肠杆菌DH5。16（三）（三）试剂试剂 l1.LB液体培养基（1L）胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。lLB固体培养基（1L）在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。（三）试剂1.LB液体培养基（1L）17l2.Solution 50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)高压灭菌后，4保存备用。l3.Solution(现用现配制)0.2mol/LNaOH1%SDS2.Solution184.Solution（100 ml）5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 （pH 4.8）。5.氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存备用。4.Solution（100ml）196.胰胰RNA酶酶l将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。7.氯仿，乙醇氯仿，乙醇，70%乙醇乙醇。6.胰RNA酶20实验步骤 质粒的提取质粒的提取l1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基（含Amp0.1mg/ml）中，37振荡培养过夜。l2.将菌液倒入1.5ml Eppendorf管中，10,000rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200LSolutionI中,涡旋使充分悬浮。l3.加入300LSolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3放置5min。l4.加入300LSolutionIII,混匀（注意动作轻），冰箱3放置5min。实验步骤质粒的提取21l5.12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf管中，注意所取体积（约600L）。l6.加入等体积氯仿（约600L），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4，离心10min，取上清液。l7.上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20沉淀2030min。l8.12,000rpm离心15min。5.12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Ep22l9.去上清，沉淀加入500L70%乙醇洗涤2次（12,000rpm离心3分钟）。l10.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。l11.每管中加入25L无菌水1LRNase，37溶解质粒DNA。9.去上清，沉淀加入500L70%乙醇洗涤2次（1223lBiospin 质粒DNA小量提取试剂盒（实际用）用）ll操作过程操作过程l1.将11.5ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中。l2.于10，000rpm离心30秒，并弃去上清液。l如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。l3.加250lResuspensionBuffer，重悬细菌体沉淀。l重悬后应该没有细菌团块。Biospin质粒DNA小量提取试剂盒（实际用）24l4.加250l细胞LysisBuffer，轻柔颠倒46次。l不要剧烈振动，以防止基因组DNA被剪切。注意不要让反应持续超过5分钟。l5.加350lNeutralizationBuffer，立即轻柔颠倒离心管46次。l溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。l6.于13,000rpm离心10分钟。l如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。l7.将步骤6离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体。4.加250l细胞LysisBuffer，轻柔颠倒425l8.向Spin column 内加650lWashBuffer，于12，000g离心3060秒，并弃去接液管内液体。l9.重复第8步一次。l10.再次于12，000rpm离心1分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。l11.向Spin column 内加20lElutionBuffer、去离子水或TE溶液，并于室温静置1分钟。l可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。8.向Spincolumn内加650lWashB26l12.于12，000rpm离心1分钟，1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA。l13.提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。12.于12，000rpm离心1分钟，1.5ml离心管27实验结果及讨论实验结果及讨论 l碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。提取量较大，便于操作。l如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。实验结果及讨论碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之28